Procedimento de Transecção/Resutura do Nervo Ciático do Camundongo para Estudo da Reparação Nervosa e Recuperação Funcional

Summary

Esse protocolo descreve um modelo de transeção e resutura do nervo ciático em camundongos para estudar a regeneração do nervo periférico usando neurônios ganglionares da raiz dorsal adultos. Ele possibilita a análise in vivo do recrescimento axonal, reinervação muscular e recuperação funcional após lesão nervosa.

Abstract

A reparação nervosa é crucial para restaurar a função após a lesão axonal. No entanto, neurônios maduros no sistema nervoso central (SNC) têm capacidade limitada de regenerar seus axônios após a lesão devido à diminuição da capacidade intrínseca de crescimento e a um ambiente hostil. Em contraste, neurônios do sistema nervoso periférico (SNP) exibem potencial regenerativo robusto. Entre eles, os neurônios adultos do gânglio da raiz dorsal (DRG) são particularmente conhecidos por sua capacidade de regeneração eficaz após lesões nos nervos periféricos, tornando-os um modelo ideal para estudar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à reparação nervosa. Aqui, uma técnica de microsutura modificada, chamada "loop before-transection", é descrita para gerar um modelo de transeção e resutura do nervo ciático em camundongos, seguida pela análise da regeneração axonônica. Avaliações comportamentais e reinervação muscular também demonstraram avaliar a recuperação funcional. Após a transecção e ressutura do nervo ciático, os animais inicialmente apresentam déficits comportamentais, mas a recuperação total geralmente é observada até 30 dias após a lesão. Aplicar medicamentos que promovem a fusão axonal no local da lesão acelera significativamente a recuperação funcional. Esse sistema modelo oferece uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos que regem a reparação nervosa em mamíferos in vivo.

Introduction

A lesão axonal é uma consequência comum e grave de danos cerebrais e medulares, frequentemente causados por lesões traumáticas, neurotoxinas ou distúrbios neurológicos que interrompem a conectividade neural e prejudicam a regeneração^{axonal 1,2}. Nem todos os neurônios possuem uma capacidade intrínseca de regeneração, o que é crucial para a reparação de axônios cortados. A taxa de regeneração axonal é influenciada por múltiplos fatores, incluindo o potencial intrínseco de crescimento do neurônio, eficiência de síntese proteica, dinâmica do citoesqueleto, eliminação de detritos de mielina e disponibilidade de fatores^{de crescimento 3,4}.

No sistema nervoso central (SNC) adulto dos mamíferos, a lesão axonal leva a uma capacidade regenerativa diminuída, principalmente devido à ausência de fatores intrínsecos que promovam o crescimento e à presença de sinais inibitórios^{extrínsecos 1,5}. Em contraste, os axônios do sistema nervoso periférico (SNP) possuem uma capacidade robusta de se regenerar após lesões, devido aos mecanismos intrínsecos de autorreparo dos neurônios periféricos e à rápida reativação de programas pró-regenerativos de crescimento. Após a lesão, o segmento distal do axônio se desconecta do soma neuronal e sofre degeneração walleriana, caracterizada por desintegração e fragmentação^{axonal 6,7}. A eliminação eficiente dos detritos axonais e de mielina pelas células gliais é essencial para a regeneração bem-sucedida, pois previne a formação de cicatrizes que poderiam dificultar o crescimento^{axonal 3,8}. Esse processo, juntamente com a remodelação do citoesqueleto dos axônios lesionados, apoia o crescimento do coto proximal e facilita a reinervação do alvo. Esses eventos ocorrem em fases parcialmente sobrepostas, durante as quais a ativação induzida por lesão de fatores de transcrição como ATF3 e c-Jun promove programas pró-regenerativos de expressão^{gênica 4,9,10}.

