É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Senescência induzida por drogas em células hepáticas promove polarização de macrófagos M2: implicações para a hepatotoxicidade associada ao inibidor de tirosina quinase

895 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, estudamos a hepatotoxicidade causada por lapatinibe e neratinibe por meio da polarização de macrófagos acionada por SASP, que oferece uma compreensão mecanicista mais profunda além dos testes tradicionais de toxicidade. Essa abordagem demonstra como os hepatócitos senescentes influenciam as respostas imunes. Isso é particularmente valioso para avaliar os efeitos dos medicamentos a longo prazo e descobrir novos alvos terapêuticos para o gerenciamento da hepatotoxicidade induzida por medicamentos.

Resumo

Lapatinibe e neratinibe são inibidores de tirosina quinase (TKIs) aprovados para o tratamento de câncer de mama metastático HER2-positivo, mas seu uso clínico é limitado pela hepatotoxicidade. Dentro dos hepatócitos, as enzimas do citocromo P450 produzem metabólitos reativos dessas drogas, causando danos ao DNA, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo, que levam à lesão dos hepatócitos. Esse estresse celular desencadeia a senescência dos hepatócitos, um estado de parada do crescimento acompanhado pela secreção de fatores pró-inflamatórios e de remodelação tecidual chamados fenótipo secretor associado à senescência (SASP). O SASP modifica significativamente o microambiente hepático, influencia o comportamento das células imunológicas e piora os danos teciduais. Mostramos que o lapatinibe e o neratinibe induzem senescência e SASP na linhagem hepática HepG2. Além disso, o SASP dessas células senescentes promove a polarização semelhante a M2 dos macrófagos RAW264.7. Embora os macrófagos M2 estejam associados a respostas anti-inflamatórias e reparo tecidual, sua atividade excessiva ou prolongada pode levar a danos teciduais e fibrose. Nossos achados destacam um mecanismo pelo qual a senescência de hepatócitos induzida por TKI e SASP modulam a resposta imune e podem contribuir para a toxicidade hepática em pacientes com câncer de mama. Isso ressalta a importância de direcionar células senescentes ou fatores SASP para reduzir a toxicidade hepática e melhorar os resultados do tratamento, tornando a identificação de senotérmicos eficazes um foco vital de pesquisa. Não houve nenhum relato na literatura demonstrando o efeito do secretoma de células hepáticas induzido por TKI na polarização de macrófagos.

Introdução

O lapatinibe e o neratinibe, ambos inibidores de tirosina quinase (TKI) de moléculas pequenas, receberam a aprovação do FDA em 2007 e 2017, para o tratamento do câncer de mama metastático1. Essas drogas são conhecidas por inibir o receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2, HER22, um receptor tirosina quinase que é superexpresso em certos cânceres de mama3. Apesar de seu sucesso clínico, o lapatinibe e o neratinibe também estão associados a efeitos adversos, particularmente hepatotoxicidade 4,5. A lesão hepática aguda, manifestada por níveis elevados de aminotransferase, ocorre em aproximadamente 14% dos pacientes submetidos ao tratamento com lapatinibe ou neratinibe6. A hepatotoxicidade é amplamente atribuída ao metabolismo hepático dessas drogas, que envolve enzimas do citocromo P450 (CYP), predominantemente CYP3A4/5 7,8. Essas enzimas catalisam a formação de intermediários quinona-imina, que são eletrofílicos e altamente reativos 9,10. Esses metabólitos reativos, incluindo lapatinibe desalquilado O, lapatinibe N-desalquilado e N-hidroxi lapatinibe, neratinibe O-desalquilado e neratinibe N-desmetilado, podem formar adutos covalentes com macromoléculas celulares, interrompendo assim as funções celulares normais e, por fim, resultando em lesão hepática11.

Metabólitos reativos de lapatinibe e neratinibe também podem induzir estresse oxidativo, um gatilho chave da senescência celular12. A senescência celular é um estado de crescimento interrompido, mas metabolicamente ativo, caracterizado pela secreção de várias citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e proteases. Esse fenótipo secretor é conhecido como fenótipo secretor associado à senescência (SASP)13,14,15. O SASP pode afetar profundamente o microambiente circundante, muitas vezes promovendo inflamação e remodelação tecidual. No contexto da terapia do câncer, o SASP pode enriquecer a população de células-tronco cancerígenas e modificar a resposta imune para favorecer a sobrevivência do tumor16. Além disso, as citocinas inflamatórias podem exacerbar o dano tecidual. Especulamos que, em pacientes tratados com lapatinibe e neratinibe, a lesão hepática é parcialmente contribuída pela senescência induzida por TKI e pela produção pró-inflamatória de SASP.

