Otimizando e avaliando o desenho manual e a fiação úmida para a produção de fibra de seda de aranha recombinante

Resumo

O protocolo apresentado fornece um conjunto versátil de métodos para otimizar a solubilização de proteínas da seda recombinante para fiação; teste a capacidade de fiação por desenho à mão; produzir fibras longas e contínuas com fiação úmida automatizada; e avaliar comparativamente a morfologia, o alinhamento molecular, o comportamento mecânico e o conteúdo estrutural secundário de proteínas de ou dentro das fibras.

Resumo

As sedas de aranha são conhecidas por suas propriedades mecânicas, com alta resistência, alta extensibilidade ou uma combinação delas levando a alta tenacidade. Uma aranha fêmea típica produz sete tipos diferentes de seda, cada uma normalmente fiada a partir de proteína(s) específica(s) do tipo e mecanicamente adaptada para uma função de sobrevivência distinta. A produção de seda de aranha recombinante fornece uma rota promissora para obter esses materiais, contornando os desafios na obtenção de grandes quantidades de sedas naturais e proporcionando vantagens ao permitir a personalização de proteínas, por exemplo, por meio de mutagênese dirigida ao local ou construção de proteínas de fusão.

No protocolo apresentado, delineamos uma metodologia para avaliar a adequação da proteína para fiação por meio de abordagens de desenho manual e fiação úmida. Começando com uma proteína em pó liofilizada adequadamente purificada, são detalhados os métodos para otimizar o estado inicial da proteína solubilizada para fornecer um estado de "droga giratória" de alta concentração. Em seguida, as abordagens de desenho manual e fiação úmida são comparadas, incluindo uma discussão sobre métodos para modular o comportamento da fibra usando um desenho pós-centrifugação como parte do processo de fiação. Um fluxo de trabalho típico para caracterizar as fibras de seda resultantes e tomar uma decisão sobre quais condições de fiação têm maior probabilidade de serem frutíferas é então detalhado, incluindo microscopia óptica para avaliar o diâmetro da fibra e sua uniformidade; microscopia de luz polarizada para estimar o grau de alinhamento (supra)molecular alcançado dentro da fibra; teste de tração para avaliar resistência, extensibilidade, módulo de Young e tenacidade; e espectromicroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) para avaliar a estruturação secundária da proteína dentro da fibra.

Este protocolo provou ser adequado para várias proteínas de seda de aranha recombinante diferentes com base em domínios repetitivos e não repetitivos de seda aciniforme (embrulho); seda piriforme; e proteínas de fusão compreendendo seda aciniforme, piriforme e/ou ampulada principal (dragline). Uma aplicabilidade mais ampla é fornecida por meio de várias etapas destacadas nas quais as condições e parâmetros podem ser variados para se adequar ao comportamento de uma proteína individual e alcançar diferenças no resultado funcional.

Introdução

As aranhas produzem sedas para várias tarefas especializadas, incluindo construção de teias, captura de presas e proteção de ovos¹. As sedas de aranha exibem excelentes propriedades mecânicas que excedem as da maioria dos materiais naturais e sintéticos conhecidos², levando a esforços consideráveis para a produção de materiais de seda de aranha projetados e aprimorados para diversas aplicações industriais e biomédicas. A espidroína, a proteína que forma a seda da aranha, é composta por um domínio repetitivo relativamente grande delimitado por domínios N-terminal e C-terminal não repetitivos³, com as propriedades mecânicas únicas de alguns tipos de seda tendo sido associadas à repetição de motivos curtos dentro do domínio repetitivo ^4,5,6. Ao contrário do bicho-da-seda da amoreira cultivado comercialmente (Bombyx mori), que produz grandes quantidades de seda em um formato de casulo consistente adequado para a colheita, as aranhas são organismos inerentemente canibais e territoriais que produzem seda em quantidades limitadas, representando um desafio para a produção e coleta agrícola⁷. Dadas essas limitações, a produção de seda de aranha recombinante foi desenvolvida como uma alternativa mais viável e sustentável para obter de forma controlada quantidades suficientes de seda de aranha para aplicação.

A produção de seda de aranha recombinante requer a seleção de um hospedeiro adequado para a expressão de proteínas. A seda da aranha foi expressa em vários sistemas hospedeiros, incluindo bactérias ^8,9, leveduras ^10,11, células de insetos¹², plantas^13,14 e células de mamíferos^15,16, sendo Escherichia coli o sistema hospedeiro mais comumente usado. Os altos pesos moleculares das espidroínas, que podem atingir até 700 kDa⁷, apresentam desafios significativos para a expressão de construtos completos. Para produzir seda de aranha recombinante com propriedades comparáveis ou aprimoradas em relação às das sedas de aranha naturais, a principal estratégia empregada é a expressão de variantes truncadas, como construções com um número limitado de unidades de repetição (com ou sem domínios não repetitivos), quimeras compostas de combinações de diferentes tipos de seda e sedas híbridas fundidas com proteínas não seda. Por exemplo, a espidroína ampulada principal recombinante (284,9 kDa) foi expressa com sucesso em uma E. coli metabolicamente projetada, e a seda resultante exibiu propriedades mecânicas comparáveis às da seda ampulada maior natural⁹. Além disso, uma fibra de seda projetada composta por duas unidades repetidas de espidroína piriforme e duas unidades repetidas de espidroína aciniforme demonstrou extensibilidade superior a qualquer uma das sedas piriformes ou aciniformes constituintes, comparável à da seda flageliforme natural¹⁷.

A produção de proteínas recombinantes também permite a incorporação direta de peptídeos funcionais ou segmentos de proteínas em proteínas da seda, permitindo a fabricação de biomateriais com propriedades adaptadas a aplicações específicas. Por exemplo, a fusão genética e química de motivos de ligação celular RGD com uma seda geneticamente modificada derivada das principais espidroínas ampuladas resultou em filmes que aumentaram significativamente a adesão e proliferação de fibroblastos¹⁸. Em um estudo separado, uma construção de seda híbrida composta por um motivo de ligação ao fator de crescimento nervoso β (NGF) fundido a uma proteína quimérica composta por duas unidades repetidas de espidroína aciniforme e o domínio C-terminal de uma espidroína ampulada principal demonstrou apoiar o crescimento e a diferenciação de células semelhantes a neurônios¹⁹.

Dada a expressão e purificação bem-sucedidas de uma proteína da seda recombinante, ela pode então ser processada em várias formas, como hidrogéis, filmes, fibras, nanopartículas, espumas e esponjas, dependendo da aplicação pretendida^20,21. Para permitir a produção de fibras de seda artificial, foram desenvolvidos métodos de fiação que imitam certos aspectos do processo de fiação de fibras naturais altamente complexo e rigidamente regulamentado das aranhas. Na seda ampulada maior natural, as espidroínas são produzidas por células epiteliais na glândula ampulada maior e armazenadas em estado solúvel dentro do lúmen em altas concentrações (até 50% (p / v))²², formando uma droga giratória aquosa. À medida que o dope giratório se move através do duto giratório, ele experimenta mudanças no pH, concentração de íons, teor de água e forças de cisalhamento tanto do estreitamento do ducto quanto do processo de pultrusão da fibra, que induz a transformação de proteínas de seda líquida em fibras sólidas^23,24. A identificação de um solvente adequado que possa solubilizar ou suspender proteínas recombinantes da seda em alta concentração para formar uma fidelização é, portanto, um primeiro passo crítico no processo de fiação de fibras artificiais.

Uma ampla gama de solventes tem sido empregada para a formulação de dopes de fiação de proteína de seda, e a escolha do solvente demonstrou influenciar a formação de fibras e as propriedades mecânicas^25,26. Consequentemente, a consideração cuidadosa da seleção do solvente dope é essencial para otimizar as características da fibra resultante. Os dopes giratórios podem ser formulados usando solventes orgânicos ou aquosos, como 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP)²⁷, hexafluoroacetona (HFA)²⁸, misturas de ácido trifluoroacético (TFA) e 2,2,2-trifluoroetanol (TFE)²⁶, ácido fórmico²⁹ e fosfato de sódio/tampão Tris³⁰. Como a solubilidade da proteína é normalmente influenciada por fatores como pH, força iônica e concentração, a identificação de um solvente de dope apropriado geralmente envolve a avaliação sistemática de vários solventes, otimização do pH e concentrações de proteína e, em alguns casos, o uso de misturas de solvente e água para determinar as condições ideais de dope giratório. Além disso, a viscosidade do dope giratório é um parâmetro importante a ser avaliado antes do processo de fiação, porque uma solução dope altamente viscosa pode impedir o fluxo de fluido durante a fiação, enquanto um dope insuficientemente viscoso normalmente não será adequado para a formação de fibras^31,32. Deve-se notar que o uso de condições severas de spin dope pode alterar a estrutura da proteína após exposição prolongada; Portanto, o desenvolvimento de solventes de dopagem ecologicamente corretos continua sendo uma área ativa de pesquisa.