A fusão axonal regenerativa representa um mecanismo eficiente para restaurar a conectividade neuronal após a lesão^{axonal 11}. Esse processo foi descrito pela primeira vez no lagostim Procambarus clarkii em 1967-12 e desde então foi documentado em várias^{espécies 13, 14, 15, 16}, incluindo Caenorhabditis elegans¹⁷. Embora evidências diretas de fusão axonal em mamíferos permaneçam limitadas, estratégias indutoras de fusão foram empregadas com sucesso para aprimorar a reparação^{nervosa 11}. Notavelmente, o químico fusogênio polietilenoglicol (PEG) promove a revedação da membrana e tem demonstrado facilitar a recuperação funcional após lesões tanto nos nervos periféricos quanto na medula espinhal em modelos^mamíferos 18,19,20,21,22,23,24. Descobertas recentes indicam que a depleção da peroxidase de glutationa (GPX) é suficiente para promover a fusão axonal em C. elegans²⁵. De forma semelhante, camundongos nocauteados condicionais com Gpx4 ou aqueles tratados com o inibidor do GPX ML162 apresentaram recuperação funcional acelerada após a transecção do nervo ciático, potencialmente por meio de fusão axonal^{aprimorada 25}.

O nervo ciático é um nervo misto composto por axônios sensoriais, somáticos motores e autonômicos²⁶. Ele surge dos segmentos espinais L4 e L5 nos ratos²⁷, e dos segmentos L3 e L4 nos^{camundongos 28}. Devido à sua acessibilidade e consistência anatômica, a lesão do nervo ciático tornou-se um dos modelos mais amplamente utilizados para estudar a regeneração dos nervos^{periféricos 29,30}. Esses modelos permitem a investigação tanto dos mecanismos neuronais intrínsecos quanto dos fatores ambientais extrínsecos que influenciam o crescimento axonal e a recuperação^{funcional 3,4,9}. O uso da compressão do nervo ciático como paradigma experimental em neurociência remonta ao final do século^{XIX 29}. Além dos modelos de esmagamento nervoso, a transeção nervosa é amplamente utilizada para estudar a regeneração de axônios e a recuperação funcional. No entanto, a transeção clássica do nervo ciático seguida por sutura em camundongos é frequentemente menos reprodutível e confiável do que em ratos, devido ao pequeno tamanho do nervo e à textura^{frágil 31}.

Utilizando um modelo modificado de transeção e resutura do nervo ciático, denominado "loop-before-transection", foram gerados com sucesso modelos reprodutíveis de transeção e resutura do nervo ciático²⁵. Essa abordagem elimina a necessidade de manuseio do nervo pós-transecção, pré-inserindo o ponto antes do corte, reduzindo assim o estresse mecânico e minimizando a variabilidade devido à técnica cirúrgica. Níveis moderados de modulação da GPX foram considerados responsáveis pela recuperação funcional após a transeção completa do nervo ciático^{do camundongo 25}. O co-tratamento das baixas concentrações ML162 (0,25 μM⁾³², inibidor de GPX e polietilenoglicol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 na lesão de transeção do nervo ciático (SNT) / resutura aumentou com sucesso a pontuação comportamental avaliada pelos testes de pinpunz, assimetria de falha do pé e ^{espalhamento do dedo do pé 25,33.34}. Fragmentos de axônio distal amputados dos neurônios do gânglio dorsal da raiz (DRG) dos mamíferos degeneram em até 3 dias, resultando em perturbação das junções neuromusculares (NMJ^)6,35, e neurônios DRG regenerativos irão reinervar os músculos para recuperar suas funções. O grupo de co-tratamento SNT/resuture-ML162/PEG apresentou NMJs inervados e escores comportamentais aprimorados no início do tempo (3 dias após a cirurgia), indicando recuperação precoce da função^{neuromuscular 25}.

Aqui, são descritos o método de microsutura "loop before-transection" e a administração de medicamentos que possibilitaram as observações acima em camundongos. Um protocolo de fusão PEG-já estabelecido, que permite o reparo rápido de nervos de rato cortados, foi^{modificado em 18}. O polietilenoglicol (PEG) foi inicialmente relatado como promovendo a reconexão exógena dos axônios gigantes mediais (MGA) cortados do lagostim in vitro³⁶. Os protocolos de fusão PEG-fusão melhoraram os desfechos comportamentais em 25%-30% dos ensaios envolvendo lesões por separação por esmagamento do nervo ciático do rato, embora a recuperação funcional não tenha sido observada nos primeiros^{momentos 34}. Refinamentos subsequentes incorporaram o conceito de vedação endógena por^{membrana 37}. Após a lesão nervosa, o reparo rápido do plasmalemmo é neuroprotetor e previne a neurodegeneração. O acúmulo induzido por Ca²+ de vesículas ligadas à membrana facilita esse processo^{de vedação 38}. A transeção completa do nervo interrompe o axolema, bem como as bainhas endoneurial, perineurial e epineurial no local da lesão. A microsutura da bainha epineurial alinha os cotos dos nervos proximal e distal. Durante a etapa de sutura, o uso de soro fisiológico hipotônico livre de Ca²+ reduz a formação de vesículas de membrana, mantendo as bainhas endoneuriais e perineuriais abertas e permitindo que sejam aproximadas de perto pelas suturas epineuriais. Após isso, a aplicação de soro fisiológico contendo Ca²⁺ induz o acúmulo de vesículas para selar a disrupção plasmalemica^{restante 18}.