Nossos experimentos demonstraram que o lapatinibe e o neratinibe induzem a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células hepáticas, levando a danos ao DNA e disfunção mitocondrial, que por sua vez desencadeia a senescência celular. Essa senescência pode contribuir para a hepatotoxicidade induzida por lapatinibe/neratinibe, liberando fatores SASP, que podem influenciar a polarização dos macrófagos.

Os macrófagos desempenham um papel crítico na resposta imune, e seu fenótipo funcional pode mudar em resposta a vários estímulos17,18. O fenótipo clássico de macrófagos M1 é tipicamente associado a respostas pró-inflamatórias, incluindo a produção de citocinas como TNF-α e IL-1β, e é geralmente considerado um marcador de inflamação aguda19,20. Em contraste, o fenótipo de macrófagos M2 está associado a fibrose, reparo tecidual21, imunossupressão e resposta à inflamação crônica22,23. As citocinas inflamatórias no SASP podem influenciar a polarização dos macrófagos, promovendo a conversão de macrófagos M1 para um fenótipo semelhante ao M223. Essa mudança na polarização pode ter implicações significativas para o microambiente imunológico, potencialmente levando à imunossupressão, progressão do tumor e remodelação da arquitetura do tecido.

Para investigar a polarização de macrófagos induzida por lapatinibe e neratinibe, usamos a linhagem celular RAW264.7, uma linhagem celular semelhante a macrófagos murinos comumente usada em pesquisas imunológicas24,25. As células RAW264.7 são derivadas de camundongos BALB/c e são amplamente utilizadas para estudar inflamação, fagocitose e respostas imunes25. Eles respondem a vários estímulos, incluindo lipopolissacarídeos (LPS), e são particularmente valiosos para estudar a função dos macrófagos, a produção de citocinas e a biologia do câncer26. Neste estudo, HepG2, uma linhagem celular de hepatoma humano, foi tratada com lapatinibe e neratinibe para mimetizar os efeitos hepatotóxicos observados nos pacientes. A linhagem HepG2 é frequentemente utilizada como modelo de estudo do metabolismo de drogas e hepatotoxicidade devido à sua origem humana e linhagem de carcinoma hepatocelular27. Após o tratamento das células HepG2 com os TKIs, os meios condicionados foram coletados e adicionados às células RAW264.7. As alterações fenotípicas subsequentes dos macrófagos foram monitoradas, com foco em saber se o tratamento induz uma mudança do fenótipo M1 pró-inflamatório para o fenótipo M2 imunossupressor.

A hepatotoxicidade induzida por drogas é geralmente estudada por meio de ensaios de citotoxicidade, avaliação de marcadores inflamatórios e uso de modelos animais. Comparado a estes, nosso método de examinar a hepatotoxicidade induzida por TKI lapatinibe e neratinibe por meio de fatores de fenótipo secretor associado à senescência (SASP) e sua influência na polarização de macrófagos tem várias vantagens. Primeiro, nosso método estabelece uma conexão entre os fatores SASP produzidos por células hepáticas senescentes induzidas por drogas e a imunidade inata, que pode ser ainda mais ligada à remodelação tecidual, inflamação crônica e carcinogênese28 , 29 , 30 , 31 . Os exames convencionais de toxicidade não podem nos ajudar a capturar as interações de curto prazo entre o fígado e as células imunológicas, nem podem revelar o impacto de longo prazo dos TKIs na inflamação e fibrose do fígado, particularmente no contexto da exposição crônica a medicamentos. Quando combinada com uma abordagem proteômica adequada para identificar constituintes SASP, essa técnica pode ajudar a identificar biomarcadores preditivos de hepatotoxicidade induzida por TKI e informar o desenho de intervenções terapêuticas para mitigá-la 29,30,31.

