Artigo de método

Navegando nos dados proteômicos baseados em espectrometria de massa usando ferramentas computacionais gratuitas

DOI:

10.3791/68707

⸱

19 de agosto de 2025

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os dados proteômicos baseados em espectrometria de massa estão disponíveis em bancos de dados abertos e acessíveis por meio de ferramentas gratuitas. Dada a complexidade das pesquisas e descrições de bancos de dados, muitos biólogos não têm conhecimento para utilizar esses conjuntos de dados. Aqui, fornecemos um guia sobre o uso de ferramentas gratuitas para pesquisas básicas de dados proteômicos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dados proteômicos baseados em espectrometria de massa (MS), incluindo Aquisição Dependente de Dados (DDA) e Aquisição Independente de Dados (DIA), são amplamente utilizados em pesquisas biológicas. No entanto, a aplicação desses conjuntos de dados em estudos de validação ainda é limitada devido à falta de demonstrações claras sobre como pesquisar e analisar dados proteômicos de forma eficaz. Para preencher essa lacuna, selecionamos um conjunto de dados DDA e um DIA depositados no repositório de dados PRoteomics IDEntifications Database (PRIDE) para ilustrar melhor o fluxo de trabalho de análise de dados proteômicos e o pós-processamento downstream dos resultados da pesquisa de proteínas. Para fins de demonstração, usamos duas ferramentas computacionais gratuitas: FragPipe (v22.0) para conjuntos de dados DDA e DIA-NN (2.1.0) para conjuntos de dados DIA. As etapas de pós-processamento, como a geração de gráficos de vulcões e listas de proteínas desreguladas, foram demonstradas usando o código R. Este estudo fornece protocolos básicos para pesquisar e analisar dados proteômicos, servindo como um guia essencial para iniciantes para lidar efetivamente com conjuntos de dados proteômicos. Por meio deste trabalho, pretendemos capacitar os pesquisadores com o conhecimento necessário para alavancar os dados proteômicos em suas investigações biológicas.

Introdução

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O campo da proteômica foi revolucionado pela adoção generalizada de repositórios de dados de acesso aberto e ferramentas de software livre1, que têm sido fundamentais para o avanço das capacidades de pesquisa e promoção de uma cultura de compartilhamento de dados. O estabelecimento de recursos centralizados, como o PRIDE2, e o desenvolvimento de formatos de dados padronizados pela Human Proteome Organization (HUPO) Proteomics Standards Initiative (PSI)3 criaram uma oportunidade sem precedentes para reutilização e integração de dados. No entanto, a análise e interpretação de dados proteômicos ainda apresentam barreiras técnicas significativas, principalmente para biólogos e cientistas médicos que desejam realizar a validação ortogonal de seus próprios resultados experimentais4. Este manuscrito aborda diretamente esse desafio, apresentando um fluxo de trabalho computacional independente de fornecedor para fornecer uma estrutura acessível para os pesquisadores consultarem, analisarem e integrarem dados proteômicos públicos de forma independente com suas próprias descobertas, facilitando assim a validação ortogonal robusta sem a necessidade de experimentos adicionais de laboratório úmido. Este trabalho é particularmente apropriado para pesquisadores que buscam validar ortogonalmente a expressão diferencial de proteínas específicas identificadas em seus próprios experimentos e gerar novas hipóteses, explorando os padrões de expressão de suas proteínas de interesse em uma ampla gama de estudos publicados. Ao fornecer um guia passo a passo, pretendemos capacitar uma gama mais ampla de cientistas para aproveitar todo o potencial dos dados proteômicos públicos, aumentando a robustez e o impacto de suas pesquisas.

Na proteômica baseada em espectrometria de massa (MS), as varreduras MS1 e MS2 são fundamentais para a aquisição de dados. As varreduras MS1, ou varreduras de pesquisa, detectam e medem as proporções massa-carga (m / z) de todos os íons em uma amostra, fornecendo uma visão abrangente da população de íons5. As varreduras MS2, também chamadas de varreduras de fragmentação, envolvem o isolamento e a fragmentação de íons precursores específicos escolhidos na varredura MS1, gerando espectros de íons de fragmento para identificação de peptídeos6.