O desenho manual e a fiação úmida são dois métodos comuns de fiação de fibra de seda recombinante. As propriedades mecânicas das fibras produzidas usando cada método são altamente dependentes tanto das próprias condições de fiação quanto do processamento pós-centrifugação. O desenho manual, também conhecido como fiação por estiramento, é um método simples de produção de fibras no qual as fibras são retiradas de soluções de proteínas purificadas, normalmente usando uma ponta de pipeta, pinça ou pinça, seguida de secagem ao ar e caracterização 33,34,35,36,37. Embora o desenho à mão forneça uma excelente abordagem para rastrear rapidamente uma variedade de condições de formação de fibras de seda e geralmente classificar o comportamento mecânico da fibra resultante, essa técnica não é prontamente escalável para fibras contínuas longas (ou seja, com vários metros de comprimento). Como alternativa, empregamos a fiação úmida, que aplica a extrusão contínua de um dope giratório a uma velocidade constante em um banho de coagulação, normalmente um solvente aquoso ou orgânico composto de uma mistura de água e etanol ou metanol 9,15,31,38,39,40 . A imersão do dope giratório no banho de coagulação causa rápida dessolvatação de proteínas, resultando na formação de fibras contínuas²⁴. Posteriormente, as fibras são retiradas do banho de coagulação a uma velocidade constante, combinadas com a taxa de extrusão para fornecer fibras as-spun (AS) ou submetidas a um sorteio pós-centrifugação para fornecer fibras pós-fiadas (PS) que normalmente têm propriedades mecânicas melhoradas. O sorteio pós-centrifugação normalmente envolve o alongamento das fibras para uma proporção de 2 a 8 vezes seu comprimento original no ar, em um solvente ou após a imersão do solvente, com cada parâmetro contribuindo para propriedades mecânicas específicas^{15 , 17 , 31 , 38} .

Embora este protocolo se concentre nos métodos de desenho manual e fiação úmida, é importante colocar esses métodos em contexto. Métodos de eletrofiação foram relatados para sedas de aranha recombinantes de condições aquosas e orgânicas, permitindo a produção de esteiras de fibra, fibras alinhadas e fios, com fibras normalmente na escala nanométrica de diâmetro⁴¹. Isso fornece a vantagem potencial das fibras em nanoescala e o desafio correspondente se as fibras em escala de mícron forem desejadas, normalmente com a necessidade de realizar o processamento pós-rotação para induzir a transformação em estrutura de folha de β para melhorar a mecânica e a compatibilidade com a água. Fitas de seda de aranha recombinantes de vários metros de largura e espessura em escala de mícron foram obtidas por fiação a seco a partir de solvente orgânico⁴², com demonstração recente de que a incorporação de íons metálicos no estágio de dope de spin melhora a mecânica⁴³. A fiação baseada em microfluídica⁴⁴, incluindo uma combinação recente de tecnologia de impressão 3D com fieiras de microagulhas projetadas para imitar a fieira natural⁴⁵, é adequada para fiação de fibra de seda recombinante altamente controlável. Não obstante a grande variedade de métodos relatados como adequados para a produção de fibras de seda (ou semelhantes a seda), o presente protocolo detalha a produção de fibras de seda recombinante por trefilação manual e fiação úmida, pois esses métodos provaram ser traduzíveis para várias variantes diferentes de seda recombinante em nossas mãos e fornecem um ponto de partida tratável para o desenvolvimento de biomateriais e avaliação comparativa.

Após a fiação e coleta da fibra, uma combinação de técnicas ópticas, mecânicas e espectroscópicas é rotineiramente usada para caracterizar as propriedades após a fiação. Cada método fornece informações importantes sobre o processo de formação de fibras e sua correlação com o desempenho do material. Aqui, nos concentramos em um subconjunto desses métodos, observando que existem muitas outras metodologias que fornecem informações importantes sobre as propriedades e o desempenho da fibra de seda. A microscopia óptica é usada para avaliar a morfologia das fibras, permitindo a comparação dos diâmetros das fibras fiadas em condições idênticas e variadas 17,31,38,46. Essa técnica também é importante para identificar e eliminar segmentos de fibras com defeitos ou anomalias antes da caracterização subsequente. Além disso, a microscopia de luz polarizada pode ser empregada para avaliar o grau de alinhamento molecular dentro da fibra, pois níveis mais altos de alinhamento são tipicamente associados a propriedades mecânicas aprimoradas 17,26,47. A caracterização mecânica é realizada por meio de ensaios de tração, onde curvas tensão-deformação são medidas e utilizadas para quantificar parâmetros como resistência à tração, extensibilidade, módulo de Young e tenacidade, fornecendo informações essenciais para avaliar a adequação da fibra em aplicações estruturais ou biomédicas 17,33,48. A técnica final abordada aqui, a espectromicroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), é aplicada para investigar a estrutura secundária da proteína, particularmente o grau de formação da folha de β, pois isso desempenha um papel crucial na estabilidade da fibra e na resistência mecânica 17,46,49. Juntas, essas técnicas fornecem uma compreensão abrangente da morfologia, estrutura e comportamento mecânico das fibras de seda produzidas recombinantemente.

Protocolo

Neste protocolo, estamos assumindo que o ponto de partida é um pó de proteína de seda liofilizada. Isso normalmente seria uma proteína de seda de aranha recombinante em nosso trabalho. Uma visão geral do protocolo é fornecida na Figura 1, com cada uma das cinco etapas a seguir detalhadas abaixo: (1) preparação e otimização do dope giratório; (2) desenho manual de fibra de seda ou fiação úmida; (3) diâmetro das fibras e avaliação morfológica por microscopia óptica; (4) avaliação mecânica por ensaio de tração; e, (5) avaliação da estrutura secundária por espectromicroscopia FTIR.

Figura 1: Visão geral esquemática das principais etapas do protocolo para produção, coleta e caracterização de fibra de proteína de seda de aranha recombinante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação e otimização de drogas giratórias

NOTA: Para otimização da solução de dope de fiação de fibra, tente solubilizar concentrações variadas de proteína de seda de aranha recombinante em diferentes solventes para preparar soluções de dope (Tabela 1). Somente os solventes que dissolvem a proteína, dando uma solução de dopagem clara e sem precipitados, devem ser empregados para tentativas de fiação de fibras.

1. Preparação de solventes
   1. Para fazer 8:1:1 TFA/TFE/H₂O, meça 800 μL de TFA, 100 μL de TFE e 100 μL de água ultrapura tipo 1 em um tubo de vidro dentro de uma capela de exaustão. Misture bem todos os componentes. Tampe o tubo de vidro e cubra-o com parafilme para evitar a evaporação de componentes voláteis.
      NOTA: Sempre prepare uma solução nova para a fiação de fibras.
      CUIDADO: Manuseie o TFA e o TFE com cuidado, o TFA é altamente corrosivo e volátil, enquanto o TFE é inflamável e tóxico. Use EPI apropriado, incluindo luvas, jalecos e óculos de segurança, para evitar o contato com a pele e a chance de inalação.
   2. Para fazer 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, dentro de uma hotte, transfira 300 μL de TFA, 100 μL de TFE e 100 μL de água ultrapura tipo 1 para um tubo de vidro e misture os componentes. Tampe o tubo de vidro e cubra-o com parafilme para minimizar a evaporação de componentes voláteis.
      NOTA: Sempre prepare uma solução nova para a fiação de fibras.
   3. Para fazer 7:3 HFIP/H₂O, misture 700 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) com 300 μL de água ultrapura tipo 1 para fazer 1 mL de solução. Prepare a solução de novo quando necessário.
      CUIDADO: Manuseie o HFIP dentro de uma hotte e evite a inalação ou o contacto com a pele.
   4. Para fazer tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5), pegue 800 mL de água deionizada em um béquer e dissolva 1,199 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄- MW. 136. 09 g/mol) e 7,173 g de fosfato de potássio dibásico (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) nele. Misture bem todos os componentes e ajuste o pH da solução usando NaOH ou HCl. Complete o volume até 1 L com água deionizada e armazene em temperatura ambiente.
   5. Para fazer 10 mM de tampão Tris-Cl (pH 8,0), dissolva 1,21 g de Tris-cloridrato (MW. 157,60 g/mol) em 800 mL de água deionizada. Ajuste o pH usando NaOH e complete o volume final para 1 L com água deionizada. Armazene a solução em temperatura ambiente.
   6. Para fazer 20 mM de tampão acetato de Na, em 450 mL de água deionizada, dissolva 0,55 g de acetato de sódio (MW. 82,03 g/mol) e 0,02 M (6 mL) de ácido acético. Complete o volume para 500 mL com água deionizada e armazene em temperatura ambiente.
   7. Para fazer tampão fosfato de citrato 1 M (pH 7,0), dissolva 11,69 g de hidrogenofosfato dissódico (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) e 1,85 g de ácido cítrico (MW. 192,12 g/mol) em 400 mL de água deionizada. Ajuste o pH da solução usando HCl ou NaOH e ajuste o volume final para 500 mL usando água deionizada.
   8. Para fazer a solução de ácido fórmico-CaCl₂ a 98%, dilua o ácido fórmico a 98% misturando 98 mL de ácido fórmico com 2 mL de água deionizada para um total de 100 mL de solução. Agora, adicione 4 g de CaCl₂ a 100 mL de solução de ácido fórmico a 98% para preparar a solução de ácido fórmico-CaCl₂ a 4% p/v. Armazene a solução em temperatura ambiente.
      NOTA: Consulte a Tabela 1. Somente os solventes que dissolvem a proteína, dando uma solução de dopagem clara e sem precipitados, devem ser empregados para tentativas de fiação de fibras.
2. Preparação de solução de fionco de fibra
   1. Pese a proteína liofilizada da seda da aranha de acordo com a concentração desejada (por exemplo, 10 mg para uma solução a 10% (p / v) em 100 μL de solvente) e misture com o volume apropriado de solvente (por exemplo, 100 μL para uma concentração de 10% (p / v)).
   2. Vortex a mistura até que a proteína em pó esteja totalmente dissolvida no solvente.
   3. Como a solubilidade da proteína da seda da aranha varia dependendo do solvente e do tipo de proteína, comece com uma baixa concentração de proteína (10% p / v) e aumente gradualmente a concentração (25-30% p / v) conforme necessário.
   4. Após a dissolução completa da proteína, avalie qualitativamente a viscosidade da solução dopada. Se a solução dope parecer insuficientemente viscosa, aumente gradualmente a concentração de proteína até obter uma solução clara e viscosa. Use a água como padrão de referência.