Para implementação, os pesquisadores devem utilizar sistemas de co-cultura ou meios condicionados com linhagens de células hepáticas e imunes, conforme descrito, e avaliar biomarcadores de senescência, bem como macrófagos M1 e M2. Este método é mais eficaz para avaliação de lesão hepática aguda ou crônica induzida por drogas ou para explorar estratégias para minimizar os efeitos fora do alvo das terapias contra o câncer 29,30,31.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Cultura de células

  1. Cultive células HepG2 em meio de Eagle modificado (MEM) com glicose alta com 10% de soro fetal bovino (FBS) e células RAW264.7 em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com glicose alta com 10% de FBS a 37 °C com 5% de CO 2 e atualize a cada 3 dias.
    NOTA: O uso de antibióticos não é recomendado, a menos que haja contaminação fúngica ou bacteriana. As células RAW264.7 são de crescimento muito rápido e devem ser eliminadas após 2 dias.

2. Ensaio MTT

  1. Contagem de células e revestimento de células
    1. Cultivar células HepG2 numa placa de cultura de 60 mm numa incubadora de cultura de células em meio de cultura completo (MEM + 10% FBS).
    2. Quando as células estiverem cerca de 80% confluentes, remova o meio de crescimento, lave rapidamente com 1 mL de 1x PBS e adicione 600 μL de tripsina 0,5x. Incube por 5-6 min.
      NOTA: Todas as etapas devem ser executadas em um gabinete de cultura de células BSL 2.
    3. Neutralize a tripsina adicionando 1,2 mL de meio de crescimento completo dentro do BSL 2.
      NOTA: Para evitar a tripsinização excessiva, deve-se adicionar mídia completa, com o dobro do volume de tripsina adicionada.
    4. Pegue a suspensão celular em um tubo de microcentrífuga (MCT) de 5 mL e coloque-a em pellet centrifugando a 180 g (1000 rpm) por 3-4 min em temperatura ambiente (RT).
    5. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio, pipete para misturar como uma suspensão de célula única e conte usando um hemocitômetro ao microscópio.
    6. Em seguida, coloque as células HepG2 em uma placa de 96 poços a 5000-7000 células por poço, em meio de crescimento completo, em triplicado para cada dose de medicamento e mantenha na incubadora por 12-16 h.
      NOTA: A confluência celular deve ser de 50-60% para o tratamento medicamentoso, e esta etapa deve ser realizada dentro do exaustor.
  2. Tratamento medicamentoso
    1. Prepare concentrações de trabalho gradualmente crescentes de lapatinibe e neratinibe em dimetilsulfóxido (DMSO) a partir da concentração de estoque (30 mM e 3,5 mM, respectivamente) dentro do exaustor. As concentrações finais são 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM para lapatinibe e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM para neratinibe em meio de crescimento (MEM + 5% FBS). Mantenha um controle sem tratamento para ambos os medicamentos.
    2. Descarte o meio anterior da placa de 96 poços contendo células e adicione 100 μL de meio com o medicamento e incube por 48 h dentro da incubadora.
  3. Coloração e quantificação
    1. Após 48 h, adicione 10 μL de corante brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT; 5 mg / mL), dissolva em solução salina tampão fosfato 1x (PBS) em cada poço e incube por pelo menos 2 h dentro da incubadora até que apareçam cristais de cor roxa.
      NOTA: Adicione o corante diretamente no meio que contém o medicamento e não incube as células com corante por mais de 4 h.
    2. Após a incubação, remova o corante, dissolva os cristais em 100 μL de DMSO em cada poço e incube por 15 min, seguido de obter a densidade óptica (OD) a 595 nm.
      NOTA: Esta etapa pode ser realizada fora do capô.

