Artigo de método

Usando listas de genes diferencialmente expressos em humanos para realizar análise de enriquecimento de vias a jusante e priorização de alvos

DOI:

10.3791/68732

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3 de outubro de 2025

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1Department of Microbiology and Molecular Biology, Brigham Young University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente trabalho descreve um protocolo para executar o algoritmo Pathway2Targets, um script R que prevê e prioriza alvos terapêuticos com base no perfil das vias de sinalização intracelular geradas pela comparação de amostras de caso versus controle de um experimento de sequenciamento de RNA em massa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um pipeline computacional de várias etapas para identificar potenciais alvos terapêuticos a partir de dados de sequenciamento de RNA, incluindo instalação de software relevante, verificação de configuração e análise de expressão diferencial usando edgeR. Em seguida, mostramos como utilizar o algoritmo de análise de impacto da via de sinalização (SPIA) para prever vias estatisticamente significativas. Para garantir a confiança nos resultados, nos concentramos em caminhos significativos (p < 0,05) para reduzir os resultados falsos positivos. Ao contrário dos conjuntos de genes tradicionais, essas vias refletem redes de interação proteína-proteína, oferecendo insights mecanicistas sobre processos celulares como o ciclo celular, resposta imune e metabolismo. Esses caminhos são então analisados usando o algoritmo Pathway2Targets, que faz interface com o banco de dados OpenTargets.org por meio de uma interface de programação de aplicativos (API). Este algoritmo incorpora uma nova abordagem de ponderação que pontua alvos de medicamentos conhecidos dentro das vias identificadas, ao mesmo tempo em que fornece progresso em tempo real. O tempo de execução depende da complexidade do caminho e da densidade do alvo. A saída consiste em dois arquivos classificados. O primeiro arquivo contém uma lista de alvos de medicamentos previstos e suas pontuações ponderadas, enquanto o segundo consiste em vários detalhes para a terapêutica associada. Juntos, esse pipeline facilita a priorização de alvos e tratamentos drogáveis no contexto de perfis de expressão gênica específicos da doença.

Introdução

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O sequenciamento de RNA em massa permite a comparação dos níveis de expressão de milhares de genes em uma população de células case versus uma população de células de controle. Os experimentos são normalmente projetados para incluir pelo menos amostras triplicadas, idealmente réplicas biológicas, embora réplicas técnicas possam ser suficientes. Esse projeto leva em conta a variabilidade biológica e reduz o impacto de amostras discrepantes. A análise desses padrões de expressão fornece informações detalhadas sobre o efeito da doença de interesse nos processos celulares normais e pode potencialmente permitir a previsão de terapêuticas relevantes.

O pré-processamento de dados de sequenciamento de RNA em massa normalmente inclui: controle de qualidade de leituras de sequenciamento (para repetições, adaptadores de sequenciamento, GC%, etc.), corte de leitura e remoção de adaptador, mapeamento/quantificação de leitura 1,2,3 e análise de expressão diferencial 4,5,6. Felizmente, uma variedade de processos analíticos foi automatizada para reduzir o trabalho manual associado a essas etapas 7,8,9. Após a conclusão do pré-processamento, as análises downstream comumente realizadas incluem análise de super-representação funcional com ontologias de genes, enriquecimento de vias de sinalização e variação no splicing. Essas análises a jusante resumem e facilitam a interpretação dos resultados da expressão diferencial em um nível mais alto de granularidade do que as listas de genes sozinhas.

Várias ferramentas foram desenvolvidas com o objetivo de redirecionar a terapêutica existente para um tipo ou subtipo de doença bem definido. Isso é obtido treinando o algoritmo em tipos de dados ômicos múltiplos para a doença pretendida. Infelizmente, esses esforços para melhorar a especificidade e a sensibilidade em uma doença pretendida geralmente tornam o uso das ferramentas em contextos mais gerais abaixo do ideal10,11. Outro conjunto de ferramentas é mais amplamente aplicável aos casos em que os perfis de expressão gênica são combinados com assinaturas existentes de expressão gênica 12,13 ou com os efeitos quantificados da terapêutica atual14,15. No entanto, essas ferramentas mais amplamente aplicáveis geralmente atingem especificidade e sensibilidade reduzidas em uma ampla gama de doenças e/ou foram treinadas com dados desatualizados.