Solvente	Concentração de proteína (% - p/v)	Referência
8:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2O	15 – 30	31
Tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5)	10 – 25	50
Tampão Tris-Cl 10 mM (pH 8,0)	10 – 20	34
Tampão de acetato de Na20 mM (pH 5,0)	10 – 25	49
Tampão citrato fosfato 1 M (pH 7,0)	10 – 25	51
98% de ácido fórmico – CaCl2	20 – 25	52

Tabela 1: Solventes recomendados e concentrações de proteínas para a preparação de fiandeiras de fibra.

2. Fiação e coleta de fibras

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma representação esquemática do desenho à mão e a Figura 3 para as várias configurações de dispositivos de fiação úmida detalhadas abaixo.

Figura 2: Desenho à mão de fibras de seda de aranha. (A) Uma moldura de papel em forma de C é preparada e fixada a uma lâmina de vidro com fita transparente à esquerda e fita dupla face à direita para permitir a trefilação da fibra da esquerda para a direita. (B) Uma gota de dope giratório é colocada na fita transparente e uma única fibra é desenhada à mão na fita dupla face através da abertura da estrutura em forma de C usando uma ponta de pipeta de plástico. (C) A fibra é presa à moldura de papel na lâmina de vidro usando fita adesiva nos lados esquerdo e direito. (D, E) Demonstração do processo representativo de desenho à mão (D) para uma seda de aranha recombinante efetivamente solubilizada em um dope giratório e (E) a fibra resultante antes de ser presa com fita adesiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fiação úmida de fibras de seda de aranha. Em todos os casos, o dope giratório é colocado em uma seringa hermética de vidro e extrudado a uma taxa constante usando uma bomba de seringa através de uma agulha de metal sem corte (ou seja, a fieira) em um banho de coagulação (por exemplo, etanol a 95%). (A) As fibras fiadas são coletadas no rolo 1, girando sob controle de computador a uma velocidade correspondente à taxa de extrusão. (B) O alongamento pós-rotação no ar é realizado guiando as fibras através do rolo 1 e coletando-as no rolo 2, que gira a um múltiplo da velocidade do rolo 1 (por exemplo, o dobro da velocidade para uma taxa de tração de 2x). Da mesma forma, as fibras podem ser produzidas (C) após a imersão em solvente (por exemplo, etanol a 40%, água, etc. conforme adequado para uma determinada seda) guiando as fibras do rolo 1 para o rolo 3 (imersas em um banho de solvente e girando na mesma taxa que o rolo 1) antes de guiá-las para o rolo 2 (girando a um múltiplo da velocidade dos rolos 1 e 3); ou (D) em solvente, guiando as fibras do rolo 1 para o rolo 3 (imerso em um banho de solvente e girando na mesma velocidade do rolo 1) e depois para o rolo 4 (também imerso em solvente e girando a um múltiplo da velocidade dos rolos 1 e 3) antes da coleta no rolo 2 (velocidade correspondente à do rolo 4). A configuração modular significa que várias permutações nas condições de fiação de fibra podem ser prontamente testadas, certamente não limitadas às quatro mostradas esquematicamente aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Desenho à mão
   1. Prepare uma moldura de papel em forma de C com uma janela de 1 cm x 0,5 cm (C x L) e coloque-a sobre uma lâmina de vidro (Figura 2). Prenda a parte superior da moldura de papel à lâmina de vidro usando fita adesiva. Fixe fita transparente em um braço da moldura de papel para criar uma superfície hidrofóbica para deposição de solução de dope e prenda fita dupla face no braço oposto para fixação da fibra.
   2. Deposite 10-20 μL de solução de narcótico giratório na fita transparente à temperatura ambiente (22 ± 2 °C).
   3. Mergulhe uma ponta de pipeta de plástico de 200 μL na gota de solução dope e retire-a verticalmente da solução com uma velocidade consistente (~ 6 mm / s), permitindo que as fibras sejam retiradas da solução.
   4. Guie a fibra puxada à mão pela janela da moldura e prenda-a na fita dupla-face. Seque a fibra ao ar em temperatura ambiente e, em seguida, prenda as duas extremidades das fibras com fita adicional.
   5. Concentre-se na parte da fibra que abrange a moldura de papel para posterior caracterização.
2. Fiação úmida
   1. Construa um dispositivo de rotação úmida, com o aparelho detalhado aqui tendo recursos aprimorados de controle do motor em relação às iterações anteriores^31,38.
      1. Fabrique uma placa de montagem de metal rígido que seja mantida verticalmente e usinada com uma configuração apropriada para conectar um conjunto de motores de passo (consulte a Figura 3). Cada montagem do motor requer orifícios perfurados para permitir o aparafusamento seguro dos motores de passo na parte traseira da placa de montagem (ou seja, quatro orifícios devidamente espaçados e dimensionados) e um quinto orifício para permitir a passagem do eixo do motor.
      2. Escolha motores de passo bipolares com passo de 1,8°, torque de retenção de 45 N∙cm, eixo de 24 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro com corte "D" de 15 mm de comprimento, corpo de 39 mm, corrente nominal de 1,50 A, resistência de fase de 2,3.
      3. Desenvolva um sistema para controlar a velocidade e a direção de rotação de cada motor, como o usado anteriormente para uma variedade de tipos de fibra de seda 17,53,54, que emprega uma interface gráfica do usuário (GUI) codificada em Python para um Raspberry Pi conectado a vários controladores de motor de passo, conforme detalhado em https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. Para fiar, conecte cada motor usado em uma determinada configuração de fiação a um cilindro de metal usinado (diâmetro de 6 cm, comprimento de 8 cm para os das posições 1 e 2 na Figura 3, rolos ranhurados com diâmetro de 9 cm em cada extremidade afinando para um diâmetro de 6 cm no centro do rolo, comprimento de 7 cm nas posições 3 e 4 da Figura 3; veja, por exemplo, a Figura 4 para obter a configuração de exemplo).
      5. Para a fieira (Figura 3), use uma seringa de vidro de 0,25 mL com uma agulha de metal permanentemente acoplada com uma extremidade romba (diâmetro interno de 0,127 mm) montada em uma bomba de seringa que extruda o dope giratório a uma taxa controlada em um banho de coagulação.
   2. Centrifugue a solução de dope a 20.000-21.000 × g por 30 min em temperatura ambiente e colete o sobrenadante para fiação de fibras.
      NOTA: Remova as partículas residuais para evitar o entupimento da agulha de extrusão durante a centrifugação úmida.
   3. Carregue 50-80 μL de solução de dope giratório na seringa que serve como fieira.
   4. Fixe a seringa em uma bomba de seringa e ajuste a extrusão para uma taxa de 600 μL / h.
      NOTA: Ajuste e otimize a taxa de extrusão para permitir a formação de fibras para uma determinada condição de dope de fiação de proteína.
   5. Prepare o banho de coagulação (95% de etanol / 5% de água deionizada, v / v).
   6. Posicione a bomba da seringa de forma que a agulha da seringa contendo a solução dope seja imersa no banho de coagulação.
   7. Prenda o(s) rolo(s) ao aparelho de fiação, ajuste a velocidade do rolo usando o software de controle do motor e ligue o(s) motor(es) necessário(s) para uma determinada configuração de fiação.
      NOTA: Combine a taxa de rotação do rolo 1 com a taxa de extrusão. As taxas de extrusão de 400 μL/h ou 600 μL/h correspondem a 6 rpm ou 9 rpm para o rolo 1. Se um sorteio pós-giro estiver sendo transmitido, um ou mais rolos 2-4 devem ser ajustados para girar correspondentemente mais rápido.
   8. Ligue a bomba de seringa e use uma pinça para guiar a fibra que se forma no banho de coagulação de uma das seguintes maneiras.
      1. Para coletar as fibras AS, guie a fibra formada no banho de coagulação para o primeiro rolo (velocidade igual à taxa de extrusão) para coleta.
      2. Para realizar o alongamento pós-rotação no ar, defina a taxa de rotação do rolo 2 como um múltiplo da do rolo 1. Guie a fibra da coagulação sobre o rolo 1 sem enrolar o rolo 1 e colete-a no rolo 2.
         NOTA: Uma taxa de tração pós-rotação de 2x requer que a taxa de rotação do rolo 2 seja o dobro da do rolo 1; 3x, triplo; e assim por diante.
      3. Para realizar o alongamento pós-centrifugação após a imersão em solvente, encha o banho de solvente com o solvente desejado (por exemplo, água deionizada; etanol 2:3 v/v/H₂O; etc.) e guie a fibra do banho de coagulação ao redor do rolo 1 (taxa de rotação correspondente à taxa de extrusão), ao redor do rolo 3 (taxa de rotação igual ao rolo 1) no banho de solvente, e coletar a fibra no rolo 2 no ar (girando a uma taxa mais rápida do que os rolos 1 e 3).
         NOTA: A taxa de rotação do rolo 2 em relação aos rolos 1 e 3 determinará a taxa de tração pós-centrifugação como na etapa 2.2.8.2.
      4. Para realizar o alongamento pós-centrifugação no solvente, encha o banho de solvente com o solvente desejado (por exemplo, água deionizada; etanol 2:3 v/v/H₂O; etc.) e guie a fibra do banho de coagulação ao redor do rolo 1 (taxa de rotação correspondente à taxa de extrusão), ao redor do rolo 3 (taxa de rotação igual ao rolo 1) no banho de solvente, ao redor do rolo 4 no banho de solvente (taxa de rotação um múltiplo da dos rolos 1 e 3) e colete a fibra no rolo 2 no ar (taxa de rotação correspondente ao rolo 2).
         NOTA: A taxa de rotação dos rolos 2 e 4 em relação à dos rolos 1 e 3 determinará a taxa de tração pós-centrifugação como na etapa 2.2.8.2.
         Colete fibras em condições ambientais controladas para evitar a influência da umidade e da temperatura no comportamento da fibra. Visamos uma umidade relativa ~ 28,2 ± 2,4% e temperatura ~ 28,0 ± 2,2 °C.

