Artigo de método

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

DOI:

10.3791/68739

⸱

1 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Resumo

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A eficácia da imunoterapia contra o câncer depende do recrutamento e ativação de respostas de células T citotóxicas contra tumores sólidos por células dendríticas convencionais tipo 1 (cDC1s). No entanto, a geração de cDC1s para imunoterapia contra o câncer enfrenta limitações significativas, incluindo baixo rendimento celular, heterogeneidade funcional e suscetibilidade à imunossupressão no microambiente tumoral (TME). Recentemente, desenvolvemos uma modalidade de imunoterapia baseada na reprogramação in vivo de células cancerígenas em células imunogênicas semelhantes a cDC1, o que permitiu que as células cancerígenas apresentassem antígenos tumorais como cDC1s e provocassem respostas policlonais de células T citotóxicas e imunidade antitumoral sistêmica durável. Aqui, descrevemos um protocolo tratável para gerar células semelhantes a cDC1 dentro do TME, superexpressando a rede reguladora mínima de genes específicos de cDC1 - PU.1, IRF8 e BATF3 (coletivamente chamados de PIB) - em células cancerígenas, seguido por implantação subcutânea de uma mistura de células transduzidas e parentais. A superexpressão de PIB impulsiona a aquisição gradual do marcador hematopoiético CD45 e do complexo profissional de apresentação de antígenos MHC classe II em células tumorais, servindo como leituras de superfície celular para reprogramação in vivo de cDC1. Quando comparada ao processo de reprogramação in vitro, a reprogramação do modelo de melanoma de camundongo YUMM1.7 in vivo demonstrou cinética mais rápida e maior eficiência. As células semelhantes a cDC1 induziram uma rápida remodelação do TME, recrutando células imunes do hospedeiro nos primeiros 3 dias e levando à formação de estrutura linfóide terciária no dia 9. As células reprogramadas do tipo cDC1 persistiram nos tumores por pelo menos 9 dias, mas não foram detectadas no dia 15. O protocolo de reprogramação cDC1 in vivo descrito aqui fornece um método tratável e robusto para transformar efetivamente tumores "imunes" em "imunoquentes". No geral, oferece uma plataforma poderosa para estudar os mecanismos subjacentes à imunidade antitumoral mediada por cDC1 e descobrir combinações sinérgicas com outras modalidades de imunoterapia contra o câncer.

Introdução

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Avanços recentes nas modalidades de imunoterapia contra o câncer, incluindo bloqueio de checkpoint imunológico (ICB), terapia celular adotiva (ACT) e vacinas, mudaram o cenário do tratamento do câncer1. No melanoma, as taxas de resposta à inibição da proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e da proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) podem chegar a 60%2. No entanto, mais de 40% dos pacientes com melanoma não respondem ao ICB, e as taxas de resposta em cânceres menos imunogênicos, como câncer de mama, câncer colorretal estável a microssatélites e glioblastoma, permanecem abaixo de 5%, destacando lacunas clínicas 3,4,5. Uma grande barreira para o amplo sucesso clínico é a baixa ativação das respostas das células T citotóxicas, que dependem da apresentação eficiente do antígeno no microambiente tumoral (TME)6.

As células dendríticas convencionais do tipo 1 (cDC1s) são raras, mas indispensáveis para o início da imunidade tumor-específica, oferecendo três sinais principais para as respostas das células T primárias: (1) processamento profissional e apresentação de antígenos nos complexos principais de histocompatibilidade (MHC) classe I e II, (2) co-estimulação via CD80 e CD86 e (3) sinalização de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-12 7,8. Entre os subconjuntos de células dendríticas (DC), os cDC1s se destacam na apresentação cruzada de antígenos associados a células tumorais para preparar células T CD8 + virgens ou reativar células T de memória ou conduzir a diferenciação de células T CD4 + para células T auxiliares tipo 1 (TH1)9. Além disso, os cDC1s são os principais produtores de quimiocinas, ligantes de quimiocinas de motivo CXC 9 e 10 (CXCL9/10), que medeiam o recrutamento de células T para o tecido tumoral 10,11,12,13. Nos últimos anos, vários estudos destacaram que a rejeição tumoral e as respostas efetivas ao ICB ou ACT se correlacionam fortemente com a presença de cDC1s intratumorais12,13. Portanto, os cDC1s se desenvolveram como um alvo atraente para a imunoterapia contra o câncer e aproveitar com sucesso suas características únicas pode ter um potencial translacional significativo.