3. Ensaio de galactosidase SA-β

  1. Tratamento medicamentoso
    1. Plaquear células HepG2 em placas de 35 mm a uma densidade de 40 x 104 células por placa em três conjuntos, um para lapatinibe, um para neratinibe e um controle não tratado.
      NOTA: As etapas de contagem e revestimento de células são descritas na etapa 2.1.
    2. Adicione 1 μL de lapatinibe de 5 mM de estoque de trabalho e 1,43 μL de neratinibe de 3,5 mM de estoque principal em 2 mL de meio para fazer uma concentração final de 2,5 μM (dose subletal) de lapatinibe e neratinibe.
      NOTA: A dose subletal do medicamento é selecionada seguindo o gráfico de sobrevivência celular no ensaio MTT.
    3. Remova o meio anterior da louça e lave com 500 μL de 1x PBS uma vez, adicione o meio contendo o medicamento (dentro do exaustor) e mantenha por 48 h dentro da incubadora.
  2. Fixação e coloração
    1. Após 48 h, remova o medicamento, lave rapidamente com 500 μL de 1x PBS uma vez e fixe com 1,5 mL de formaldeído a 2% e glutaraldeído a 0,2% em 1x PBS por 10 min em RT.
    2. Após a fixação, lave as placas com 1 mL de 1x PBS duas vezes e certifique-se de que a solução fixadora seja removida corretamente. Adicione 1,5 ml de solução de coloração (40 mM de ácido cítrico/tampão Na-fosfato, 5 mM de K4[Fe(CN)6], 5 mM de K3[Fe(CN)6], 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mg/ml de X-gal em água autoclavada) e incube durante 8 h a 37 °C sem CO2.
      NOTA: O período de incubação pode variar de acordo com o tipo de célula; para HepG2, o período de incubação não deve exceder 8 h.
    3. Após a coloração, lave as placas rapidamente em 1 mL de 1x PBS duas vezes e capture imagens de campo claro com aumento de 20x e 40x com um microscópio de epifluorescência. Capture um mínimo de quatro a cinco campos para cada grupo de tratamento.
      NOTA: O volume do fixador e da solução de coloração varia de acordo com o tamanho da placa e todas as etapas podem ser executadas fora do exaustor.
  3. Quantificação de imagens
    1. Tire uma foto de um campo, conte o número total de células, bem como as células que mostram um sinal azul. Calcule manualmente a porcentagem de células com sinal azul. Calcule pelo menos quatro imagens, faça a média, plote em um gráfico de planilha e realize um teste t.

4. Detecção de ROS

  1. Plaqueamento celular e tratamento medicamentoso
    1. Colocar células HepG2 em placas com fundo de vidro de 35 mm com uma densidade de 40 x 104 células por placa em três conjuntos: um para lapatinibe, um para neratinibe e um controle não tratado.
      NOTA: As etapas de contagem e revestimento de células são descritas na etapa 2.1.
    2. Siga a mesma estratégia de tratamento descrita no passo 3.1.
  2. Coloração e imagem
    1. Após 48 h de tratamento, adicione 2 μM de reagente vermelho escuro ROX de células (estoque de 5 mM), 1 μM de Mito Tracker Green (estoque de 1 mM) por 30 min e contra-coloração com corante de coloração nuclear Hoechst de 500 nM (estoque de 500 μM).
      NOTA: O corante deve ser adicionado dentro do capuz e a exposição direta à luz deve ser evitada. A contracoloração é feita adicionando corante de coloração nuclear Hoechst durante a administração de outros corantes.
    2. Após 30 min, remova o corante e lave com 1x PBS para remover o excesso de corante e imagem com um microscópio confocal com ampliação de 100x (emersão de óleo, comprimento de onda de excitação de 640 nm, 488 nm e 405 nm, respectivamente).
  3. Quantificação de imagens
    1. Quantifique o sinal da célula ROX vermelha usando o software Fiji ImageJ e compare-o com o sinal do controle não tratado. Use o MitoTracker verde para indicar que o sinal se origina das mitocôndrias. Depois de plotar os gráficos de barras com valores médios, realize um teste t.

5. Coleta de mídia condicionada (CM)

  1. Trate as células HepG2 com 2,5 μM de lapatinibe ou neratinibe por 48 h (estratégia de tratamento semelhante à etapa 3.1, exceto para este experimento, coloque 70 x 104 células em um prato de 60 mm).
  2. Após 48 h, remova o medicamento e lave com 500 μL de 1x PBS uma vez.
  3. No dia máximo de senescência (após 48 h de tratamento medicamentoso), adicione 4 mL de meio MEM sem soro (sem FBS ou quaisquer outros suplementos) às células tratadas com medicamentos, bem como ao controle não tratado por 48 h.
    NOTA: O volume do meio sem soro dependerá do tamanho da placa.
  4. Em seguida, recolher os meios isentos de soro contendo todo o secretoma, denominados meios condicionados, e conservar a -80 °C para utilização futura.
    NOTA: Após a coleta do CM, ele deve ser centrifugado por 5 min a 2800 g (4000 rpm) para remover células mortas e outros detritos celulares. As células RAW264.7 são tipicamente cultivadas em DMEM, mas o CM é coletado em MEM de acordo com as condições de cultura de HepG2. Para manter a compatibilidade, o meio condicionado deve ser misturado com DMEM sem soro na proporção de 1:1 antes da incubação de RAW264.7.

