Artigo de método

Monitoramento da absorção e localização de compostos orgânicos em tecidos vegetais usando um ensaio hidropônico de radiomarcação 14C e imagem de fósforo

DOI:

10.3791/68735

10 de outubro de 2025

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um método para estudar a remediação mediada por plantas usando 14contaminantes orgânicos marcados com C. Ele descreve a preparação de plantas hidropônicas, a absorção de radiomarcadores e imagens de fósforo para rastrear a absorção, translocação e metabolismo de contaminantes. A técnica oferece uma ferramenta valiosa para avaliar o potencial de fitorremediação em várias espécies de plantas e poluentes ambientais.

Resumo

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A fitorremediação, o uso de plantas para mitigar contaminantes ambientais, oferece uma abordagem sustentável e econômica para a limpeza de locais contaminados. O desenvolvimento de métodos que auxiliem na elucidação dos mecanismos por trás da absorção de plantas e do metabolismo de poluentes é crucial para melhorar as práticas de fitorremediação. Este artigo descreve um método para avaliar a absorção e transformação de contaminantes orgânicos por plantas usando compostos radiomarcados. 14Compostos orgânicos marcados com C, como os ácidos C-naftênicos modelo 14, são usados para rastrear sua absorção, translocação, localização e metabolismo nos tecidos vegetais. Anteriormente, usamos esse método com várias espécies de plantas, incluindo Elymus trachycaulus e Salix interior. Essas observações são corroboradas aqui com a planta modelo, Arabidopsis thaliana, cultivada hidroponicamente em soluções modificadas de Hoagland. A captação de radiomarcadores foi monitorada por meio de contagem de cintilação líquida e imagens de fósforo, o que permite a visualização e quantificação de compostos radiomarcados nos tecidos vegetais. Este método detalha a preparação de materiais vegetais, o uso de compostos radiomarcados e o processo de análise da distribuição e destino dos contaminantes dentro das plantas. O método também inclui estratégias para avaliar a exsudação do composto e permite a avaliação da absorção da planta e da translocação de contaminantes ambientais. Essa abordagem fornece informações sobre os processos de remediação mediados por plantas e pode ser aplicada ao estudo de uma ampla gama de contaminantes ambientais e espécies de plantas.

Introdução

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A biorremediação é uma tecnologia de remediação mediada por entidades biológicas, como plantas e microrganismos. A fitorremediação, que utiliza plantas ou produtos vegetais para remover contaminantes do ambiente, pode complementar ou servir como uma alternativa à remediação de base microbiana, superando algumas das limitações do uso de microrganismos isolados 1,2,3,4. A fitorremediação é econômica devido aos processos solares das plantas, onde os contaminantes são absorvidos por suas raízes ou brotos e transportados entre células e tecidos, onde podem ser metabolizados, sequestrados ou volatilizados5. As plantas mais eficazes para fitorremediação são tipicamente espécies resilientes e tolerantes ao estresse, com altas taxas de transpiração, rápida produção de biomassa e sistemas radiculares profundos, como os encontrados nos gêneros Populus e Salix 6. Como organismos sésseis, as plantas desenvolveram diversas vias metabólicas para lidar com compostos tóxicos em seu ambiente1. Isso os dota de uma ampla gama de genes e processos bioquímicos que aumentam sua capacidade de gerenciar contaminantes.

A estrutura de fitodegradação, proposta pela primeira vez por Sandermann et al. (1977)7, descreve um processo de três fases para a desintoxicação de contaminantes mediada por plantas: transformação, conjugação e compartimentalização. Em cada fase, os contaminantes sofrem modificações enzimáticas que aumentam sua hidrofilicidade, reduzem sua toxicidade e os tornam mais passíveis de sequestro ou mineralização adicional4. No entanto, como as plantas dependem principalmente do dióxido de carbono atmosférico para a fixação de carbono, sua capacidade de mineralizar totalmente os contaminantes orgânicos é potencialmente limitada. Os contaminantes podem, em vez disso, ser sequestrados em vacúolos ou paredes celulares (fitosequestro) ou volatilizados na atmosfera (fitovolatilização)1.