Os métodos atuais para gerar cDC1s são baseados no isolamento ou diferenciação sanguínea de progenitores CD34+ ou células-tronco pluripotentes 14,15,16. As estratégias clínicas predominantes baseiam-se em isolar uma mistura de subpopulações autólogas de DC do sangue e estimulá-las ex vivo com agonistas de receptores toll-like ou citocinas pró-inflamatórias para induzir um programa imunogênico maduro antes da reinfusão16. No entanto, essas estratégias são limitadas pela má maturação celular, barreiras imunossupressoras no TME e heterogeneidade de subconjunto na mistura DC infundida, onde apenas uma pequena proporção de cDC1s está presente7. Além disso, isolar apenas cDC1s para imunoterapia ou vacinação contra o câncer é um desafio devido à sua abundância extremamente baixa no sangue periférico (<0,3%)16. Além disso, os cDC1s podem ser produzidos a partir de células progenitoras CD34+ ou células-tronco pluripotentes induzidas usando citocinas e sinalização NOTCH. No entanto, esses métodos requerem protocolos complexos e longos e produzem números baixos e populações heterogêneas de subconjuntos DC 17,18,19.

Para lidar com essas limitações, a reprogramação in vivo fornece uma estratégia adequada para a imunoterapia contra o câncer para gerar células semelhantes a cDC1, que se assemelham às propriedades fenotípicas, transcricionais e funcionais dos cDC1s20. Por meio da superexpressão da rede reguladora de genes mínimos específica de cDC1 - PU.1, IRF8 e BATF3 (coletivamente chamados de PIB) - fibroblastos, células estromais e células cancerígenas foram gradualmente reprogramados em células semelhantes a cDC1, permitindo o processamento e apresentação de antígenos tumorais em MHC classe I e II, sinalização co-estimulatória via CD80 e CD86 e secreção de citocinas / quimiocinas, incluindo CXCL9 / 10 e IL-1220, 21,22,23. A reprogramação de cDC1 progrediu mais rápida e eficientemente em xenoenxertos humanos in vivo e independentemente da imunossupressão, gerando células semelhantes a cDC1 com assinatura imunogênica madura20. Em tumores de melanoma singênico, observamos que as células semelhantes a cDC1 remodelaram seu TME, induziram a formação de estrutura linfóide terciária (TLS) e recrutaram e expandiram células TH1 policlonais e T de memória citotóxica, levando à imunidade sistêmica de longo prazo20. Finalmente, desenvolvemos uma nova modalidade de imunoterapia contra o câncer baseada na reprogramação in situ de células cancerígenas em células semelhantes a cDC1 por injeção intratumoral de vetores adenovirais20. Essas descobertas abrem caminho para a tradução clínica da reprogramação do cDC1 como uma nova modalidade de imunoterapia contra o câncer que pode aproveitar as propriedades funcionais dos cDC1s.

Aqui, apresentamos um protocolo tratável para gerar células semelhantes a cDC1 dentro do TME com base na reprogramação in vivo de cDC1. A entrega lentiviral de PIB às células cancerígenas e a subsequente implantação como uma mistura definida de células cancerígenas transduzidas com células cancerígenas parentais não transduzidas permitem a reprogramação in vivo de uma fração controlada de células cancerígenas dentro do TME. Além disso, este método não é limitado pela eficiência de entrega in situ de vetores virais20. Descrevemos as etapas para a produção eficiente de vetores lentivirais, titulação funcional e reprogramação in vivo de cDC1 usando o modelo de melanoma singênico, YUMM1.7, como exemplo. Detalhamos a configuração experimental e a estratégia de gating para analisar células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vivo por citometria de fluxo após dissociação tumoral. Também fornecemos as etapas para avaliar as alterações no TME, realizando criopreservação, seccionamento e coloração por imunofluorescência de cortes tumorais, seguidos de microscopia confocal. Finalmente, abordamos como monitorar a imunidade induzida por cDC1 medindo o crescimento e a sobrevivência do tumor. Essa abordagem tratável e escalável oferece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para avaliar estratégias de tratamento combinatório com reprogramação in vivo de cDC1, para caracterizar mudanças na neogênese de TME e TLS em modelos de câncer ou realizar grandes telas modificando a expressão de várias vias imunológicas, por exemplo, apresentação de antígeno ou secreção de citocinas / quimiocinas, e desvendar seu impacto na imunidade antitumoral.