Em contraste, o algoritmo Pathway2Targets foi aplicado anteriormente para prever potenciais alvos terapêuticos em linfoma de células B, periodontite, câncer de mama estrogênio-positivo, câncer de mama triplo-negativo e vírus chikungunya 16,17,18,19,20,21. Os resultados desses estudos demonstram que essa ferramenta é capaz de prever alvos robustos e biologicamente relevantes. Impressionantemente, o Pathway2Targets previu 392 alvos potenciais de medicamentos para câncer de mama triplo-negativo, entre os quais 60 foram testados em ensaios clínicos; bem como 828 medicamentos individuais para TBNC, sendo 37 testados17. No estudo do linfoma, esse algoritmo previu 915 medicamentos, 461 dos quais são aprovados pela FDA19.

O objetivo do presente trabalho é descrever um protocolo computacional que permitirá que mais pesquisadores, que podem se beneficiar do acesso a instruções mais descritivas sobre a execução de programas na linha de comando, usem efetivamente o algoritmo Pathway2Targets recentemente desenvolvido (Figura 1). O Pathway2Targets prevê alvos para uma determinada condição combinando dados de expressão diferencial, associações gene-doença, informações de ensaios clínicos, dados de alvos públicos22, informações de caminhos e outras métricas. É importante ressaltar que esse algoritmo incorpora um esquema de ponderação exclusivo e personalizável, que permite aos usuários determinar as ~20 métricas relacionadas ao alvo que preferem enfatizar em suas análises, como número de associações de doenças, número de vias de sinalização, número de medicamentos exclusivos, número de terapêuticas em cada fase de ensaios clínicos, etc.23. Como exemplo de caso de uso para este protocolo, analisaremos novamente um conjunto de dados de câncer colorretal existente24.

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Protocolo

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Os dados de sequenciamento de RNA em massa analisados neste estudo foram adquiridos de bancos de dados disponíveis publicamente (NCBI Gene Expression Omnibus e Sequence Read Archive) 25 , 26 . Como tal, os coletores de dados originais garantiram a coleta ética e apropriada dessas amostras de seres humanos informados e consentidos.

1. Baixe e instale o software R

  1. Instale o R (versão 4.0 ou posterior) clicando em um link apropriado do https://cran.r-project.org/mirrors.html CRAN (Comprehensive R Archive Network) e use a opção 0-Cloud e siga as instruções apropriadas para o sistema operacional do computador. Este processo geralmente leva de 5 a 10 minutos.
  2. Instale o R Studio (versão 2024 ou posterior) do https://posit.co/download/rstudio-desktop/ e siga as instruções na página de download. A instalação do RStudio geralmente leva ~ 10 minutos.
    NOTA: A instalação do RStudio é opcional (mas altamente recomendada), pois fornece um ambiente de desenvolvimento integrado que simplifica a execução do código, oferece realce de sintaxe, facilita o gerenciamento de pacotes e ajuda os usuários a visualizar as saídas, o que é especialmente benéfico para usuários menos familiarizados com o R.