Um dos principais desafios na pesquisa de fitorremediação é detectar se as plantas podem absorver e transformar contaminantes orgânicos de seu ambiente1. Os métodos tradicionais de detecção muitas vezes não conseguem rastrear com precisão os caminhos de absorção e translocação de contaminantes, dificultando a avaliação da capacidade de uma planta de remediar poluentes específicos 1,5. Os compostos orgânicos de carbono-14 (14C) radiomarcados oferecem uma solução poderosa para esse problema. Ao expor as plantas a 14contaminantes marcados com C, os pesquisadores podem rastrear a incorporação de carbono radiomarcado nos tecidos vegetais, fornecendo informações precisas sobre a absorção, translocação e transformação do contaminante. Essa técnica permite a identificação de espécies vegetais capazes de remediar poluentes orgânicos específicos e oferece uma maneira confiável de avaliar as vias fisiológicas envolvidas. Em última análise, o uso de 14compostos marcados com C avança nossa compreensão do potencial de fitorremediação, apoiando o desenvolvimento de estratégias mais eficazes e direcionadas para a remediação ambiental.

Este artigo descreve um método usando 14contaminantes orgânicos radiomarcados com C para monitorar a absorção, translocação e destino desses contaminantes de uma solução hidropônica pelas plantas. Uma publicação recente descreveu um método semelhante para rastrear o destino de 14herbicidas marcados com C após aplicação foliar8. No entanto, o método aqui descrito descreve como avaliar a remoção e translocação de contaminantes radiomarcados da solução hidropônica, com comentários sobre como adaptar esse método ao uso do solo.

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Protocolo

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NOTA: Antes de prosseguir com este protocolo, é importante consultar as diretrizes e regulamentos de segurança de radioisótopos institucionais e nacionais relevantes. Em resumo, manuseie todo o material radioativo, ou qualquer coisa que possa ter entrado em contato com radioisótopos, usando luvas duplas, jaleco e óculos de segurança. O procedimento foi realizado em um espaço dedicado no laboratório com fita adesiva para marcar seções que contêm radioisótopos. Além disso, após todos os procedimentos, limpe imediatamente os vidros e instrumentos, depois esfregue e teste-os quanto à presença de radioisótopos contaminantes por meio de contagens de cintilação. Todos os materiais e líquidos usados nesses ensaios também foram descartados em recipientes dedicados de resíduos radioativos e descartados adequadamente seguindo as diretrizes da Universidade de Calgary e da Comissão Canadense de Segurança Nuclear.

1. Preparação da solução de Hoagland

  1. Prepare uma solução de Hoagland 0,5x (meia dosagem) a partir de uma mistura comercial ou faça o meio do zero, consistindo em 0,5 mM NH4H2PO4, 3 mM KNO3, 2 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 23 μM H3BO3, 5 μM MnCl2•4H2O, 400 nM ZnSO4•7H2O, 200 nM CuSO4•5H2O, 70 nM H2MnO4•1H2O, 45 μM FeSO4•7H2O.
  2. Adicionar MES ou outro tampão adequado para obter uma concentração final de 10 mM.
  3. Ajuste o pH para o valor desejado (aqui, o pH era 5,0).

2. Preparação da solução de radiomarcação

  1. Transferir o volume necessário de 0,5x solução de Hoagland (50 ml por repetição) para um balão limpo.
  2. Adicione 0,1-0,26 kBq/mL do composto radiomarcado à solução de Hoagland.
    NOTA: Neste estudo, foi utilizado 14C-AdCA (ácido adamantano-1-carboxílico) dissolvido em metanol.
  3. Misture bem girando o frasco por 2-3 min.
  4. Alíquota de 50 ml da solução de marcação radioactiva para balões de Erlenmeyer de 125 ml por replicado.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Preparação de plantas

NOTA: O protocolo para Arabidopsis thaliana de crescimento hidropônico é detalhado em Conn et al. (2013)9.