Protocolo

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Os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com os regulamentos suecos após a aprovação do Conselho Sueco de Agricultura.

1. Preparação do reagente

  1. Para preparar o meio completo de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), adicione 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sódio, 100 U / mL de penicilina (Pen), 2 mM de substituto de glutamina e 100 mg / mL de estreptomicina (Strep).
  2. Para preparar o meio completo de RPMI 1640, adicione 10% (v / v) de FBS, 2 mM de substituto de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U / mL de Pen e 100 mg / mL de estreptococo.
  3. Para preparar o meio completo DMEM/F12, adicione 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sódio, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 100 U/mL de caneta e 100 mg/mL de estreptococo.
  4. Para preparar 1 mg/mL de polietilenimina (PEI), dissolva 100 mg de pó de PEI em 100 mL de água desionizada estéril em um copo de vidro ou tubo cônico. Colocar o copo num agitador magnético e agitar à temperatura ambiente (RT) para criar um vórtice até se dissolver completamente. Ajuste o pH para 6,9-7,1, adicionando ácido clorídrico (HCl) / hidróxido de sódio (NaOH) gota a gota e filtre a solução através de um filtro de membrana PES de 0,22 μm.
  5. Para preparar 1 mM de butirato de sódio, dissolva 1,10 mg em 10 mL de água deionizada estéril.
  6. Para preparar 8 mg / mL de Polybrene, dissolva 80 mg de pó de Polybrene em 10 mL de água deionizada estéril.
  7. Para preparar o tampão FACS, adicione 2% de FBS e 1 mM de EDTA à solução salina tamponada com fosfato (PBS).