Figura 4: Principais etapas na fiação úmida de fibras de seda de aranha. (A) Gire a extrusão do dope no banho de coagulação seguida pela coleta da fibra (o retângulo vermelho à esquerda destaca a agulha usada para a extrusão do dope; o retângulo vermelho à direita é o caminho da fibra de seda fiada a úmido. (B) Ilustração da fibra sendo submetida a alongamento pós-centrifugação no ar (retângulo vermelho para guiar o olho). (C) Ilustração do alongamento pós-centrifugação da fibra após submersão em água (retângulo vermelho para guiar o olho). (D) Fibra de seda recombinante contínua coletada em um rolo (por exemplo, fibra enrolada na seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Avaliação microscópica óptica das fibras

1. Montagem de fibra
   1. Crie um suporte de papel em forma de C cortando um quadrado de 1 x 1 cm de um pedaço de papel retangular de 3 x 2 cm (Figura 5).
   2. Prenda o suporte em forma de C a uma lâmina de microscópio de vidro usando fita adesiva.
   3. Cole dois pedaços de fita dupla-face em cada lado do espaço de 1 cm do suporte de papel em forma de C.
   4. Remova uma fibra do rolo em que foi coletada e corte um segmento de aproximadamente 2 cm de comprimento.
      NOTA: Evite o uso de força excessiva ao manusear fibras para evitar deformação do material ou outra alteração das propriedades.
   5. Coloque o segmento de fibra na parte superior da fita dupla face, garantindo que o eixo longo da fibra esteja alinhado paralelamente à borda inferior do suporte (Figura 5).
   6. Prenda a fibra com fita adesiva em cima da fita dupla-face em ambos os lados.
   7. Prenda um pedaço adicional de fita adesiva para fixar firmemente a parte inferior do suporte de papel à lâmina de vidro para evitar o movimento da fibra até o uso.
   8. Armazene as fibras montadas em uma caixa de armazenamento de lâminas até o uso para imagens e testes de tração.
2. Determinação do diâmetro e avaliação de defeitos
   1. Examine as fibras montadas usando microscopia óptica. Primeiro, examine todo o comprimento da fibra em busca de imperfeições visíveis, como estiramento, torção, abaulamento ou fibras duplas. Se algum defeito for observado, exclua essas fibras do teste mecânico.
   2. Para fibras que parecem livres de defeitos, faça três micrografias com ampliação de 10x ao longo do eixo longo da fibra, uma no meio e outra perto de cada extremidade da fibra.
   3. Meça o diâmetro da fibra usando o software ImageJ⁵⁵ :
      1. No ImageJ, vá para o menu Analisar e selecione Definir escala (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S1). Ajuste a escala de acordo com as configurações de calibração do microscópio e ajuste a unidade de medida para micrômetros (μm) (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S2).
      2. Usando a ferramenta de linha, desenhe uma linha reta perpendicular ao eixo longo da fibra, abrangendo de uma borda da fibra à outra borda.
      3. Para cada micrografia, meça o diâmetro da fibra em seis regiões diferentes ao longo da fibra.
      4. Depois de desenhar cada linha, clique em Medir no menu Analisar para exibir o diâmetro da fibra (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S3).
3. Avaliação qualitativa do alinhamento molecular por meio de microscopia de luz polarizada
   1. Use microscopia de luz polarizada para avaliar o alinhamento molecular dentro da fibra após a avaliação do diâmetro e do defeito por microscopia óptica.
      1. Examine a fibra usando um microscópio óptico invertido equipado com uma platina giratória, um controle deslizante de analisador fixo e um polarizador giratório de 90°.
      2. Coloque a fibra a aproximadamente 45° em relação à luz polarizada no plano incidente para maximizar o brilho devido à birrefringência, aumentando a visibilidade da estrutura molecular.
      3. Tire uma imagem da fibra nessas condições para avaliar sua birrefringência.
         NOTA: A alta birrefringência sugere uma estrutura molecular bem alinhada, enquanto a baixa ou nenhuma birrefringência sugere uma estrutura mais amorfa ou orientada aleatoriamente.

Figura 5: Montagem da fibra de seda de aranha na lâmina de vidro, permitindo a análise a jusante usando suporte de papel em forma de C e uma série de camadas de fita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Teste elástico

NOTA: Um dispositivo de teste de tração adequado para avaliação precisa de fibras de seda pode ser prontamente produzido a um custo relativamente baixo^25,56. Resumidamente, fabrique um par de grampos de aço inoxidável para permitir a aderência firme de cada extremidade de cada fibra em uma estrutura em forma de C que está sendo testada (por exemplo, Figura 6). Prenda um desses grampos a um peso colocado em uma balança analítica e o outro a uma bomba de seringa. A bomba de seringa deve ser configurada para permitir a tração constante a uma taxa de deformação definida. A balança analítica deve ser conectada a um computador para coleta de dados de peso/massa registrados em função do tempo.