A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona os íons mais abundantes das varreduras MS1 para fragmentação MS2, produzindo espectros mais simples que agilizam a análise. No entanto, a DDA pode levar a amostragem estocástica e valores ausentes em amostras complexas, limitando a reprodutibilidade7. Em contraste, a aquisição independente de dados (DIA) fragmenta sistematicamente todos os íons dentro de janelas m/z predefinidas, garantindo uma cobertura abrangente e minimizando os valores ausentes. Isso aumenta a precisão quantitativa e a reprodutibilidade8, embora o DIA exija ferramentas computacionais avançadas para deconvolver seus espectros MS2 altamente complexos9.

O PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride)2é um repositório líder dentro do ProteomeXchange Consortium (https://www.proteomexchange.org)10, uma plataforma global para compartilhamento de dados proteômicos. Os usuários podem navegar com eficiência por esse vasto recurso usando pesquisas de palavras-chave para localizar conjuntos de dados de interesse.

O DIA-NN11, um pacote de software que utiliza redes neurais profundas, é uma ferramenta padrão-ouro para analisar dados proteômicos de aquisição independente de dados (DIA). Ele se destaca na precisão de identificação e quantificação, tornando-o particularmente eficaz para o processamento de conjuntos de dados DIA complexos12. Para fluxos de trabalho de aquisição dependente de dados (DDA), o MSFragger13, integrado ao pipeline do FragPipe, oferece identificação ultrarrápida de peptídeos. Sua abordagem inovadora de indexação de íons de fragmentos permite uma rápida correspondência espectral, superando as ferramentas tradicionais em mais de 100 vezes em velocidade.

Equipados com esses bancos de dados abrangentes e ferramentas avançadas, os pesquisadores podem reutilizar prontamente os dados proteômicos para validação entre estudos e novas descobertas biológicas. Essa acessibilidade impulsionou a identificação de vários biomarcadores de proteínas em diversas doenças14,15, melhorou a previsão do prognóstico16 e permitiu a classificação de subtipos moleculares com base em perfis proteômicos17.

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Protocolo

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NOTA: Consulte a Figura 1para obter uma visão geral do fluxo de trabalho e a Tabela de materiais para obter descrições detalhadas do software usado.

figure-protocol-1
Figura 1: Visão geral do desenho do estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Exemplo de arquivo e configuração de software

NOTA: Todos os aplicativos são gratuitos para uso individual em pesquisa e podem ser executados em um computador pessoal (Windows e Linux são suportados).

  1. Crie um novo diretório para um projeto.
  2. Baixar JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw do PRIDE.
    NOTA: Os dois grupos de arquivos podem ser baixados do https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 e https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 separadamente (Figura 2).
  3. Baixe e instale as ferramentas de software necessárias.
    1. Baixe a versão mais recente do DIA-NN como um arquivo .msi. O DIA-NN está disponível gratuitamente como um arquivo .msi para Windows ou .zip arquivo para Linux a partir do https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
    2. Baixe a versão mais recente do MSFileReader como um arquivo .exe. O MSFileReader está disponível gratuitamente como um arquivo .exe do https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, que é necessário para processar dados brutos formatados do Thermo Fisher DIA.
    3. Baixe a versão mais recente do SDK do .NET como um arquivo .exe. O SDK do .NET está disponível gratuitamente como um arquivo .exe do https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, que é necessário no Windows para executar o MSFileReader.
    4. Baixe a versão mais recente do FragPipe como um arquivo .zip. O FragPipe está disponível gratuitamente como um arquivo .zip do https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. O arquivo zip com jre é recomendado, pois contém um Java runtime para Windows, que é necessário para executar o FragPipe. O MSFragger é incorporado ao FragPipe.
  4. Baixe a versão mais recente dos arquivos de script R e Rstudio e R do Arquivo Suplementar 1 e do Arquivo Suplementar 2. R e RStudio podem ser baixados gratuitamente do https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe e https://posit.co/download/rstudio-desktop/.
  5. Descompacte os arquivos compactados e clique no ícone . exe ou .msi Arquivos para instalar os aplicativos.