2. Produção de lentivírus

  1. Descongele as células HEK 293T adicionando 1 mL de células a 9 mL de meio completo DMEM pré-aquecido e centrifugue as células a 350 × g por 5 min. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de meio completo DMEM e cultivar células numa placa de 150 mm a 37 °C com CO2 a 5%.
  2. Expanda e divida as células HEK 293T quando atingirem 80-90% de confluência. Para dividir as células, lave uma vez com PBS, adicione 5 mL de tripsina para dissociá-las da placa e incube 5-10 min a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Colete as células com 5 mL de meio completo de DMEM, centrifugue-as a 350 × g por 5 min e divida-as 1:6 em novas placas de 150 mm, 48 h antes da transfecção.
    NOTA: A qualidade da linha celular produtora de lentivírus é crucial para a produção de altos títulos. Não permita que as células excedam 95% de confluência e evite semeá-las a <30% de confluência.
  4. Após 48 h, ou quando as células atingirem 70-80% de confluência, prepare a mistura de transfecção em um tubo cônico de 50 mL. Use o seguinte plasmídeo de transferência: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-um vetor lentiviral policistrônico contendo os fatores de transcrição PU.1, IRF8, BATF3, um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) e uma proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) como repórter de transdução fluorescente; ou 2) SFFV-eGFP, um vetor lentiviral de controle com um sítio de clonagem múltipla e eGFP; ou 3) SFFV-mCherry, um vetor lentiviral que expressa mCherry. Adicione 10 μg de plasmídeo de transferência, 7,5 μg de plasmídeo de embalagem psPAX2 e 2,5 μg de plasmídeo de envelope pMD2.G. Complete o tubo com Opti-MEM para atingir um volume total de 2 mL. Finalmente, adicione 60 μL do reagente de transfecção PEI (do estoque de 1 mg / mL) à mistura de transfecção.
    NOTA: O vetor lentiviral SFFV-eGFP é usado como um controle de transdução para experimentos de reprogramação para explicar a imunogenicidade mediada por lentivírus, enquanto o SFFV-mCherry é usado para gerar linhas de células cancerígenas marcadas com fluorescência.
  5. Vórtice a transfecção se mistura completamente por 1 min e incuba por 15 min em RT para permitir a formação de complexos DNA-lipídios.
    NOTA: A confluência influencia significativamente os títulos virais. A transfecção de células com menos de 70% de confluência resultará em títulos virais mais baixos devido a menos células recebendo os plasmídeos.
  6. Aspire o meio das células HEK 293T e adicione 10 mL de DMEM sem Pen/Step e com 10% de FBS filtrado estéril.
  7. Adicione a mistura de transfecção gota a gota às placas de 150 mm e incube por 16 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  8. Após a transfecção, substitua o meio por 20 mL de meio completo DMEM suplementado com butirato de sódio 1 mM e incube as células por 24 h a 37 ° C com 5% de CO2.
    NOTA: O butirato de sódio é um inibidor da histona desacetilase classe 1 (HDAC) e pode aumentar a expressão gênica em células HEK 293T induzindo a hiperacetilação de histonas, que abre a estrutura da cromatina e facilita a transcrição de plasmídeos de empacotamento viral e transferência. A eficiência da transfecção pode ser avaliada verificando a expressão de eGFP usando um microscópio de fluorescência.
  9. Colete o sobrenadante contendo lentivírus 48 h e 60 h após a transfecção em tubos cônicos de 50 mL. Após a primeira coleta, adicionar 12 mL de meio completo DMEM pré-aquecido por placa de 150 mm para a segunda coleta. Armazenar as coleções a 4 °C, filtrá-las através de um filtro PES de baixa ligação às proteínas de 0,45 μm e combiná-las.
  10. Para concentrar o vírus, pipete 37 g de meio contendo lentivírus em tubos de polipropileno de parede fina de 38,5 mL abertos. Meça o peso dos tubos usando uma balança de bancada.
    NOTA: Meça o peso do meio contendo lentivírus em vez de seu volume, pois o peso fornece maior precisão para o balanceamento. O peso dos tubos deve ser bem equilibrado para evitar danos à ultracentrífuga.
  11. Coloque os tubos nos baldes de ultracentrifugação, feche as tampas e coloque os baldes em um rotor de balde oscilante. Centrifugar a 25.000 × g durante 90 min a 4 °C.
  12. Após centrifugação, retirar os tubos dos baldes e aspirar o sobrenadante.
    NOTA: Os mesmos tubos podem ser preenchidos repetidamente e usados por um número total de três rodadas de centrifugação para produzir um pellet de lentivírus maior por tubo.
  13. Coloque os tubos de polipropileno de parede fina de cabeça para baixo por 5 min em um lenço de laboratório ou material absorvente semelhante para permitir que o excesso de líquido escorra e seque o pellet.
  14. Adicione 200 μL de DMEM gelado suplementado com HEPES ou PBS a cada pellet. Coloque os tubos de microcentrífuga em tubos cônicos de 50 mL e feche a tampa para manter a esterilidade.
  15. Incubar o pellet durante a noite a 4 °C para permitir a ressuspensão.
  16. Combine os pellets ressuspensos, alíquota, e armazene-os a -80 °C por até um ano.
    NOTA: Para evitar a perda de título por rodadas repetidas de congelamento e descongelamento, use volumes de alíquota menores (por exemplo, 50-200 μL).

3. Titulação funcional do vírus

NOTA: Esta etapa deve ser repetida para cada lote de lentivírus para determinar a dose viral ideal necessária para atingir uma proporção de 1:1 de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-).