Neste protocolo, foram usados camundongos adultos FVB (8-10 semanas) e camundongos C57BL/6, e nenhuma diferença específica da cepa foi observada. O nervo ciático em camundongos está localizado aproximadamente 1-2 mm abaixo do músculo glúteo, na metade da coxa, e é notavelmente mais fino e frágil do que em ratos, exigindo maior precisão cirúrgica durante a dissecação e sutura. Deve-se ter cuidado para evitar o excesso de estiramento dos nervos ou manipulação excessiva que possa comprometer a recuperação funcional. Essa abordagem envolve a separação completa do nervo, resultando em uma lacuna física entre os cotos proximal e distal. Como essa lacuna inibe a regeneração axonal direta, a recuperação bem-sucedida normalmente requer intervenção microcirúrgica ou enxerto nervoso.

Considerando que o nervo ciático do camundongo é mais fino e delicado do que o do rato, é necessária maior precisão cirúrgica. Embora a microsutura seja comumente utilizada, ela pode causar traumas adicionais inadvertidamente devido à manipulação excessiva ou passagens repetidas com^agulha. Essas limitações podem introduzir variabilidade e potencialmente dificultar a avaliação de novas estratégias de tratamento. Portanto, alcançar resultados cirúrgicos consistentes enquanto minimiza o dano nervoso induzido por sutura é essencial para avaliar de forma confiável a recuperação funcional em modelos de transeção nervosa. Utilizando esse método de "loop antes da transecção", foram gerados modelos reprodutíveis de transeção e resutura do nervo ciático, e os efeitos do tratamento duplo com PEG e ML162 na recuperação funcional foram avaliados. No geral, apesar de seu uso generalizado, o modelo de transeção do nervo ciático em camundongos apresenta desafios técnicos devido ao pequeno tamanho e fragilidade do nervo. Esse método modificado de resutura descrito aqui atende a uma necessidade crítica de um protocolo microcirúrgico padronizado e reprodutível que minimize danos mecânicos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio (Número do Protocolo: 20200082AR). Ratos adultos machos e fêmeas de FVB (8-10 semanas, 20-25 g) foram usados para os procedimentos experimentais JoVE descritos aqui. Camundongos C57BL/6 (8-10 semanas de idade, 20-25 g) foram usados apenas em cirurgias preliminares realizadas antes dos experimentos formais para otimizar a precisão do manuseio e sutura. Essas sessões de prática confirmaram que o procedimento de "loop antes da transecção" produzia resultados comparáveis em ambas as cepas; portanto, todos os dados formais apresentados neste manuscrito foram obtidos de camundongos FVB. Um total de dez camundongos FVB (cinco machos e cinco fêmeas) foi inicialmente incluído para a transseção do nervo ciático, seguida pelo tratamento ML162 + PEG. Um animal apresentou uma variação anatômica congênita em que o nervo ciático se bifurcava em dois ramos principais antes do local da transsecção, resultando em cirurgia incompleta e exclusão da análise. Portanto, análises comportamentais e histológicas foram realizadas em nove animais (n = 9). Ambos os sexos apresentaram recuperação regenerativa e comportamental comparáveis, e não foram observadas diferenças específicas por sexo. Um camundongo adicional passou por dupla penetração de sutura sem transeção nervosa (controle simulado) para avaliar o impacto potencial do próprio procedimento de sutura nos desfechos comportamentais. Não foram observadas diferenças perceptíveis na resposta regenerativa entre os sexos. Os animais foram alojados em condições padrão com um ciclo de 12 horas de luz/escuro, a 75 °F e umidade relativa de 40%-60%, com acesso ad libitum a alimento e água. Foram usados camundongos machos e fêmeas, e nenhuma diferença perceptível foi observada entre animais machos e fêmeas. Procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia isoflurana do sistema de anestesia de baixo fluxo SomnoSuite. Testes comportamentais foram realizados a partir do segundo dia pós-operatório e repetidos nos dias 4, 7, 10, 14, 18, 22 e 27, conforme indicado nos números correspondentes. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Transeção/resutura do nervo ciático e tratamento medicamentoso