2. Análise de dados DIA usando DIA-NN

  1. Baixe o arquivo fasta de proteoma de referência do UniProt. Para baixar o proteoma de referência do Homo sapiens (informações de isoforma não incluídas), acesse https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (Figura 3A).
  2. Clique no botão Adicionar FASTA para carregar o arquivo de proteoma de referência no DIA-NN.
  3. Selecione as duas opções FASTA digest para pesquisa sem biblioteca / geração de biblioteca e espectros baseados em aprendizado profundo, RTs e previsão de lMs na parte de geração de íons precursores. Clique no botão Executar para gerar uma biblioteca espectral prevista (Figura 3B).
    1. Depois que o arquivo de biblioteca espectral previsto for gerado, reutilize-o para outros experimentos dentro das mesmas configurações de aquisição experimental clicando no botão Espectral para adicionar a biblioteca prevista.
  4. Desmarque as duas opções na parte Geração de íons precursores e clique no botão Tipo que se correlaciona com o formato de arquivo na parte Entrada para carregar os dados DIA.
  5. Defina a Precisão de massa e a Precisão MS1 em Algoritmo como 0,0 ppm.
  6. Ajuste as configurações de intervalo de massa do precursor e do fragmento em Parte de geração de íons precursores com base nas configurações experimentais.
  7. Mantenha as outras configurações padrão.
    1. A geração de precursores do DIA-NN usa tripsina / P (cliva após K / R, a menos que seja seguido por prolina) com 1 clivagem perdida para modelar a digestão parcial; desative a excisão M de N-termo para peptídeos não canônicos (por exemplo, imunopeptidomicos
    2. Habilite explicitamente as modificações variáveis (desativadas por padrão) para estudos de modificação pós-tradução (PTM) (por exemplo, Ox (M) para oxidação, K-GG para ubiquitinação) e expanda os filtros peptídicos (comprimento: 7-30 aa; carga: 1-4+; precursor m / z: 300-1800) de acordo com as configurações experimentais (por exemplo, comprimento: 5-50 aa, carga = 1-6) para grandes PTMs ou digestão não tríptica
    3. As configurações do algoritmo aproveitam a calibração automática (precisão de massa = 0,0 ppm) para alinhamento de massa preciso - substitua por tolerâncias manuais (por exemplo, 10 ppm) para instrumentos de baixa resolução - e a correspondência entre execuções (MBR) transfere IDs entre execuções (desative para amostras heterogêneas).
    4. A pontuação da rede neural aumenta a confiança na identificação (retém, a menos que os dados sejam de baixa qualidade), enquanto a Espectrometria de Massa Quant Unlabeled (UMS) permite quantificação sem rótulos de alta precisão; mudar para a quantificação MS2 para tags isobáricas (por exemplo, TMT). Use a pesquisa sem biblioteca apenas com dados DIA de alta resolução para ignorar os requisitos da biblioteca espectral.
  8. Clique no botão Executar . Aguarde os resultados até que Concluído seja mostrado na interface de operação indicando que a execução foi concluída (Figura 3C).