2. Baixe e instale scripts R para ferramentas relevantes

  1. Baixe os seguintes scripts R necessários do repositório GitHub https://github.com/bpickett/Pathway2Targets. Este URL é apenas para referência.
  2. Baixe os scripts usando os links abaixo: SPIA versão 1.0 (baixe clicando em Baixar arquivo bruto): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd (ID de confirmação: 60fcd46); Pathway2Targetsversão 3.1 (baixe clicando em Baixar arquivo bruto): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R (ID de confirmação: 8e4c7c8)

3. Baixe bibliotecas R para ferramentas relevantes

  1. Ao executar o R (no RStudio ou em uma janela de terminal), insira os comandos a seguir para baixar e instalar as bibliotecas R adicionais necessárias para executar o software.
    1. Inicie o programa RStudio. Por padrão, o painel do console está localizado no canto inferior esquerdo do RStudio. Clique em qualquer lugar dentro da janela do painel do console e um cursor de digitação deve aparecer na parte inferior após o símbolo de seta ">".
    2. Copie e cole o seguinte comando na área do console e pressione a tecla Enter :
      install.packages(c("RCurl", "stringr", "jsonlite", "httr")). 
      Uma vez instalado com sucesso, aparecerá uma mensagem de status que diz "Os pacotes binários baixados estão em ....".
    3. Copie e cole o seguinte comando na área do painel do console e pressione a tecla Enter .
      BiocManager::install(c("SummarizedExperiment", "EnrichmentBrowser", "biomaRt", "org.Hs.eg.db")).
      Uma vez instalado com sucesso, aparecerá uma mensagem semelhante que diz "Os pacotes binários baixados estão em ....".
      NOTA: O primeiro conjunto de bibliotecas (etapa 3.1.1) consiste em bibliotecas R típicas, enquanto o segundo (2.1.2) consiste em bibliotecas BioConductor. Como tal, os comandos precisam ser inseridos separadamente. As versões apropriadas dessas bibliotecas devem ser baixadas automaticamente com base na versão do R instalada no computador. Cada um desses comandos deve levar ~5 minutos para ser concluído.

4. Processamento de arquivos

  1. Baixe o arquivo de saída de expressão diferencial gerado pelo edgeR calculado anteriormente (no formato RDS), gerado pelo software ARMOR (ou similar), para o computador local. O nome desse arquivo geralmente é edgeR_dge.rds.
  2. Revise manualmente os resultados de edgeR (ou uma expressão diferencial semelhante) para iniciar a interpretação biologicamente relevante dos resultados. Para fazer isso, filtre, no mínimo, um valor p corrigido < 0,05 e, potencialmente, o valor absoluto do valor de alteração de log2 > 1,5. Se estiver testando o software, um arquivo edgeR_dge.rds de amostra pode ser encontrado no Zenodo aqui: https://doi.org/10.5281/zenodo.15186609
    NOTA: A revisão dos genes que permanecem nesses resultados filtrados pode começar a explicar o(s) mecanismo(s) molecular(is) subjacente(s) do fenótipo associado às amostras de caso (em comparação com as amostras de controle). É importante reconhecer que a capacidade de interpretar listas de genes de maneira imparcial é extremamente difícil devido ao número relativamente baixo de símbolos genéticos que podem ser rapidamente lembrados. Como tal, a análise da via de sinalização é uma maneira útil de resumir os genes filtrados com base em como eles interagem e/ou se comunicam uns com os outros na célula.
  3. O pré-processamento de dados de RNA-seq em massa pode levar de várias horas a dias de tempo de computação, dependendo do tamanho do conjunto de dados que está sendo analisado. Salve esse arquivo .rds na pasta Downloads do computador. Observe que esse tipo de arquivo .rds não é legível por humanos.