6. Polarização M1 / M2 em RAW264.7

  1. Revestimento celular
    1. Siga a contagem de células e o plaqueamento celular conforme descrito na etapa 2.1, exceto a etapa de tripsinização. Enquanto tripsiniza as células RAW264.7, adicione 600-700 μL de tripsina 0,5x, incube por 15-20 min na incubadora e, para neutralizar a tripsina, adicione 2 mL de meio de crescimento (DMEM + 10% FBS) e coloque 70 x104 células em um prato de 60 mm em três conjuntos: lapatinibe, neratinibe e um controle não tratado.
  2. Indução RAW264.7
    1. Remova o meio de crescimento regular, lave com 1 mL de 1x PBS uma vez e adicione o CM correspondente por 48 h.
      NOTA: Antes de adicionar o CM, certifique-se de condicioná-lo com DMEM sem soro na proporção de 1:1, pois as células RAW264.7 crescem em DMEM, portanto, manter as células em MEM causará estresse, o que pode prejudicar o resultado. A cultura de RAW264.7 em CM (meio sem soro) por 48 h também pode causar estresse; Nesse caso, a incubação de 24 a 30 horas pode ser feita antes da coleta dos dados.
    2. Após a incubação, descarte o CM, lave com 1 mL de 1x PBS, adicione 600 μL de tripsina em cada placa, incube por 10 min e, em seguida, aplique pellets a 180 g (1000 rpm) por 3 min em RT. Use o pellet para purificação de proteínas ou armazene-o a -80 °C para uso futuro.
      NOTA: O tempo de tripsinização varia de acordo com o tipo de célula e a centrifugação não é recomendada acima de 180 g.
  3. Isolamento de proteínas e western blotting
    1. Prepare o tampão de lise misturando o tampão de lise do ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) e o coquetel de inibidores de protease na proporção de 100:1. Adicione o tampão de lise ao pellet celular, ressuspenda e incube no gelo por 30 min.
      NOTA: O volume do tampão de lise varia de acordo com o tamanho da paleta de células e a lise pode ser feita fora do capô. Se o pellet for armazenado a -80 °C, primeiro descongele o pellet no gelo, dê uma pequena centrifugação e remova qualquer meio residual.
    2. Após a incubação, girar o lisado celular a 20.000 g por 30 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante e proceder à Western blot ou conservá-lo a -20 °C para utilização futura.
    3. Prepare a amostra de proteína tomando 35-40 μg de proteína, adicione 1x corante de carga, aqueça por 5-6 min a 95 °C, execute SDS-PAGE (gel de acrilamida a 10% e 12%) a 90 V e transfira para a membrana de nitrocelulose.
    4. NOTA: Para informações mais detalhadas sobre o western blot, consulte Joubert et al.32.
    5. Verificar a expressão dos marcadores de polarização M1 e M2, através do desenvolvimento do blot usando um revelador de peroxidase de rábano (HRP), iNOS (M1) e arginase1 (M2), respectivamente, usando anticorpos anti-NOS2 e anti-ARG1.
      NOTA: A concentração para ambos os anticorpos primários, anti-NOS2 e anti-ARG1 é de 1:1000, e o anticorpo secundário anti-coelho é de 1:10.000.
  4. Polarização de macrófagos usando LPS e IFN-γ
    1. Placa 70 x 104 células RAW264.7 em dois pratos de 60 mm.
      NOTA: O procedimento de galvanização é semelhante ao passo 6.1.
    2. Após 12-16 h, misture 4 μL de 1 μg / mL de lipopolissacarídeo (LPS, concentração estoque é 1 mg / mL) e 1,33 μL de interferon-γ 33 ng / mL (IFN-γ, concentração estoque é 100 μg / mL) em 4 mL de meio de crescimento (DMEM + 10% FBS) e adicione ao RAW264.7 pré-plaqueado, mantendo um controle não induzido.
    3. Após 48 h, coletar o pellet celular via tripsinização, isolar a proteína, executar um western blot e verificar a expressão de iNOS (M1) e ARG1 (M2), respectivamente, usando anticorpos anti-iNOS e anti-ARG1.