3. Análise de dados DDA usando FragPipe

  1. Clique no ícone Fragpipe na pasta ~\FragPipe\fragpipe\bin após a instalação. Todas as configurações dependentes podem ser vistas na guia Config. Verifique se os três módulos (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN e Python) existem em seu computador. Caso contrário, baixe-os clicando em Download/Update ou Download (Figura 4A).
  2. Alterne para a próxima guia, Fluxo de trabalho. Selecione Padrão para o fluxo de trabalho e clique em Carregar fluxo de trabalho. Clique em Adicionar arquivos para adicionar caminhos de arquivo. Atribua o nome do experimento e o número da biorreplicação em Atribuir arquivos ou simplesmente deixe-o (Figura 4B).
  3. Agora, clique em Banco de dados e vá para essa guia. Carregue um arquivo fasta ou baixe qualquer arquivo fasta de acordo com a espécie das amostras. Durante o download, escolha Somente sequências revisadas, Adicionar iscas e Adicionar contaminantes comuns para uma execução simples (Figura 4C).
  4. Em seguida, clique em MSFragger para alterar a guia. Escolha a configuração padrão da Pesquisa fechada e clique em Carregar.
    NOTA: A pesquisa fechada é basicamente uma pesquisa pelas modificações que você definiu, enquanto a pesquisa aberta explorará todas as modificações possíveis dos dados, o que consome mais tempo e memória.
  5. Para correspondência de pico, mantenha as configurações padrão, exceto que escolher Nenhum para Calibração e otimização é recomendado, pois isso economizará tempo.
  6. Para a digestão de proteínas, ajuste os parâmetros de acordo com as condições experimentais. Mantenha as seguintes configurações padrão (Figura 5A).
    NOTA: As tolerâncias de massa do precursor e do fragmento (± 20 ppm) definem o erro de massa máximo permitido para combinar espectros experimentais com peptídeos teóricos, com valores mais rígidos recomendados para instrumentos de alta resolução. As regras enzimáticas (tripsina estrita) especificam a especificidade da clivagem (após K/R, a menos que seguida por P), com clivagens perdidas (2) permitindo peptídeos parcialmente digeridos. Os filtros de comprimento (5-50 resíduos) e massa (500-5000 Da) do peptídeo excluem candidatos improváveis. Modificações variáveis (por exemplo, +15,9949 Da na metionina para oxidação, +79,96633 Da em S/T/Y para fosforilação) permitem a detecção de alterações químicas, enquanto as combinações Max (5) limitam as modificações simultâneas por peptídeo para gerenciar o espaço de busca. Mods variáveis máximas por site (por exemplo, 3 em M) controla a frequência de modificação. O banco de dados dividido melhora a eficiência de grandes proteomas e o erro de isótopo (0/1/2) é responsável por picos isotópicos atribuídos incorretamente. Essas configurações equilibram coletivamente a sensibilidade, a especificidade e a carga computacional na identificação de peptídeos.
  7. Altere para a guia Validação. Desmarque Prever RT e Prever espectros, que é para dados DIA (Figura 5B).
  8. Clique na guia Quant (MS1). Selecione Executar quant MS1 e clique em Carregar padrões de quant. Selecione IonQuant e mantenha as configurações padrão (Figura 6A). Desative o MBR para tempos de retenção instáveis ou desative a normalização de intensidade se resultarem em vieses de dimensionamento global; habilite Manter índice no disco para conservar RAM com grandes conjuntos de dados.
    NOTA: O Quant (MS1) otimiza a quantificação sem rótulo usando MaxLPQ (MaxLFQ-based Protein Quantification, um algoritmo que estende o método MaxLFQ a grupos de proteínas), exigindo ≥1 íon exclusivo por proteína (aumente para ≥2 para maior rigor ao custo da cobertura). A correspondência entre execuções (MBR) transfere identificações entre execuções usando tolerância de tempo de retenção (RT) (padrão 0,4 min; aperte para 0,2 min para cromatografia estável ou afrouxe para variabilidade de gradiente) e tolerância de mobilidade iônica (IM) (padrão 0,05 1/k0 [mobilidade reduzida inversa]; ajuste com base na precisão IM), filtrada por ≤1% FDR (taxa de descoberta falsa; íon MBR padrão FDR=0,01; inferior a 0,005 para rigor). A inferência de proteínas usa uniquer+rascor (atribuição de peptídeos de barbear para agrupamento de proteínas). A detecção de recursos emprega tolerância de massa de 10 ppm (aumente para 20 ppm para MS de baixa resolução ou diminua para 5 ppm para alta resolução).
  9. Agora, clique na guia Executar . Selecione Diretório de saída. Clique em EXECUTAR para iniciar a análise dos dados (Figura 6B).
    NOTA: Para dados proteômicos sem marcação que não se concentram em modificações ou usam quantificação baseada em marcação, as guias PTMs, Glyco e Quant (Isobaric) não são usadas.

4. Análise a jusante de DIA-NN/FragPipe

NOTA: Os códigos detalhados usados neste estudo estão incluídos como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2. As versões de pacotes usadas neste estudo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 3.