  1. Para cada planta, remova uma tampa de um tubo de microfuga padrão de 1,7 mL com uma tesoura e faça um orifício de 3 mm de diâmetro no centro da tampa usando um furador de couro.
  2. Feche temporariamente a parte superior das tampas com fita adesiva e encha as tampas com meio Hoagland 0,5x fundido contendo 0,8% de ágar e, em seguida, coloque na tampa de uma caixa de ponta modificada (o tanque de germinação) (Figura 1A).
  3. Esterilize as sementes de Arabidopsis por lavagens consecutivas em etanol a 70% por 10 min, depois 5 min e seque na capela de fluxo em papel de filtro estéril.
  4. Semeie as sementes no meio de ágar através do orifício perfurado na parte superior da tampa da microcentrífuga.
  5. Estratificar as sementes na grelha de pontas a 4 °C durante 2-4 dias.
  6. Mova o tanque de germinação para uma câmara de crescimento em condições de dias longos (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C).
  7. Encha os racks de pontas com 0,5x solução Hoagland.
    NOTA: Certifique-se de que a solução toque no ágar para evitar que seque.
  8. Cultive plantas por 2-3 semanas, completando a solução conforme necessário (a cada 3-4 dias) para que o ágar permaneça em contato com a solução hidropônica.
  9. Transplante as tampas e mudas em uma abertura de 10 mm de diâmetro cortada no centro de uma tampa de tubo Falcon de 50 mL com uma broca e uma broca (Figura 1B).
  10. Faça 12 furos na tampa da sacola de plástico de 10 L com uma broca de 30 mm de diâmetro (o tanque de maturação).
  11. Coloque as tampas do tubo Falcon sobre as aberturas na parte superior da sacola para que as raízes passem para a sacola abaixo.
  12. Prenda pedras de ar no fundo do tanque de maturação e encha com solução de Hoagland até que as raízes estejam quase todas submersas.
  13. Retorne as plantas para a câmara de crescimento e cresça por mais 6-8 semanas (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C), até que as rosetas tenham aproximadamente 10 cm de diâmetro.

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Figura 1: Tanques hidropônicos de germinação e maturação de Arabidopsis e o vaso de tratamento 14C-AdCA. (A) O tanque de germinação usado para germinar sementes de Arabidopsis para crescimento hidropônico. (B) Plantas de Arabidopsis no tanque de maturação prontas para experimentação. (C) Uma planta Arabidopsis com raízes submersas na solução 14C-AdCA durante a experimentação. Os frascos de 50 ml (o recipiente de tratamento de 14C) são normalmente cobertos com folha de alumínio (não mostrado) durante a exposição para evitar o crescimento de algas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Corrida do Báltico (Juncus balticus Willd. ) Preparação da planta

  1. Estratificar as sementes entre dois pedaços húmidos de papel de filtro numa placa de Petri a 4 °C durante 1-2 semanas.
  2. Remova o papel de filtro superior e coloque o prato em uma câmara de crescimento em condições de dias longos (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C) por 1 semana.
  3. Transplante as mudas para suportes de pontas modificados, conforme descrito para Arabidopsis (etapa 3.1-3.4).
  4. Cultive plantas por 2-3 semanas (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C) ou até que as raízes atinjam 3-4 cm de comprimento.
  5. Transplante as plantas para uma sacola modificada de 10 L com pedras de ar, encha com solução de Hoagland até que as raízes estejam quase submersas e cresça por mais 6-8 semanas (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C).

5. Preparação de mudas de salgueiro de banco de areia (Salix interior Rowlee)

NOTA: O protocolo para o cultivo de mudas de salgueiro Sandbar é descrito em Alberts et al. (2021)10.