1. Coloque o animal sobre uma almofada aquecida onde o nervo ciático possa ser observado sob um microscópio estereoscópico de dissecação (Figura 1A).
2. Anestesie o rato usando o sistema de anestesia de baixo fluxo SomnoSuite.
   NOTA: Confirme a profundidade da anestesia pela ausência de respostas reflexas, como reação a um beliscão no dedo do pé, antes de iniciar a cirurgia. Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar o ressecamento da córnea.
3. Raspe os pelos da coxa e ao redor.
   NOTA: Remova os fios raspados e caídos da forma mais limpa possível. Caso contrário, os pelos vão aderir ao ponto de nylon 10-0 e contaminar o nervo ciático. Os pelos residuais podem ser removidos suavemente usando fita adesiva de laboratório ou fita adesiva após a barba para garantir um campo cirúrgico limpo. Desinfete o local cirúrgico limpando sequencialmente a área raspada com etanol 70%, betadina e um lenço final com etanol 70% usando bolas de algodão autoclavadas.
4. Localize o osso do fêmur e faça uma pequena incisão cutânea de aproximadamente 1,0 cm (intervalo de 0,8-1,2 cm) na altura da coxa, cerca de ~1 mm posterior e paralela ao osso do fêmur usando tesouras cirúrgicas finas.
   1. Retraa suavemente o glúteo máximo para expor o bíceps femoral subjacente. Depois, use as pontas da tesoura para separar delicadamente as cabeças anterior e posterior do bíceps femoral, sem cortar, expondo o nervo ciático abaixo da incisura ciática. Essas etapas são realizadas sob observação visual direta, não sob o microscópio.
5. Retire o nervo ciático do corpo usando pinças microdissecadoras para facilitar a cirurgia no nervo ciático (Figura 1A).
   NOTA: Fixe as pinças com fita adesiva para evitar que elas se espalhem além de certo nível e minimizar danos ao nervo ciático. Coloque a ponta da pinça sob o nervo ciático e levante o nervo ciático para cima usando a coxa do camundongo como fulcro. Tome cuidado para levantar o nervo apenas o quanto necessário para facilitar a sutura, e evite aplicar tensão ou puxá-lo para fora, pois o excesso de estiramento pode danificar os axônios ou as estruturas ao redor.
6. Foque o microscópio no nervo ciático exposto. A partir dessa etapa, prossiga pelo Passo 15 usando um microscópio (Figura 1A).
7. Penetre o dobro do nervo ciático com ponta de nylon 10-0 (Figuras 1B,C). Vá para os Passos 1-8 para controle não cortado. Vá para os Passos 1-11 para a transeção nervosa.
   NOTA: Duas penetrações foram feitas aproximadamente uma largura de nervo uma das outras (~0,7 mm), posicionadas simetricamente em cada lado do local pretendido da transeção. Esse espaçamento garantiu o alinhamento adequado dos tocos proximal e distal, minimizando o estresse mecânico na lesão. Faça penetração pelo centro do nervo ciático com a sutura, garantindo que as duas penetrações feitas pela sutura estejam precisamente paralelas. Os pontos 10-0 são pequenos e precisam ser controlados com pinças super finas. O nylon 10-0 não absorvível foi utilizado porque proporciona excelente estabilidade à tração e mínima reatividade tecidular durante o período de observação de 30 dias. Esse material é amplamente utilizado em modelos microcirúrgicos de reparo nervoso em camundongos e^{ratos 18,31}. Suturas absorvíveis não foram usadas porque a degradação gradual poderia comprometer o alinhamento dos cotos nervosos seccionados antes que a recuperação funcional seja completa. Para minimizar a variabilidade dependente do operador, todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados por um único cirurgião treinado após extensa prática microcirúrgica sob estereoscópio. O próprio método "loop antes da transecção" reduz ainda mais a variabilidade ao eliminar a necessidade de manipulação nervosa pós-transecção, garantindo assim alinhamento e tensão consistentes entre os animais. Isso exige bastante prática e um alto nível de habilidades de controle. Antes de realizar cirurgias com animais, iniciantes podem achar útil praticar o movimento de sutura usando fios sintéticos finos, como fio dental, para desenvolver destreza e controle sob um estereoscópio.
8. Faça um nó cuidadosamente com o ponto de náilon.
9. Coloque o nervo ciático exposto sob a camada muscular e feche a pele usando pontos de nylon 4-0.
10. Determine que a dupla penetração do nervo ciático com uma sutura de nylon 10-0 não afeta o comportamento do camundongo.