Figura 6: Diagrama esquemático mostrando as etapas preparatórias para testes de tração. (A) O suporte de papel com fibra (consulte a Figura 5 para configuração) é destacado da lâmina de vidro e montado verticalmente usando um clipe preso a um peso. (B) Este grampo pesado é colocado na balança analítica e a parte superior do suporte de papel é presa a um grampo preso a uma haste firmemente fixada em uma bomba de seringa. O suporte de papel é cortado horizontalmente no meio antes de iniciar o teste de tração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Aquisição de dados da curva tensão-deformação
   1. Depois de medir o diâmetro da fibra, realize o teste de tração na mesma fibra com um aparelho caseiro (Figura 6).
      1. Solte a moldura de papel em forma de C que prende a fibra da lâmina de vidro e prenda a um grampo preso a um peso (Figura 6A).
      2. Conecte a balança analítica ao software de registro/controle de dados e navegue até o Workbench (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S4).
      3. Configure o experimento no software de controle de equilíbrio clicando no botão Iniciar . Insira o nome do experimento quando solicitado (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S5).
      4. Certifique-se de que a balança analítica esteja vazia e coloque o grampo ponderado com a fibra sobre ele.
      5. Prenda a parte superior da moldura de papel a um grampo conectado à bomba de seringa e corte um lado do suporte de papel para permitir que a fibra se mova livremente (Figura 6B).
         NOTA: Certifique-se de que ambos clamps estão paralelos um ao outro e que a fibra está centralizada dentro do clamp em um comprimento de bitola de 10 mm.
      6. Tara a balança para zerar a massa do peso e clamp e pressione o botão Executar na bomba de seringa e clique em OK no software de controle da balança (Supplemental File 1 - Figura Suplementar S6).
      7. Quando a fibra se romper, pressione Parar na bomba da seringa e o botão Sim no software de controle de balança (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S7) para registrar o peso medido em função do tempo.
      8. Transfira dados para uma planilha ou outro pacote de software de processamento de dados adequado para processamento. Copie o registro de dados de peso versus tempo para a área de transferência e cole na planilha de teste mecânico fornecida (Arquivo Suplementar 2) ou exportando os dados como um arquivo de texto e importando com a análise apropriada.
2. Processamento de dados da curva tensão-deformação
   NOTA: O protocolo a seguir é baseado na planilha de teste mecânico formatada para uso no Microsoft Excel (Arquivo Suplementar 2).
   1. Certifique-se de que os parâmetros experimentais estejam corretos (coluna C).
   2. Adicione os registros em massa em função do tempo à planilha (a "Massa líquida" na coluna F). Se houver valores de massa registrados antes do início do alongamento, remova esses valores excluindo as células correspondentes com um deslocamento dos dados para cima. Se houver valores de massa registrados após a quebra da fibra, exclua essas células de dados.
   3. Preencha automaticamente os valores de índice na Coluna E adicionando incrementos de 1 para que o número total de índices corresponda ao número total de valores de massa medidos na Coluna F.
   4. Redimensionar a massa líquida de modo a que estas comecem em 0 g e aumentem durante a experiência de estiramento, subtraindo a massa líquida inicial de cada valor de massa líquida e multiplicando esta diferença por -1 (coluna G).
   5. Calcule a mudança no comprimento da fibra em cada medição multiplicando o índice de medição pela taxa de tração da bomba de seringa e o intervalo de tempo entre as medições de massa registradas (Coluna H).
   6. Calcule a deformação de engenharia dividindo a mudança no comprimento da fibra pelo comprimento original (Coluna I).
      NOTA: Este cálculo fornece a deformação de engenharia em mm/mm. Para converter os valores de deformação de engenharia em %, multiplique os valores na Coluna I por 100%.
   7. Registre a extensibilidade como o valor máximo de deformação de engenharia (célula T3).
   8. Calcule a força (em N) necessária para atingir cada mudança de comprimento registrada convertendo a massa de g para kg e multiplicando pela gravidade padrão (9,81 m/s²; Coluna J).
   9. Calcule a tensão de engenharia (em Pa) dividindo a força determinada em um determinado grau de extensão pela área da seção transversal da fibra e multiplique por ^10-6 para converter em MPa (Coluna K).
   10. Registre a tensão máxima observada como a tensão final (Célula U3) e a tensão na ruptura como o valor final da tensão registrada antes da quebra da fibra (Célula V3).
   11. Calcule a área sob a curva tensão-deformação para obter a tenacidade usando a regra trapezoidal para calcular a área sob a curva após cada medição (Coluna L). Some essas áreas para encontrar a tenacidade (Célula W3).
   12. Calcule o módulo de Young (em MPa) determinando a inclinação da região linear inicial da curva tensão-deformação usando a função PROJ.LINCH. Converta para GPa multiplicando por 10³ (Célula X3).

5. Espectromicroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)

1. Prepare uma amostra para FTIR colando uma segunda lâmina de vidro na parte inferior de uma lâmina preparada para microscopia óptica.
2. Imagem óptica e coleta espectral FTIR
   1. Encha o detector com nitrogênio líquido para resfriá-lo.
   2. Abra o software de controle do instrumento FTIR.
   3. Na janela Exibir e Coletar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8), abra a guia Coleção , defina Modo de Coleta como ATR e Detector como Resfriado (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S9).
   4. Coloque o slide no suporte do slide e coloque o suporte no palco.
   5. Defina a iluminação superior para 100 e a abertura e a iluminação inferior para 0.
   6. Focalize o centro do campo de visão para a imagem do microscópio óptico da amostra na fibra usando o joystick físico ou o joystick digital no software para controlar a posição do centro do campo de visão e o plano focal.
   7. Defina o modo de coleta como Mapear (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8).
   8. Selecione a região a ser fotografada e medida usando a Ferramenta Visualização de mapa - Área. Clique e arraste o cursor para especificar a região para a qual os espectros devem ser adquiridos na visualização da micrografia (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8). Cada círculo na imagem representa um espectro adquirido nessa posição. Se necessário, altere as bordas dessa caixa passando o cursor sobre uma determinada borda da caixa e clicando e arrastando para o local desejado. Traduza a caixa inteira clicando e arrastando dentro do retângulo. Modifique a área da caixa e o número de pontos de dados em Palco, Abertura e Exibição (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S10).
   9. Clique com o botão direito do mouse na visualização da micrografia e selecione Capturar Mosaico para salvar a imagem (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8).
   10. Defina a pressão ATR clicando no menu suspenso Perfil de pressão atual . Para fibras proteicas, use 2% de pressão (ou seja, a menor pressão ATR possível) para minimizar os danos à fibra (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8).
   11. Insira a ponta ATR FTIR.
   12. Clique no botão Coletar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S8) para adquirir um espectro de fundo e, em seguida, o espectro em cada um dos pontos selecionados. Após a conclusão da coleta, os dados serão mostrados em uma nova janela.
3. Preparação de dados para análise downstream
   1. Clique com o botão esquerdo no mapa de calor ou na micrografia para visualizar o espectro que foi adquirido na posição correspondente (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S11).
   2. Clique com o botão direito do mouse em um espectro a ser analisado e selecione Copiar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S11).
   3. Clique com o botão direito do mouse na barra do Windows na parte superior da tela e selecione Nova Janela (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S11).
   4. Clique no botão Colar na parte superior da tela quando a nova janela for aberta (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S11).
   5. Use a mesma abordagem para copiar e colar quaisquer outros espectros desejados para análise nesta janela.
   6. Destaque um espectro ou espectros pressionando Ctrl enquanto clica em cada espectro desejado ou destacando os espectros desejados no menu suspenso.
   7. Clique em Salvar como... e salve os arquivos como arquivos .spa para analisar os dados no software de controle do espectrômetro ou como .csv para analisar os dados em outro pacote de software (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S12).
4. Análise de segunda derivada usando software específico do instrumento
   1. Abra os espectros a serem analisados no pacote de software de processamento e análise espectral específico do instrumento.
   2. Para converter entre os modos % de transmitância e Absorbância, use Ctrl+A (% de transmitância para absorbância) ou Ctrl+T (Absorbância para % de transmitância).
   3. Selecione a região de interesse clicando em Exibir | Limites de exibição (ou Ctrl+D) (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S13A). Para visualizar as bandas Amida I (1.700-1.600 ^cm-1) e amida II (1.600-1.500 ^cm-1), especificamente, defina os limites dos eixos X inicial e final para os números de onda apropriados. Se estiver analisando mais de um espectro, selecione Aplicar a todos os espectros. Clique em OK (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S13B).
   4. Para plotar a segunda derivada, clique em Processar | Derivado... e escolha Segundo no menu suspenso (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S14A). Selecione a derivada de Norris com um comprimento de segmento de 5 e lacuna entre segmentos de 5 (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S14B). Os mínimos do espectro da segunda derivada coincidem com os picos dos componentes dentro do espectro de absorbância original.
      1. Se o espectro estiver muito ruidoso para avaliar os mínimos, suavize o espectro clicando em Processo>Suavização automática (Arquivo suplementar 1 - Figura suplementar S15). Em seguida, calcule a segunda derivada e encontre os mínimos.
   5. Relacione os números de onda nos mínimos da segunda derivada com as posições de banda características para estruturas secundárias usando uma tabela de referência (por exemplo, Tabela 2) para obter informações sobre a estrutura secundária da proteína.
5. Deconvolução de pico usando software de análise específico do instrumento
   1. Defina a região de exibição para a área a ser descomplicada como na etapa 5.4.3. Apenas esta região será descomplicada.
   2. Linha de base corrija a região espectral selecionada usando um dos seguintes métodos:
      1. Clique em Processar | Linha de base automática correta (arquivo suplementar 1 - Figura suplementar S16); ou
      2. Clique em Processar | Linha de base correta (Arquivo suplementar 1 - Figura suplementar S17A) e, em seguida, selecione Linear no menu suspenso e especifique a região espectral a ser corrigida na linha de base no espectro de posição clicando e arrastando os dois pontos que especificam os limites inferior e superior da região a ser corrigida para fins de deconvolução. Em seguida, selecione Adicionar à janela no segundo menu suspenso e clique no botão Adicionar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S17B).
   3. Com o espectro corrigido da linha de base selecionado, clique em Analisar | Determinação de pico... para abrir a janela Peak Resolve (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S18).
   4. Selecione os espectros e curvas a serem analisados usando a barra de seleção no lado esquerdo da tela.
   5. Escolha Gaussiano/Lorentziano com uma configuração de Sensibilidade de Baixa e configuração FWHH de 2 na guia Localizar Picos e clique no botão Localizar Picos (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S19).
   6. Clique no botão Picos para abrir uma tabela descrevendo os picos.
      1. Se tiverem sido escolhidos mais picos do que o fisicamente razoável, clique em Excluir Pico até que o número correto de picos seja obtido para análise (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S20). Por exemplo, para a região da amida I, 5-11 picos são tipicamente relatados na literatura (Tabela 2).
      2. Para garantir que todos os picos sejam positivos após o ajuste, clique em Editar pico e defina a altura mínima como 0. Em seguida, clique em Avançar e repita para cada pico seguido de OK para fechar a janela de edição (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S21).
      3. Se houver números de onda específicos que precisem estar presentes na deconvolução final, clique em Editar Pico e fixe o centro do pico para o número de onda especificado na caixa Valor selecionando Fixo ou forneça um intervalo usando as caixas Limite inferior e Limite alto . Clique em OK para aplicar essas configurações ao pico especificado.
         NOTA: Nesta etapa, é ideal usar as posições de pico encontradas durante a análise da segunda derivada ou picos de uma tabela de referência de estruturas secundárias FTIR, idealmente anotadas para um tipo de amostra de seda semelhante (por exemplo, Tabela 2).
   7. Clique no botão Ajustar Picos (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S22).
      1. Se o algoritmo de ajuste de pico não convergir com êxito, clique em Ajustar picos novamente para continuar a ajustar iterativamente os picos.
   8. Clique no botão Picos... para obter informações sobre posição, altura, FWHH e a área de todos os picos que foram ajustados.
      1. Esses picos podem ser copiados para a área de transferência clicando em Área de transferência para permitir que sejam colados em outra janela ou arquivo (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S23).
      2. Copie picos e espectros para outra janela selecionando o destino no menu suspenso de seleção de janela ao lado do botão Adicionar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S24).
      3. Clique no botão Selecionar tudo e use Arquivo | Salvar como para salvar os picos e espectros como arquivos .spa e/ou .csv (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S25).
   9. Relacione cada pico de componente a uma estrutura secundária usando uma tabela de referência. A área relativa do(s) pico(s) correspondente(s) a uma dada estrutura secundária em relação à área total de todos os picos atribuídos fornece a proporção da proteína que possui essa estrutura secundária.
6. Preparação de dados para análise downstream usando software de terceiros
   1. Abra uma pasta de trabalho e carregue os dados espectrais no software de processamento e análise espectral de terceiros selecionando a opção Dados | Conectar ao arquivo | Item de menu Texto/CSV (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S26). Selecione o arquivo desejado no Explorador de Arquivos e clique em Abrir.
   2. Plote o espectro destacando as colunas a serem plotadas e selecionando o botão Plotar | 2D Básico | Item de menu de linha (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S27).
   3. Clique duas vezes no eixo x e use a guia Escala para ajustar o intervalo para caber no pico de Amida I (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S28).
   4. Se os dados forem muito ruidosos, suavize a curva escolhendo a opção Análise | Processamento de sinal>Suave>Abrir diálogo... (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S29A).
      1. Defina a opção Recalcular como Automático, o Método como Savitzky-Golay, Pontos da Janela como 5, Condição de Contorno como Nenhum e Ordem Polinomial como 2 (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S29B).
      2. Clique em OK para processar.
7. Análise de segunda derivada usando software de terceiros
   1. Selecione a opção Análise | Matemática | Diferenciar | Abrir caixa de diálogo... (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S30).
   2. Defina a opção Recalcular como Automático, defina a Ordem Derivada como 2, selecione a opção Plotar Curva Derivada e clique em OK (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S31).
   3. Se a curva derivada resultante for muito ruidosa, siga as etapas 5.7.1. e 5.7.2, selecionando Savitzky-Golay Smooth na guia Smooth da caixa de diálogo Diferenciar .
   4. Como em 5.4.5, relacione os números de onda nos mínimos da segunda derivada com estruturas secundárias.
8. Deconvolução de pico usando software de terceiros
   1. Depois de clicar no gráfico do espectro de absorbância da amida I, selecione a opção Análise | Picos e linha de base | Analisador de Pico | Abrir caixa de diálogo... (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S32).
   2. Na caixa de diálogo Meta - Ajustar Picos (Pro), defina a opção Recalcular como Automático, selecione Ajustar Picos e clique em Avançar. (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S33A).
   3. Na caixa de diálogo Modo de Linha de Base , defina o parâmetro Modo de Linha de Base como Linha Reta e clique em Avançar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S33B).
   4. Na caixa de diálogo Tratamento de Linha de Base , selecione Subtrair Linha de Base Automaticamente, clique no botão Subtrair Agora e clique em Avançar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S33C).
   5. Na caixa de diálogo Localizar picos , desative Ativar localização automática e clique em Adicionar.
      1. Clique duas vezes na janela que contém o gráfico de um espectro com os picos a serem ajustados.
      2. Selecione picos com base nos mínimos observados na segunda derivada (etapa 5.7.4) ou tabelas de referência (por exemplo, Tabela 2).
      3. Clique em Concluído e, em seguida, clique em Avançar (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S33D).
   6. Na caixa de diálogo Picos de ajuste (Pro), selecione Gerar relatório a partir do resultado do ajuste atual e clique em Ajustar. seguido por Concluir (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S33E).
   7. Avalie a guia PeakProperties1 da pasta de trabalho para ver o centro, a área integrada e o FWHM de cada pico (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S34). Como na etapa 5.5.9, relacione cada pico de componente a um tipo de estrutura secundária e avalie a porcentagem da estrutura da proteína com essa estrutura secundária.

Faixa de número de onda (cm-1)	Designação
1605 a 1615	Correntes laterais Tyr/Fios β agregados
1616 a 1621	Cadeias β agregadas/Folhas β intramoleculares [fracas]
1622 a 1627	Folhas β intermoleculares [forte]
1628 a 1637	Folhas β intramoleculares [forte]
1638 a 1646	Bobina aleatória/cadeias estendidas
1647 a 1655	Bobina aleatória
1656 a 1662	α-Hélices
1663−1696	Transforma
1697-1703	Folhas β intermoleculares [fracas]

Tabela 2: Atribuições de bandas vibracionais da região Amida I para seda de Bombyx mori com base na avaliação comparativa de vários estudos de Hu et ^al.57.

Resultados

Uma solução de dope girável ideal é uma solução clara, sem precipitados e viscosa, indicando dissolução completa da proteína (Figura 7A). Por outro lado, a dissolução incompleta resulta em uma suspensão leitosa ou precipitados visíveis ( Figura 7B , C ). O tempo necessário para a dissolução completa da proteína varia em função do solvente, com alguns solventes, como as misturas TFA/TFE/H₂O, normalmente dissolvendo completamente a proteína em um intervalo de tempo de 30 minutos, enquanto outros, como HFIP, podem exigir agitação durante a noite juntamente com vórtice ocasional.