      NOTA: Todos os resíduos de cultura de células e resíduos bioquímicos devem ser descartados em uma lixeira de risco biológico, devidamente autoclavados e depois descartados.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Uma série de ensaios foi conduzida para avaliar o impacto do TKI lapatinibe e neratinibe nas células do carcinoma hepatocelular (HepG2) e seus efeitos parácrinos a jusante nos macrófagos. As células HepG2 foram tratadas com concentrações variadas de lapatinibe ou neratinibe, e a viabilidade celular foi medida em 48 h usando o ensaio MTT (Figuras 1A, B). Com base nas curvas de sobrevida, uma dose subletal de 2,5 μM foi esc...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O presente estudo explora os efeitos indiretos do tratamento com lapatinibe ou neratinibe na polarização de macrófagos por meio de meios condicionados coletados de células hepáticas HepG2 tratadas com TKI. Utilizando macrófagos RAW264.7, observamos um fenótipo M2 após a exposição ao meio condicionado, conforme indicado pela regulação positiva de ARG1. Morfologicamente, os macrófagos tratados exibiram uma forma aumentada e alongada característica, apoiando ainda mais a indução de um estad...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Shiv Nadar Institution of Eminence pelo suporte de infraestrutura. Este estudo é financiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia concessão CRG/2022/003242.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linha celular de HepG2NCCSLinha celular aderente
Linha celular RAW264.7NCCSLinha celular aderente
DMEM (Eagle Medium Modificado da Dulbacco)HimídiaAT066Alta glicose, pó
MEM (Eagle Médio ModificadoGibco611100-053Pó
PBS (Soro Tamponador de Fosfato)HimídiaTS1101Pó
Solução de Tripsina-EDTAHimídiaTCL007Solução
FBS (Soro Bovino Fetal)HimídiaRM1112Líquido
Tinta MTTHimídiaTC191Pó
LapatinibSelleckchemS2111Pó
NeratinibeCompanhia Química das Ilhas Cayman18404Pó
DMSO (Dimetil Sulfóxido) HimídiaTC185Solução
Formaldeído RankemF0080Solução
GlutaraldeídoSigma-aldrich340855Solução
Ácido Cítrico Monohidratado, PuroHimídiaGRM229Pó
Fosfato de sódio dibásico anidro  HimídiaMB024Pó
Ferrocianeto de potássio, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp;P-236-500
Ferricianeto de potássio, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp;P-232-500
NaClSRL41721Pó
MgCl2 hexahidratadoHimídiaGRM-1068Pó
X-GalSRL45904Pó
LipopolissacarídeoSigma-aldrichL6529
Interferon-&gamma Recombinante Humano;HimídiaCF040-20MCG
Reagente vermelho profundo ROX de célulasTermo Fisher ScientificC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Pó
MitoTRACKER VerdeInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Pó
Anticorpo anti-ARG1AfinidadeDF6657Solução, MW calculado - 35kDa, MW observado - 65kDa
Anticorpo anti-NOS2Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01Solução, MW calculado - 130kDa, MW observado - 65kDa
Anticorpo anti-iNOSAfinidadeSolução, MW calculado - 130kDa, MW observado - 120kDa
Anticorpo anti-GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Solução
Anticorpo Anti-CoelhoCompanhia Química das Ilhas Cayman10004301Solução
Membrana de nitrocelulose  Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Número do produto)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Biociências  786-003
Antenas de 60mmNUCK150462
Placa de 96 poços,  NUCK165306
Incubadora de Cultura Celular  Thermo Fisher Scientific371
Microscópio  1. Microscópio Invertido LEICA     2. Microscópio Confocal Nikon  1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  Ambos são números de modelo
Sistema de Imagem iBrightInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (número do modelo)
Leitor de placasBio-RADLeitor de Microplacas iMark
Centrífuga Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (número do modelo)

Referências

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Senescência de Células HepáticasInibidores de Tirosina QuinaseMecanismos de HepatotoxicidadeFenótipo Secretor Associado à SenescênciaCélulas HepG2Meio CondicionadoEspécies Reativas de OxigênioWestern Blotting
Senescência induzida por drogas em células hepáticas promove polarização de macrófagos M2: implicações para a hepatotoxicidade associada ao inibidor de tirosina quinase
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.