5. Execute o algoritmo de enriquecimento da via SPIA

  1. Se estiver executando usando R, use o script R do GitHub ou do Arquivo de Codificação Suplementar 1. Digite o seguinte comando, supondo que o arquivo edgeR_dge.rds esteja na pasta Downloads
    Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd ~/Downloads/edgeR_dge.rds
    1. Se o arquivo edgeR_dge.rds estiver em uma pasta (ou diretório) diferente, substitua esse comando pelo seguinte
      Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd
  2. Se estiver executando usando o RStudio, use o script R do GitHub ou o Arquivo de Codificação Suplementar 2.
    NOTA: Na linguagem R, adicionar o símbolo # da hashtag antes de uma linha de código o desativa temporariamente. Os scripts foram originalmente projetados para serem executados em um ambiente de linha de comando em vez do RStudio. Habilitar ou desabilitar determinadas linhas de código é a maneira mais fácil de reconfigurar a configuração dos arquivos de entrada.
    1. Abra o script SPIA_Code.Rmd no R Studio clicando na opção Abrir Arquivo no menu Arquivo e selecionando o nome do script. Na janela de código do R Studiopor padrão, ela está localizada no painel superior esquerdo.
    2. Selecione todas as linhas de código no arquivo e clique no botão Executar (ou Executar Linha(s) Selecionada(s)), localizado acima e à direita da janela de código. Uma execução bem-sucedida produzirá um arquivo com nome semelhante a
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      no diretório de download. Este arquivo conterá as vias de sinalização estatisticamente significativas
    3. Revise o arquivo com os resultados estatisticamente significativos manualmente abrindo-o como uma planilha. O conteúdo deste arquivo deve ajudar a resumir as cascatas de sinalização intracelular subjacentes que são significativamente representadas pelos genes diferencialmente expressos.
      NOTA: A conclusão do cálculo de caminhos significativos pode levar de ~ 30 minutos a várias horas, dependendo da intensidade do sinal no conjunto de dados que está sendo analisado. Quando o programa estiver em execução, as mensagens de progresso em tempo real serão atualizadas continuamente na janela do console. As mensagens atualizadas com frequência mostram que o programa está funcionando com sucesso. Descrições mais detalhadas do que ocorre nesta etapa podem ser encontradas no repositório GitHub: https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    4. Se estiver usando o arquivo de entrada de exemplo, o arquivo de saída desta etapa será encontrado na pasta Downloads e será nomeado
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv.
      Esse estilo de nomenclatura reflete o nome do arquivo de entrada, o processo que está sendo executado e a saída. Isso evita confusão na identificação de arquivos se mais de um for processado.
    5. Ajuste outros parâmetros conforme descrito abaixo.
      1. Os parâmetros padrão para o algoritmo SPIA nesta biblioteca são 1.000 permutações. Aumente isso para 2.000 permutações para melhorar a confiança nos resultados. Ajuste o número de permutações nas linhas 84 e 85 deste script alterando o perm = 2000 para o número desejado de permutações. Ajuste outros parâmetros conforme descrito abaixo.
      2. Ajustar a abordagem de correção do valor-p nas linhas 84 e 85 removendo o método padj.method = 'BH'. Isso não corrigirá os valores-p, o que pode tornar os resultados falso-positivos mais prováveis.

6. Executando o algoritmo de priorização de destino Pathway2Targets na saída SPIA

  1. Se estiver executando o R, use o script R do GitHub ou do Arquivo de Codificação Suplementar 3. Use o comando a seguir para invocar esse algoritmo
    Rscript --vanilla Pathway2Targets.R
  2. Se estiver executando usando o R Studio, use o script R do GitHub ou o Arquivo de Codificação Suplementar 4. Abra o script Pathway2Targets.R no R Studio clicando na opção Abrir Arquivo no menu Arquivo e selecionando o nome do script.
    1. Na janela de código RStudio (painel superior esquerdo), substitua o nome do arquivo na linha 22 pelo nome do arquivo de resultados do SPIA, como (dos dados de exemplo)
      infile <- "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv"
    2. Selecione todas as linhas de código no arquivo e clique no botão Executar , localizado acima e no lado direito da janela de código. As mensagens de status de progresso em tempo real serão exibidas continuamente no painel inferior direito. Uma execução bem-sucedida produzirá um arquivo chamado (semelhante a)
      "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv"       no diretório de download. O estilo de nomenclatura dos arquivos reflete a entrada, o processo e a saída
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23
      _10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      é a entrada para esse arquivo.
      NOTA: Esta etapa pode levar de uma a várias horas, dependendo do número de vias de sinalização com um valor p significativo, do número de produtos gênicos nessas vias significativas e do número de produtos gênicos que são alvos conhecidos de drogas.
  3. Alguns parâmetros para o algoritmo Pathway2Targets podem ser ajustados. Especificamente, ajuste os valores do multiplicador (linhas 31 a 38 do script) para personalizar o esquema de ponderação para cada métrica. Descrições mais detalhadas do que ocorre nesta etapa podem ser encontradas no repositório GitHub correspondente: https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    NOTA: Para referência, no exemplo, a identificação de medicamentos em potencial de 132 vias, consistindo em centenas de alvos individuais, leva aproximadamente 2 horas para ser concluída. Com base nessa métrica, é razoável estimar o tempo total de computação.