    NOTA: Para confirmar isso, camundongos que passaram por penetração dupla sem transeção foram submetidos aos mesmos testes comportamentais usados nos grupos experimentais, incluindo pontos, assimetria de falha do pé e espalhamento dos dedos. Esses camundongos alcançaram consistentemente escores completos equivalentes aos controles do tipo selvagem não operados, indicando que o procedimento de sutura sozinho não prejudicou a função do nervo ciático.
11. Corte o nervo ciático no meio do caminho entre os dois pontos de nylon 10-0 usando um bisturi (Figura 1D).
    NOTA: Para minimizar a variabilidade, todas as cirurgias foram realizadas pelo mesmo experimentador treinado, utilizando um procedimento padronizado. Além disso, o design "loop antes da transeção" minimiza inerentemente a variabilidade ao evitar o manuseio do nervo pós-transecção, garantindo a colocação consistente dos pontos e a tensão em todos os animais. A posição dos pontos foi verificada sob um microscópio dissecante para garantir uniformidade entre os animais.
12. Guarde a pinça.
13. Lave o nervo cortado com soro tampão fosfatado Ca²⁺ livre (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,4), preparado sem cloreto de cálcio.
    NOTA: Enxágue o coto nervoso cortado com PBS sem cálcio por aproximadamente 10-20 segundos para limpar o sangue e evitar vedação prematura. A suturação deve ser concluída rapidamente em 1-2 minutos para manter o alinhamento e a viabilidade do tecido.
14. Remova o PBS livre de Ca²⁺ absorvendo-o com um lenço.
15. Faça cuidadosamente um nó com o ponto de nylon (Figura 1E). Prossiga para o Passo 20 se o tratamento medicamentoso não estiver planejado ou necessário.
    NOTA: Um nó quadrado padrão foi usado para microsutura, consistindo em dois movimentos opostos suavemente apertados com pinças finas sob um estereomicroscópio. Os dois axônios seccionados, conectados pela sutura, retornam a uma forma próxima à sua forma original. A reconexão de um vaso sanguíneo cortado pode ser um indicativo visual de que os cotos dos nervos proximal e distal estão corretamente alinhados. Durante o procedimento, o tecido deve parecer fresco e úmido, sem palidez ou compressão. Evite amarrar o ponto muito apertado, pois isso pode colapsar os vasos sanguíneos ou deformar o nervo. Antes de fazer o nó final, certifique-se de que as extremidades nervosas estejam aproximadas sem tensão. Se necessário, reposicione suavemente o membro para facilitar o alinhamento natural em vez de puxar o nervo, pois tensão excessiva pode aumentar o risco de neuroma ou fibrose.
16. Coloque 0,25 μM de ML162 em DMSO diluído em PBS sobre o nervo ciático suturado usando uma seringa. Permita que o nervo ciático suturado seja imerso no medicamento por 1 minuto.
17. Remova o ML162 absorvendo-o com um cotonete estéril.
18. Coloque 500 mM de PEG em água destilada, pré-aquecidos a 37 °C, sobre o nervo ciático suturado usando uma seringa. Permita que o nervo ciático suturado seja imerso no medicamento por 1 minuto.
    NOTA: 500 mM de PEG é uma solução densa que pode se tornar sólida à temperatura da sala de operação. Coloque a seringa sobre uma almofada aquecida durante a operação para garantir que o PEG permaneça líquido. Acredita-se que o PEG promova a fusão de membrana ao remover moléculas de água entre as bicamadas lipídicas adjacentes, permitindo assim contato próximo entre membranas e fusão espontânea. Embora o mecanismo molecular preciso ainda esteja em investigação, essa abordagem demonstrou facilitar a continuidade axonal e melhorar a recuperação funcional em modelos de lesão nervosa periférica.
19. Remova o PEG absorvendo-o com um lenço.
20. Lave o nervo suturado com PBS contendo Ca²⁺ (PBS suplementado com 1 mM de_{CaCl 2}; 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de tampão fosfato, pH7,4).
21. Remova o PBS contendo Ca²⁺ absorvendo-o com um tecido.
22. Coloque o nervo ciático exposto sob a camada muscular e feche a pele usando pontos de nylon 4-0.
23. Quando o animal se recuperar da anestesia, deva-o à gaiola.
    NOTA: Após o fechamento da pele, o local cirúrgico foi tratado com uma pomada antibiótica tópica contendo analgésico. Cada animal era monitorado em uma almofada térmica até recuperar consciência suficiente para manter a reclinância esternal. Os animais eram então alojados individualmente e retornados ao grupo somente após a recuperação completa da função motora. Embora o ambiente cirúrgico não fosse mantido sob um capelo de fluxo laminar, todos os instrumentos cirúrgicos eram esterilizados, e os procedimentos eram realizados usando técnica asséptica com mãos enluvadas e ferramentas estéreis.