Figura 7: Otimização da solução de dope giratório. (A) Um solvente capaz de dissolver totalmente a proteína fornece uma solução de dope spinnable clara e viscosa. A dissolução parcial ou suspensão da proteína por uma escolha de solvente não ideal pode resultar em (B) um estado excessivamente viscoso, geralmente com precipitado visível ou (C) uma suspensão leitosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2E mostra uma fibra representativa desenhada à mão, enquanto a Figura 4D mostra uma fibra enrolada e fiada a úmido. Antes de qualquer análise a jusante, a microscopia óptica é essencial para avaliar a qualidade da fibra. Micrografias ópticas representativas de fibras de seda recombinantes fiadas a úmido adequadas para análise a jusante e fiadas usando duas condições diferentes (consulte a Figura 3 para configurações de fiação úmida de amostra) são mostradas na Figura 8. Por microscopia óptica (Figura 8A), fica claro que essas fibras exibem diâmetro uniforme, com um diâmetro diminuído aparente após a aplicação de um sorteio pós-rotação (ou seja, as-spun (AS) vs. pós-spun esticado em uma proporção de 4x em etanol a 40% (4x-EtOH)). O maior grau de birrefringência resultando em um maior contraste na microscopia de luz polarizada (Figura 8B) é consistente com um alinhamento molecular aprimorado na fibra como resultado do processo de extração pós-centrifugação. Finalmente, deve-se notar que defeitos provavelmente serão observados em alguma fração das fibras avaliadas, tornando um determinado segmento de fibra inadequado para análise a jusante. Dois desses exemplos são mostrados na Figura 9.

Figura 8: Micrografias ópticas representativas de fibras de seda de aranha recombinantes fiadas a úmido. As fibras no estado AS e após um estiramento pós-rotação de 4x em etanol (EtOH) são ilustradas para uma construção quimérica de seda piriforme-aciniforme (Py₂W₂) observada por microscopia óptica (coluna da esquerda) e microscopia de luz polarizada (coluna da direita). As imagens são reproduzidas com permissão de Ghimire et ^al.17. Barras de escala = 30 μm. Abreviaturas: AS = as-spun; EtOH = etanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Exemplo de possíveis defeitos de fibra observáveis usando microscopia óptica. (A) Um exemplo de defeito "abaulado". (B) Um exemplo de um defeito de "pescoço". Barras de escala = 20 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a garantia de que os defeitos não estão presentes em um determinado segmento de fibra e após a determinação do diâmetro (seção 3.2 do protocolo), testes de tração podem ser realizados (por exemplo, Figura 6). Curvas representativas de tensão-deformação obtidas para uma seda de aranha recombinante quimérica fiada usando diferentes condições são mostradas na Figura 10. Dependendo das condições de fiação, as fibras resultantes variam de quebradiças (estado AS) a altamente extensíveis, com resistência semelhante ao estado AS (estado 2x-ar) a fibras muito mais fortes e menos extensíveis (estado 4x-EtOH). Deve-se notar que vários segmentos de fibra e lotes de fibras fiadas devem ser avaliados para avaliar de forma inequívoca e rigorosa o comportamento mecânico.

Figura 10: Curva representativa tensão-deformação de fibras fiadas a partir de várias condições. As fibras foram analisadas no estado as-spun (AS) ou através da produção usando estiramento pós-centrifugação automatizado (taxa de tração e condição de estiramento (ar vs. solvente) indicada). Figura adaptada com permissão de Ghimire et al.(2024)¹⁷. Abreviatura: AS = as-spun. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, a estrutura secundária em estado de fibra pode ser avaliada usando espectromicroscopia ATR-FTIR. Os espectros típicos de fibra de seda adquiridos por esta metodologia (Figura 11A, B) teriam bandas de proteína características, incluindo um pico de amida a largo (centrado em torno de ~ 3.300 ^cm-1), um pico de amida I (~ 1.600-1.700 ^cm-1) e um pico de amida II (~ 1.500-1.600 ^cm-1). Aqui, nos concentramos na avaliação da região da amida I (por exemplo, Figura 11C, D). A análise da segunda derivada é útil como meio de identificação dos principais componentes do pico de amida I (Figura 11E, F), fornecendo credibilidade à deconvolução quantitativa do pico (Figura 11G-J) que permite a avaliação e comparação das proporções do tipo de estrutura secundária observadas em uma fibra de seda fiada sob uma determinada condição.

Figura 11: Espectros FTIR e análise de estrutura secundária. (A, B) Espectros FTIR de fibras Py₂W₂ produzidas por fiação úmida no estado (A) as-spun (AS) e (B) incorporando um estiramento de 4 pós-centrifugação em etanol. (C, D) Regiões de amida I dos espectros FTIR mostradas em A e B, respectivamente. (E-F) Segunda derivada das regiões da amida I mostradas em C e D, respectivamente, calculadas usando o pacote de software indicado. (G-J) Deconvolução de pico de amida I realizada usando os pacotes de software (G e I) OMNIC ou (H e J) OriginPro, com os painéis G e I sendo a deconvolução correspondente a C e H e J a D . Abreviaturas: FTIR = transformada de Fourier infravermelho; AS = as-fiado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Indo além das técnicas individuais, a correlação de dados de estruturação secundária, desempenho mecânico e orientação (supra) molecular é tipicamente essencial tanto para a compreensão das influências de diferentes parâmetros de fiação no material resultante quanto para a otimização racional do processo de fiação. Nas deconvoluções FTIR mostradas na Figura 11, por exemplo, comparando as condições AS com 4×-EtOH para uma seda quimérica, contribuições substanciais de β folhas para a banda amida I são claras para ambas as condições, mas compreendem uma proporção maior da estrutura secundária total para o estado esticado pós-fiado em relação ao estado AS, independentemente do método de deconvolução (por exemplo, Figura 11G, H vs. Figura 11I, J). Isso é consistente com a resistência substancialmente maior observada para a condição 4×-EtOH do que o estado AS (Figura 10) e a melhora no alinhamento molecular na condição 4×-EtOH em relação ao estado AS (Figura 9). Caracterização e análise detalhadas, cobrindo a gama de condições mostradas na Figura 10, foram relatadas anteriormente¹⁷. Portanto, não recapitulamos toda a análise aqui, em vez disso, usamos essa comparação em pares como uma demonstração da maneira como essas três classes de dados são complementares entre si e permitem o desenvolvimento de uma compreensão muito mais abrangente do comportamento da fibra do que qualquer técnica isoladamente.

Arquivo Suplementar 1: Um arquivo contendo as Figuras Suplementares S1-S34 que descrevem a medição do diâmetro da fibra, o processamento de dados mecânicos e a aquisição e processamento de dados FTIR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Uma planilha que permite a determinação das principais propriedades mecânicas (ou seja, tensão, deformação, módulo de Young e tenacidade) a partir de dados de massa versus tempo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A produção de proteína recombinante permite o potencial empolgante de fabricar materiais em uma ampla variedade de formatos, com avanços recentes implicando que esses materiais à base de proteína estão se aproximando de um uso industrial mais difundido⁵⁸. Aqui, nos concentramos na produção de fibras a partir de seda recombinante, pois este é o formato de seda recombinante diretamente relacionado às sedas fibrosas nativas. As fibras de seda têm sido apontadas como tendo inúmeras aplicações potenciais devido às renomadas propriedades mecânicas das sedas naturais de aranha e devido ao potencial de produzir fibras de alto desempenho de forma sustentável³². As aplicações propostas variam de têxteis de alto desempenho a materiais absorventes de energia, produtos de higiene pessoal e uso em saúde^58,59. Dispositivos e materiais à base de seda de aranha em formatos vestíveis ou em outros contextos onde a condutividade elétrica é aprimorada também estão sob exploração ativa para aplicações biomédicas e mais amplas⁶⁰. Há, portanto, um amplo interesse em desenvolver, otimizar e personalizar materiais à base de seda de aranha. Neste protocolo, descrevemos uma série de procedimentos direcionados à produção rápida de fibras, seja após a preparação de uma nova proteína da seda recombinante ou para modular as propriedades dos materiais de uma seda recombinante que já foi estabelecida para ser fiável.

Independentemente do método de fiação empregado, é fundamental determinar as condições que permitem a produção de spin dope por meio da triagem de condições de solvente/tampão e concentração de proteína, conforme detalhado aqui. O objetivo final é a solubilização da proteína em uma concentração suficientemente alta para permitir a rápida conversão em uma fibra sem automontagem fora do caminho em agregados ou outras espécies insolúveis que impedirão a fiação "produtiva". Esta é tipicamente uma solução transparente e relativamente viscosa, mais do que provavelmente compreendendo espécies automontadas, como micelas / nanopartículas^{26 , 61} e / ou separação de fase líquido-líquido⁶². Este protocolo não detalha métodos para avaliar de forma abrangente o estado do spin dope, uma vez que a fiação de fibra bem-sucedida pode ser alcançada por meio da avaliação iterativa de vários dopes de spin e configurações de fiação. Uma visão molecular e supramolecular detalhada do estado de narcótico de spin pode ser obtida por meio de técnicas como viscometria, espalhamento de luz, espectroscopia de dicroísmo circular de UV distante, espectroscopia de ressonância magnética nuclear e / ou microscopia eletrônica²⁶. Deve-se notar também que a própria proteína recombinante pode ser modificada para melhorar seu comportamento para spinning, com a inclusão dos domínios globulares não repetitivos N e C-terminais sendo um exemplo de método para aumentar a solubilidade da espidroína³². Em suma, sem a identificação adequada do spin dop, não é viável prosseguir com o teste comparativo das condições de fiação.