  1. Abra o RStudio e leia os dados de expressão de proteínas gerados pelo DIA-NN ou FragPipe. Os dados da matriz do grupo de proteínas que terminam com .pg_matrix.tsv do DIA-NN e os dados combinados de proteínas que terminam com .tsv do FragPipe são normalmente usados para análise.
  2. Remova os valores ausentes sem preencher NA e filtre os grupos de proteínas identificados e quantificados com menos de dois peptídeos únicos.
    NOTA: Os números de DIA neste estudo foram gerados por grupos de proteínas filtradas, enquanto os números de DDA foram de grupos de proteínas não filtradas.
  3. Normalize as intensidades de proteína usando escala mediana ou normalização quantílica entre amostras. Os dados de DIA neste estudo foram normalizados por normalização mediana, enquanto os dados de DDA por normalização quantílica para melhor demonstrar os dois métodos.
    NOTA: A normalização mediana é robusta contra outliers e adequada para cenários em que a maioria das proteínas permanece inalterada entre as amostras, tornando a abundância mediana de proteínas um ponto de referência estável. No entanto, pode falhar em cenários com proteínas altamente expressas diferencialmente18. A normalização quantílica garante uma distribuição uniforme das abundâncias de proteínas entre as amostras, o que é útil ao comparar amostras com distribuições diferentes. Demonstrou-se que reduz o poder estatístico e pode normalizar demais os dados, potencialmente mascarando verdadeiras diferenças biológicas18. Em proteômica, a normalização mediana é amplamente utilizada em estudos sem marcação para remover vieses sistemáticos relacionados ao desempenho do instrumento MS. A normalização quantílica é preferida para conjuntos de dados em larga escala, análise de expressão diferencial e análise de cluster19,20.
  4. Calcule as alterações de log 2 vezes (por exemplo, PDAC Serum versus Normal) e os valores p do teste t. Calcular os valores-p corrigidos utilizando o método de Benjamini-Hochberg. Defina limites de significância (por exemplo, |log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0,05).
    NOTA: Os valores de p de corte utilizados nas figuras deste estudo representam valores brutos, pois o emprego de valores de p ajustados (p_adj) eliminaria todas as proteínas detectáveis dentro do poder estatístico desses conjuntos de dados limitados.
  5. Verifique a existência de valores ausentes/NA e exclua-os. Gere um gráfico de vulcão para visualizar ocorrências significativas.
  6. Selecione proteínas significativamente desreguladas. Aplique a normalização do escore Z aos valores de expressão da proteína. Plote um mapa de calor agrupado com anotações de grupo de amostra.
  7. Mapeie proteínas para IDs Entrez usando org. Hs.eg.db. Realizar enriquecimento GO (Processo Biológico) e análise da via KEGG.
    NOTA: As categorias de Processos Biológicos (BP) são comumente selecionadas na análise de Ontologia Gênica (GO) porque descrevem os processos maiores ou programas biológicos realizados por múltiplas atividades moleculares20. Esses termos se concentram em funções celulares que dão errado em doenças como o câncer, incluindo processos essenciais, como regulação do ciclo celular, processos metabólicos, etc. Além do BP, a análise GO também inclui as categorias Função Molecular (MF) e Componente Celular (CC). Os termos MF descrevem as atividades bioquímicas dos produtos gênicos, como transporte de íons ou capacidade de ligação ao DNA. Os termos CC definem os locais celulares onde os produtos gênicos desempenham suas funções, como o núcleo, a membrana mitocondrial ou o citoesqueleto.
  8. Consulte STRINGdb para interações (pontuação de confiança ≥ 400). Gere uma rede interativa usando visNetwork.

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Resultados

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Para melhor ilustrar a busca por conjuntos de dados proteômicos, selecionamos dois tipos de conjuntos de dados para esta análise. Com o objetivo de demonstrar proteínas desreguladas em contextos clínicos, pesquisamos no PRIDE usando palavras-chave como clinic. Especificamente, selecionamos um conjunto de dados adequado para análise de DIA do Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)21, e outro adequado para análise de DDA do Chinese Human Proteome Projec...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado ilustra a análise de dados proteômicos integrando ferramentas gratuitas como DIA-NN e FragPipe. O sucesso depende de etapas críticas, como a seleção precisa de íons precursores e configurações de precisão de massa para geração de biblioteca espectral em DIA-NN (etapa 2.3)27, que são dependentes do instrumento e cruciais para a identificação completa do peptídeo. Da mesma forma, a configuração meticulosa do banco de dados no FragPipe (etapa ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.Z. é o fundador do Molemuse Biotech Studio.

Agradecimentos

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Este projeto é apoiado pelo Molemuse Biotech Studio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SDK do .NET v. 9.0.203Microsofthttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN v. 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 Thermo Fisherhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