2. Teste de comportamento - Picada de agulha

NOTA: Para avaliar a resposta de sensibilidade mecânica de alto limiar após^{a lesão 33}.

1. Coloque o mouse em uma grade de malha de arame e deixe que ele circule livremente por 30 minutos para se habituar ao novo ambiente.
2. A parte mais lateral da superfície plantar da pata traseira foi dividida em 5 áreas (de A a E). Aplique suavemente o Austerlitz (tamanho 000) na superfície plantar da pata ipsilateral. A pontada foi aplicada duas vezes, do dedo mais lateral (área A) até o calcanhar (área E).
   NOTA: Não penetre a pele.
   NOTA: Uma resposta foi considerada positiva quando o animal retirou rapidamente a pata dos dois estímulos de pontada. O mouse recebeu nota 1 nessa área e depois testado na próxima (Máximo 5). Se nenhuma das inscrições recebesse uma resposta positiva, a nota geral era 0. Use o território safeno do mesmo lado ipsilateral como controle positivo. Isso sempre vai provocar uma resposta positiva.

3. Teste de comportamento - Assimetria de falha do pé (FF)

NOTA: Para medir o quão bem os axônios ciáticos inervam mais músculos^{proximais 34}.

1. Permita que os animais circulem livremente em uma grade de arame elevada na gaiola para se habituar ao ambiente. Um teste consiste em um total de 50 passos por membro posterior.
2. Marque quando os animais erram. Os critérios de pontuação são os seguintes.
   Pontuação 1: Culpa parcial. Puxada para trás antes que a perna caísse completamente até a coxa.
   Placar 2: Culpa total. Caiu completamente na virilha.
3. Calcule a pontuação composta de falha do pé de todos os membros posteriores feridos e não feridos de todos os animais em cada momento pós-operatório.
   Pontuação composta de faltas no pé = (# faltas parciais x 1) + (# faltas totais x 2)
4. Divida a pontuação composta de falha do pé por 50 (total de passos/membro) para obter a porcentagem de falha para cada membro posterior.
   % de falta no pé = Pontuação composta de falta no pé/50 (total de passos) x 100%
5. Subtraia as falhas dos pés no membro posterior lesionado da proporção de falhas no membro traseiro intacto para obter uma pontuação de assimetria para cada animal em um dado momento pós-operatório.
   Pontuação de assimetria por falha no pé (FF) = %FF (membro intacto) - %FF (membro lesionado)

4. Teste de comportamento - Espalhamento dos dedos dos pés

NOTA: Para avaliar a recuperação motora após lesão nervosa. De acordo com um estudo anterior, o teste motor de espalhamento dos dedos é mais sensível do que a análise da marcha para detectar a recuperação da função motora após lesão do nervo^{ciático 30}.