Uma vez que uma ou mais condições de spin dope tenham sido identificadas, o desenho à mão fornece uma rota rápida para avaliar as propriedades da fibra de seda. Uma vez que volumes substancialmente menores de dope são necessários para o desenho manual produtivo, são necessárias massas muito menores de proteína pura, tornando-o um excelente precursor para abordagens automatizadas de fiação úmida. Isso também fornece um método muito tratável e direto para comparar diretamente as propriedades da fibra de diferentes espidroínas³³, novamente com o benefício de que a produção de fibras é relativamente direta com pequenas quantidades de proteína. Isso significaria que a otimização da expressão de proteínas e os protocolos de purificação para obter os maiores rendimentos necessários para a fiação úmida podem ser focados nas espidroínas mais promissoras. A desvantagem, é claro, é que o desenho à mão não é passível de produção de fibras longas e contínuas ou de quantidades substanciais de fibra de maneira simplificada.

Dada proteína suficiente, a fiação úmida oferece vantagens para a produção simplificada de fibras longas e contínuas³². Não apenas isso, mas as propriedades da fibra podem ser facilmente moduladas através do processo de fiação. A escolha das condições de dope giratório, por exemplo, fornece uma rota clara para melhorar a mecânica da fibra. No caso de uma proteína de seda aciniforme recombinante de ~ 60 kDa, por exemplo, a mudança de um dope de spin para outro com todos os outros parâmetros de spinning permanecendo constantes levou a mudanças dramáticas na extensibilidade da fibra²⁶. Isso foi, por sua vez, relacionável com a maneira pela qual a espidroína aciniforme se montou na droga de spin antes da fiação, com a homogeneidade aprimorada de nanopartículas automontadas na droga de spin sendo correlacionada à mecânica aprimorada da fibra. A incorporação de um sorteio pós-centrifugação, observando que a taxa de sorteio deve ser otimizada para um determinado tipo de fibra, também melhora a mecânica da fibra de seda por meio de alguma combinação de alinhamento molecular aprimorado e conversão aprimorada para, por exemplo, cristalitos de folha de β que fortalecem as fibras³². Finalmente, o uso de diferentes condições durante o estágio de extração pós-centrifugação fornece um meio de modular as propriedades da fibra. A exposição ao solvente imediatamente antes ou durante a extração pode alterar substancialmente as propriedades mecânicas e estruturais da fibra^17,38, observando que diferentes espidroínas terão diferentes preferências e tolerâncias de solvente (por exemplo, com fibras aciniformes recombinantes sendo altamente compatíveis com a água^26,31 vs. fibras piriformes recombinantes sofrendo contração em água³⁸ vs. fibras de espidroína piriforme-aciniforme quimérica exibindo a compatibilidade com a água da espidroína aciniforme, apesar de ser menos da metade da proteína em massa¹⁷).

O protocolo descrito fornece uma abordagem altamente personalizável e versátil para avaliar e otimizar a capacidade de fiação e as propriedades da fibra de sedas de aranha recombinantes. Em todos os casos, as propriedades da fibra resultantes devem ser analisadas e comparadas de forma consistente e robusta. Aqui, propomos o uso de microscopia óptica, incluindo microscopia de luz polarizada, teste de tração e espectromicroscopia FTIR como um "kit de ferramentas padrão" de técnicas para esse fim. Técnicas adicionais de caracterização biofísica e de materiais podem ser aplicadas para expandir a compreensão das fibras resultantes, mas esse conjunto de técnicas fornece uma cobertura excepcional das principais propriedades da morfologia, alinhamento/anisotropia intrafibrilar, desempenho mecânico e estruturação secundária de proteínas. Em particular, embora a espectromicroscopia FTIR forneça um meio relativamente simples de avaliar a estruturação secundária da fibra de seda e a microscopia de luz polarizada permita inferências sobre o grau de alinhamento molecular aprimorado que foi alcançado, outras metodologias, como espectroscopia de RMN de estado sólido^63,64, difração de raios-X⁶⁴, espectromicroscopia Raman polarizada⁶⁵ e/ou microscopia óptica não linear⁵⁴ devem ser considerados para avaliar de forma mais abrangente a cristalinidade, o alinhamento e a estruturação dentro das fibras de seda para a elucidação completa da relação estrutura-mecânica. Dada a adequação da fiação úmida para outros tipos de proteínas⁶⁶, prevemos que este protocolo seja geralmente aplicável além das sedas recombinantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,1,1,3,3,3-hexafluroropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Usado para preparação de dope
Seringa 1725LTSN com agulha cimentada de ponta Luer	Hamilton	81100	Usado para fiação úmida
2,2,2-trifluoroetanol (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Usado para preparação de drogas
Etanol absoluto	Fisher Scientific	BP28184	Usado para banho de coagulação
Ácido acético	Fisher Scientific	A38-212	Usado para preparação de drogas
Balança analítica	Mettler Toledo	XS105	Dispositivo de teste de tração
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C-3881	Usado para preparação de drogas
Ácido cítrico	Millipore Sigma	77-92-9	Usado para preparação de drogas
Computador	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Modelo B	Dispositivo de fiação úmida - fornece a capacidade de usar a interface gráfica do usuário para controlar motores de passo
Hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Usado para preparação de drogas
Ácido fórmico	Fisher Scientific	A118-500	Usado para preparação
drogas Lâminas de vidro	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Usado para montagem de fibra
Ácido clorídrico (HCl)	EM Science	HX0603-53	Usado para preparação de drogas
Detector Resfriado MCT-A	Thermo Fisher Scientific	840-199300	Avaliação FTIR da estrutura secundária da fibra
Placa de montagem	Fabricado internamente		Dispositivo de fiação úmida
Motor de passo biopolar NEMA 17	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Dispositivo de fiação úmida - nota: vários motores necessários para realizar o alongamento pós-centrifugação
Espectromicroscópio Nicolet iN10 FTIR	Thermo Fisher Scientific	912A0604	Avaliação FTIR da estrutura secundária da fibra
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	FTIR avaliação da estrutura secundária da fibra
Nicolet iN10 Joystick de Estágio Motorizado	Thermo Fisher Scientific	840-199800	Avaliação FTIR da estrutura secundária da fibra
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	Avaliação FTIR da estrutura secundária da fibra
OMNIC Picta ver. 1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	software de controle de instrumento FTIR
OMNIC ver. 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	FTIR software de processamento e análise de dados específicos
instrumentos Microscópio óptico/de luz polarizada	Zeiss Canada	Axio Observer A1	Microscópio óptico invertido
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Software de processamento e análise de dados FTIR de terceiros
Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-10	Usado para preparação de dope
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Usado para preparação de doping
Fonte de alimentação	ALITOVE	ALT-1205	Dispositivo de fiação úmida - Conversor de adaptador de alimentação 12V 5A AC 100-240V Entrada com saída DC de 5,5x2,5mm - nota: para desempenho ideal, pode exigir fonte de alimentação separada para cada motor
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Usado para preparação de dope
Hidróxido de sódio (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Usado para preparação de dope
Rolos giratórios	Fabricado internamente		Usado para fiação úmida
Cabos de motor de passo	XMSJSIY B0BD5FV3R2		Dispositivo de fiação úmida - fornece conexão de controladores de motor de passo a motores de passo Controlador de
motor de passo (Pi HAT)	Adafruit	DC & Controlador de motor de passo HAT para Raspberry Pi	Permutação do controlador do motor do dispositivo de fiação úmida 1 - observe a taxa de rotação limitada do motor de ~46 rpm Controlador do motor de
passo (USB)	Polulu	Tic T249	Permutação do controlador do motor do dispositivo de fiação úmida 2 - use quando a rotação mais rápida que 46 rpm pode ser necessária
Bomba de seringa	KD Scientific	Modelo 100	Dispositivo de teste de tração e dispositivo de fiação úmida
Ácido trifluoroacético (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Usado para preparação de drogas
Tris-cloridrato	EMD Millipore	9310-500GM	Usado para preparação de drogas
Hub USB	Acasis	B07Q3TYF15	Dispositivo de fiação úmida - Hub USB alimentado por 48W - ACASIS 10 portas Hub de dados USB 3.0 - com interruptores individuais de ligar/desligar e adaptador de energia de 12V/4A Divisor USB - interface entre os controladores de motor de passo Raspberry Pi e Tic T249