  1. Cortar estacas de caule de 10 cm (5 mm de diâmetro) e mergulhá-las durante a noite à temperatura ambiente em diH2O para hidratar e estimular o enraizamento.
  2. Transfira as estacas hidratadas para tanques hidropônicos aerados com 10 L de solução de Hoagland 0,5x e cresça por 1 mês (16 h de luz, 8 h de escuridão a ~ 150 μmol / m2s de luz e 22 ° C) para estabelecer o crescimento da raiz e da parte aérea.
    NOTA: Atualize a solução de Hoagland a cada 2 semanas para evitar a deficiência de nutrientes durante o desenvolvimento das plântulas.

6. Marcação de radioisótopos

  1. Depois de fazer a solução de radiomarcação, colete uma alíquota de 100 μL da solução para contagem de cintilação líquida para determinar a concentração inicial de isótopos.
  2. Seque suavemente as raízes da planta e transfira o conjunto da tampa do tubo Falcon para frascos Erlenmeyer de 125mL (o recipiente de tratamento de 14 C) contendo 0,5x solução de Hoagland com os compostos orgânicos marcados com 14C da etapa 2.4.
  3. Marque o nível da solução no balão para garantir que ele possa ser completado até o volume inicial durante o experimento, levando em conta a evapotranspiração.
  4. Embrulhe os frascos em papel alumínio e agite a 40-60 rpm sob luzes de cultivo durante o ensaio ou até que as plantas rotuladas sejam transferidas para a solução de Hoagland 0,5x sem radiomarcador por um período de perseguição.
  5. Encha o volume no balão a cada 1-2 h até a linha feita na etapa 6.3 com a solução de Hoagland sem o radiomarcador antes de coletar alíquotas de 100 μL. Certifique-se de medir o volume de Hoagland adicionado a cada frasco para comparar a taxa de evapotranspiração de cada solução. Após as primeiras 6-8 h, os tempos de amostragem podem aumentar para cada 12-24 h.
    NOTA: Esta etapa pode durar dias, se necessário, mas certifique-se de monitorar a radioatividade nas alíquotas diariamente à medida que o experimento avança.
  6. Opcional: Para monitorar a exsudação durante o período de perseguição, transfira o conjunto da planta e da tampa do tubo Falcon para um frasco com 50 mL de solução fresca de Hoagland (não contendo composto marcado com 14C) e remova uma alíquota de 100 μL a cada 2 h durante as primeiras 6-8 h, depois em intervalos de 24 h a partir do início do experimento.
    NOTA: Para distinguir entre exsudação difusa passiva e ativa do composto para fora das raízes da planta, um inibidor de transporte ativo, como a ciclosporina A, pode ser adicionado a uma concentração de 20 μM.
  7. Meça as contagens radioativas de cada alíquota coletada entre as etapas 6.1 e 6.6 usando um contador de cintilação líquida.