1. Cubra delicadamente o animal com um pedaço de pano e levante a cauda para observar claramente as patas traseiras.
   NOTA: Alternativa: Segure delicadamente a nuca do rato, ajeite a cauda, vire e faça o rato se contorcer para observar o movimento dos dedos.
2. Conceda a pontuação de abertura dos dedos da seguinte forma:
   Placar 2: Espalhamento total. Defina como uma separação completa, ampla e sustentada de todos os dedos por pelo menos 2 segundos.
   Pontuação 1: Espalhamento intermediário. Qualquer movimento que não alcance uma pontuação total de spreading. Treme levemente, ou se move parcialmente.
   Placar 0: Sem espalhar. Nenhum movimento.
   NOTA: Todas as avaliações comportamentais (ponto de alfinete, falha no pé e espalhamento dos dedos) foram verificadas duas vezes por um experimentador cego para grupos de tratamento. Os animais foram aleatoriamente designados para grupos de tratamento no momento da cirurgia, de acordo com o desenho usado em nosso estudo anterior (Ko et ^al.25), que incluía quatro condições experimentais (apenas Resutura, PEG, ML162, ML162 + PEG). O artigo atual apresenta dados do grupo ML162 + PEG, analisados independentemente mantendo o rigor experimental original.

5. Perfusão e processamento de tecidos para histologia

1. Anestesie profundamente o animal e realize perfusão transcárdica com soro tampado com fosfato (PBS) via ventrículo esquerdo.
2. Incenda o átrio direito para permitir o drenagem completa do sangue.
3. Imerga os tecidos coletados em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C durante a noite para fixação.
4. Lave os tecidos fixos três vezes com PBS e depois incube-os em PBS a 4 °C durante a noite.
5. Crioproteja os tecidos mergulhando-os em sacarose a 30% a 4 °C durante a noite.
6. Insuflo os tecidos em composto OCT, congele-os e corte a 12 μm de espessura usando um criostato.
7. Armazene blocos de tecido a -80 °C e criossecções a -20 °C até o uso.
8. Para a coleta do nervo ciático sozinha, omita a perfusão, pois o conteúdo sanguíneo não afeta significativamente a qualidade da imunocoloração nesses tecidos periféricos.

Results

O protocolo anterior de fusão^PEG-18 foi modificado para manter resultados cirúrgicos consistentes e minimizar danos nervosos causados pela sutura²⁵. Ao colocar o ponto para penetrar pelo nervo antes da transecção, o dano causado por beliscar com pinça ou furar com agulha após a transecção foi minimizado. Para testar o efeito de amarrar uma sutura que penetra um nervo em sua função, a sutura foi passada duas vezes por um nervo intacto e atad...

Discussion

Estudos de regeneração nervosa usando modelos de transeção nervosa são amplamente realizados no nervo ciático^{do camundongo 31,39}. No entanto, devido ao seu tamanho pequeno e textura macia, o nervo ciático do camundongo é difícil de manusear suavemente com instrumentos cirúrgicos, e o tecido é propenso a rasgar durante a sutura. O processo de microsutura, frequentemente envolvendo manipulação excessiva, pode levar à deformação e t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinça #55	Dumostar-Biologia	11295-51	Um em cada mão. Você vai precisar de dois para segurar um ponto de nylon 10-0.
Sutura de nylon 10-0	DemeTECH	NL761000,4F0P
Sutura de nylon 4-0	Matrix Wizard	0197
Anti-beta-tubulina	R& Sistemas D	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz tamanho 000			Para o teste de picada
CF488 alfa-bungarotoxina conjugada	Biotium	00005
Tesoura dissecada	Kent Scientific & nbsp;
Tesoura fina para sutura	Kent Scientific & nbsp;
Pinça de íris	Kent Scientific & nbsp;
K& Tapete Aquecedor para Animais Pequenos H	K& Produtos para pets H
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Kit cirúrgico para camundongos	Kent Scientific & nbsp;
Suporte de agulha	Kent Scientific & nbsp;
Polietilenoglicol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific & nbsp;		Para anestesia com isoflurano
Pinça divisora			Usado para expor o nervo ciático.