7. Abra arquivos de resultados para alvos e terapêuticas priorizados

  1. O arquivo com alvos priorizados e suas métricas será gerado. Para os arquivos de entrada de exemplo, use o arquivo de saída encontrado na pasta Downloads, chamado:
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv
    1. Esse arquivo será, por padrão, classificado com os destinos classificados em ordem decrescente com base na métrica ponderada personalizada. Revise manualmente o arquivo de saída para garantir que os resultados sejam biologicamente relevantes e que os alvos sejam lógicos para o fenótipo que está sendo avaliado.
  2. O arquivo com terapêuticas priorizadas e suas métricas também será gerado. Para os arquivos de entrada de exemplo, use o arquivo de saída na pasta Downloads, chamado:
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-Treatments.tsv
    1. Da mesma forma, esse arquivo de saída também será, por padrão, classificado com a terapêutica para os vários alvos (na etapa 7.1.1) classificada em ordem decrescente com base na métrica ponderada. Revise o arquivo manualmente com conhecimento prévio suficiente do sistema biológico subjacente para determinar se experimentos adicionais são justificados. Espera-se que várias terapêuticas possam ter a mesma métrica ponderada, uma vez que muitos dos alvos serão afetados por mais de uma terapêutica no mercado.

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Resultados

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A configuração descrita nas etapas 1 a 3 do protocolo é necessária para permitir a execução subsequente do SPIA e do algoritmo Pathway2Targets. Ao final de cada etapa, será gerada uma mensagem para confirmar a instalação bem-sucedida do software. A etapa 4 consiste em baixar um conjunto existente de resultados de expressão diferencial, que pode incluir o arquivo de exemplo fornecido, um arquivo existente diferente ou pré-processar um conjunto de dados de sequenciamento de RNA personaliza...

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Discussão

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As etapas 1 a 3 do protocolo referem-se especificamente à instalação do software, scripts e dependências subjacentes do R para executar com êxito o software downstream. Uma lista detalhada das bibliotecas R necessárias está disponível (Tabela Suplementar 4). A etapa 4 do protocolo envolve a recuperação de um arquivo de dados R (formato .rds), que contém a saída de uma análise de expressão diferencial. O software comum para esta etapa envolve edgeR6

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Divulgações

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A BEP tem participação na Pythia Biosciences. Nenhum financiamento externo foi adquirido para o trabalho atual.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Escritório de Pesquisa em Computação da Universidade Brigham Young por sua experiência e apoio ao acessar o ambiente de computador de alto desempenho do campus.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Roteiro R Pathway2TargetsUniversidade Brigham Young (Laboratório Pickett)Versão 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R
R SoftwareRede Abrangente de Arquivos R (CRAN)Versão: 4.4.3https://cran.r-project.org
R Studio Desktop SoftwarePostularVersão: 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/
Script SPIA RUniversidade Brigham Young (Laboratório Pickett)Versão: 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd

Referências

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Differential Gene ExpressionRNA SequencingSPIA AlgorithmPathway2TargetsDrug Target PredictionProtein Interaction NetworksTherapeutic Target IdentificationDisease Gene Profiles

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