7. Imagens fosforosas de plantas

  1. Enxágue as raízes por 15 min em solução de Hoagland 0,5x sem o radiomarcador para remover o radioisótopo fracamente ligado.
  2. Colete 100 μL da solução de enxágue para contagens de cintilação líquida.
  3. Pese as plantas ou o material vegetal não lenhoso para determinar a massa fresca.
  4. Seque o material vegetal com um secador de gel em um pedaço de papel de filtro rotulado a 50 ° C sob vácuo por 2 h e deixe secar durante a noite em temperatura ambiente.
    NOTA: Depois de secas, as plantas podem ser armazenadas por longos períodos (4-6 meses) e a imagem pode ocorrer posteriormente com queda mínima no sinal radioativo.
  5. Limpe a tela de fósforo expondo-a a luzes altas em uma borracha de fósforo por 15 min.
  6. Dispense 2-10 μL de solução de radiomarcador com radioatividade conhecida em um pedaço de papel de filtro e deixe-o secar em temperatura ambiente durante a noite.
    NOTA: Aqui, os padrões com as radioatividades: 67, 33, 17, 8, 4 e 2 Bq são usados, mas isso pode ser alterado para acomodar as intensidades de sinal das amostras da planta.
  7. Colocar o filtro de fósforo sobre as amostras de plantas secas e os padrões radioactivos no escuro ou num recipiente opaco fechado e expô-los durante, pelo menos, 24 h.
    NOTA: Se a imagem estiver sub ou superexposta, ajuste o tempo de exposição de acordo.
  8. Visualize as telas com um sistema de imagem de fósforo de varredura a laser com resolução de 50 μm.
  9. Analise as intensidades e distribuições do sinal da imagem de fósforo usando o software ImageJ11.
    1. Etapas do ImageJ: Abra a imagem selecionando Arquivo > Analisar > Definir Medidas... Selecione Área e Valor médio de cinza > OK. Escolha a ferramenta de seleção de forma que melhor se adapta ao tecido. Clique e arraste na imagem para destacar a área de interesse. Pressione Ctrl + M. Copie a área e o valor médio de cinza em uma planilha.
  10. Converta os valores médios de cinza em Bq usando os padrões radioativos em uma curva padrão.
  11. Calcule a atividade total no tecido vegetal (densidades integradas) com a seguinte equação:
    Densidade Integrada (Bq) = (Bq médio do tecido (Bq/cm2) - Fundo (Bq/cm2)) * Área (cm2)
    1. Opcional: Converta a imagem em escala de cinza em uma escala de intensidade de cor usando o software ImageJ11.

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Resultados

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O procedimento de absorção do rótulo 14C é aplicável a uma variedade de espécies de plantas além de Arabidopsis, incluindo Salix interior, Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners e espécies de zonas úmidas como Juncus balticus10,12. No entanto, para fins representativos, apresentamos resultados do ecótipo de Arabidopsis Columbia-7 (Col-7). Anteriormente, demonstramos que contaminantes amb...

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Discussão

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A fitorremediação tem ganhado atenção nas últimas décadas como um método passivo, econômico e ecologicamente correto para a limpeza de resíduos industriais e locais contaminados1. A identificação de espécies de plantas com maior absorção de contaminantes e a compreensão dos processos moleculares que regem a absorção de moléculas orgânicas podem melhorar as estratégias de fitorremediação. Ao contrário de outros métodos indiretos, a captação de radiomarcador e a téc...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Genome Canada por meio de uma bolsa do Projeto de Pesquisa Aplicada em Grande Escala (LSARP) (# 18207) em parceria com a Genome Alberta e a Genome Quebec. O cofinanciamento foi fornecido pelo Governo de Alberta por meio da Alberta Innovates e do Ministério do Trabalho, Economia e Comércio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mistura de sal basal modificada por HoaglandLaboratórios de Tecnologia PhytoH353Contém sulfato ferroso
ÁgarBioLojaAGR001
MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico)BioLojaMES555
Medidor de pHMettler ToledoCincoFácil
MetanolBioLojaMET302
Ácido carboxílico 12C-adamantanoSigma Aldrich106399
Ácido carboxílico 14C-adamantanoViTraxSíntese personalizada
Balões Erlenmeyer de 125 mLVWR30623-174
Tubos Falcon de 50 mLVWRCA21008-940
Tubos de microcentífugoVWR87003-294
Câmaras de crescimento de plantasConviron
Caixas de gorjetasDiaMedDIATEC530-8376
Rubbermaid Roughneck 3 Gal ToteAmazonaB0B3345MYH
Papel de filtroVWRCA28320-020
Placa de PetriVWR11019-566
Agitador com porta-balõesForma CientíficaModelo 4516
Coquetel de cintilaçãoProdutos de Pesquisa Internacional111195
Frascos de cintilaçãoVWR10014-296
Contador de cintilaçãoBeckman CoulterLS 6000ICOs frascos usados dependerão do seu contador de cintilação
Secador de gelBio-RadModelo 583
Imageador de fósforo de varredura a laserBio-RadGerador de imagens moleculares FX

Referências

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