Referências

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  1. Pedrioli, P. G. A., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  2. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database at 20 years: 2025 update. Nucl Acids Res. 53 (D1), D543-D553 (2025).
  3. Deutsch, E. W., et al. Proteomics Standards Initiative at Twenty Years: Current Activities and Future Work. J Proteome Res. 22 (2), 287-301 (2023).
  4. Schubert, O. T., Röst, H. L., Collins, B. C., Rosenberger, G., Aebersold, R. Quantitative proteomics: challenges and opportunities in basic and applied research. Nat Protoc. 12 (7), 1289-1294 (2017).
  5. Wang, X., Shen, S., Rasam, S. S., Qu, J. MS1 ion current-based quantitative proteomics: A promising solution for reliable analysis of large biological cohorts. Mass Spectro Rev. 38 (6), 461-482 (2019).
  6. Vaudel, M. MS2-Based Quantitation. Proteome Inform. , 155-177 (2016).
  7. Meyer, J. G. Qualitative and Quantitative Shotgun Proteomics Data Analysis from Data-Dependent Acquisition Mass Spectrometry. Shotgun Proteomics. 2259, 297-308 (2021).
  8. Fröhlich, K., et al. Data-Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry-Based Proteomics. Mol Cell Proteomics. 23 (8), 100800(2024).
  9. Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry-Based Proteomics and Software Tools: A Glimpse in 2020. Proteomics. 20 (17-18), 1900276(2020).
  10. Deutsch, E. W., et al. The ProteomeXchange consortium at 10 years: 2023 update. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1539-D1548 (2023).
  11. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. DIA-NN:neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Meth. 17 (1), 41-44 (2020).
  12. Zhang, F., et al. A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 22 (9), 100623(2023).
  13. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nat Meth. 14 (5), 513-520 (2017).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci. 113 (8), E968-E977 (2016).
  16. Cao, L., et al. Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell. 184 (19), 5031-5052.e26 (2021).
  17. Dong, L., et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Cell. 40 (1), 70-87.e15 (2022).
  18. Dubois, E., Galindo, A. N., Dayon, L., Cominetti, O. Comparison of normalization methods in clinical research applications of mass spectrometry-based proteomics. 2020 IEEE Conf Computat Intelligence Bioinfo Computat Biol. , 1-10 (2020).
  19. Dressler, F. F., Brägelmann, J., Reischl, M., Perner, S. Normics: Proteomic Normalization by Variance and Data-Inherent Correlation Structure. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100269(2022).
  20. Dimmer, E. C., et al. The Gene Ontology - Providing a Functional Role in Proteomic Studies. Proteomics. 8 (23-24), pmic.200800002(2008).
  21. Lih, T. M., et al. Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma-Associated Proteins in Serum. Mol Cell Proteomics. 23 (1), 100687(2024).
  22. Chinese Human Proteome Project (CNHPP) Consortium. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 567 (7747), 257-261 (2019).
  23. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Matsuura, Y., Ishiguro-Watanabe, M. KEGG: biological systems database as a model of the real world. Nucl Acids Res. 53 (D1), D672-D677 (2025).
  24. Campello, E., Ilich, A., Simioni, P., Key, N. S. The relationship between pancreatic cancer and hypercoagulability: a comprehensive review on epidemiological and biological issues. Br J Cancer. 121 (5), 359-371 (2019).
  25. Fang, L., Xu, Q., Qian, J., Zhou, J. Y. Aberrant Factors of Fibrinolysis and Coagulation in Pancreatic Cancer. OncoTargets Ther. 14, 53-65 (2021).
  26. Vlodavsky, I., Elkin, M., Ilan, N. Impact of heparanase and the tumor microenvironment on cancer metastasis and angiogenesis: basic aspects and clinical applications . Rambam Maimonides Med J. 2 (1), (2011).
  27. Fröhlich, K., et al. Benchmarking of analysis strategies for data-independent acquisition proteomics using a large-scale dataset comprising inter-patient heterogeneity. Nat Comm. 13 (1), 2622(2022).
  28. Polasky, D. A., et al. MSFragger-Labile: A Flexible Method to Improve Labile PTM Analysis in Proteomics. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100538(2023).
  29. Gerault, M. A., Camoin, L., Granjeaud, S. DIAgui: a Shiny application to process the output from DIA-NN. Bioinfo Adv. 4 (1), (2024).
  30. Hsiao, Y., et al. Analysis and Visualization of Quantitative Proteomics Data Using FragPipe-Analyst. J Proteome Res. 23 (10), 4303-4315 (2024).
  31. Yu, F., Deng, Y., Nesvizhskii, A. I. MSFragger-DDA+ enhances peptide identification sensitivity with full isolation window search. Nat Comm. 16 (1), 3329(2025).
  32. Li, K., Teo, G. C., Yang, K. L., Yu, F., Nesvizhskii, A. I. diaTracer enables spectrum-centric analysis of diaPASEF proteomics data. Nat Comm. 16 (1), 95(2025).
  33. Qiao, R., Li, H., Bian, H., Xin, L., Shan, B. De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery. Biorvix. 10, (2025).
  34. Meissner, F., Geddes-McAlister, J., Mann, M., Bantscheff, M. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Disc. 21 (9), 637-654 (2022).
  35. Zheng, Y., et al. Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials. Nat Biotechnol. 42 (7), 1133-1149 (2024).
  36. Bubis, J. A., et al. Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity. Nat Meth. 22 (3), 510-519 (2025).
  37. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).
  38. Schneider, M., et al. A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis. Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).
  39. Jalili, V., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update. Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).

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