  1. Descongele e expanda as células cancerígenas em meios de cultura apropriados (por exemplo, a linha celular de melanoma murino YUMM1.7 em meio completo DMEM/F12).
    NOTA: As células devem passar por pelo menos uma rodada de divisão antes de um experimento de reprogramação. As passagens de células devem ser semelhantes entre os experimentos.
  2. Um dia antes do estabelecimento do tumor, levante as células cancerígenas aspirando seus meios de cultura, lavando uma vez com PBS e adicionando 2 mL ou 5 mL de tripsina por placa de 100 mm ou placa de 150 mm. Incubar por 5-10 min a 37 ° C com 5% de CO2 e coletar as células adicionando 8 mL ou 5 mL de meio completo por placa de 100 mm ou 150 mm, respectivamente, em tubos cônicos de 50 mL.
  3. Centrifugue as células a 350 × g por 5 min para remover a tripsina e ressuspender em meio completo.
  4. Pegue uma alíquota de 10 μL de células, adicione 10 μL de Trypan Blue e conte as células viáveis usando um hemocitômetro.
  5. Transfira 6 × 105 células para um novo tubo cônico de 50 mL contendo 12 mL de meio completo e adicione 12 μL de 8 mg / mL de polibreno à suspensão celular para atingir uma concentração de trabalho de 8 μg / mL.
  6. Pipete 2 mL da suspensão celular em cada poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
    NOTA: Se necessário, aumente o número de células para 1,2-1,8 x 106 por placa de 6 poços.
  7. Adicione volumes crescentes de lentivírus a cada poço para determinar o volume ideal necessário para atingir uma proporção de 1:1 de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-).
    NOTA: Adicione os volumes recomendados de lentivírus de 1, 2, 4, 8, 16 e 32 μL em triplicados. Realizar a titulação funcional para o vetor lentiviral de controle vazio SFFV-eGFP e SFFV-mCherry.
  8. Incubar as células durante 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
  9. No dia 0, remova o meio contendo lentivírus, substitua por meio novo e incube por 72 h a 37 ° C com 5% de CO2.
  10. No dia 3, verifique as células quanto à expressão de eGFP sob um microscópio de fluorescência.
    NOTA: Esta etapa fornece uma verificação rápida da transdução celular, mas não substitui a análise realizada por citometria de fluxo na etapa 3.14 para determinar a proporção exata de células eGFP+ para eGFP- .
    Em algumas células cancerígenas (por exemplo, células de melanoma de camundongo B16), o sinal de eGFP pode ser baixo e difícil de detectar usando um microscópio de fluorescência. Recomenda-se proceder diretamente à citometria de fluxo.
  11. Aspire o meio, lave as células uma vez com PBS e adicione 500 μL de tripsina por poço. Incubar durante 5-10 min a 37 °C com 5% de CO2.
  12. Eleve as células em cada poço com 1,5 mL de tampão FACS e pipete a suspensão celular em tubos de poliestireno de 5 mL. Pegue uma alíquota e conte as células viáveis usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano.
  13. Centrifugar a suspensão celular a 350 × g durante 5 min, ressuspender o sedimento em 100 μL de tampão FACS e proceder à análise de citometria de fluxo.
  14. Quantifique a proporção precisa de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-) por citometria de fluxo. Para testes in vivo , use o volume de lentivírus que produz a proporção mais próxima de 1:1.
    NOTA: Para determinar com precisão a proporção de células eGFP+ para eGFP- , inclua células cancerígenas não transduzidas como controles negativos para gating.

4. Estabelecimento de tumor subcutâneo para reprogramação in vivo

  1. Descongele e expanda as células cancerígenas em seu meio de cultura apropriado para gerar células que expressam mCherry.
    NOTA: A expressão de mCherry facilita a distinção de células cancerígenas durante a análise de citometria de fluxo de outras populações no tumor, por exemplo, células estromais endógenas e imunes.
  2. Execute as etapas 3.2-3.4 e ressuspenda as células em meio completo a uma concentração de 105 células por mL.
  3. Adicione 8 μg/mL de polibreno e o volume determinado de lentivírus SFFV-mCherry à suspensão celular para atingir >90% de eficiência de transdução.
    NOTA: Alternativamente, se atingir >90% de transdução comprometer a viabilidade celular, classifique as células mCherry+ por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) 72 h após a transdução e expanda as células classificadas em cultura.
  4. Colocar 5 ml da suspensão celular (contendo 5 × 105 células) por placa de 100 mm e incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 h.
  5. Após 24 h, substitua o meio por 10 mL de meio completo e expanda as células cultivando-as a 37 ° C com 5% de CO2 por pelo menos 7 dias antes de iniciar os experimentos de reprogramação.
  6. Após a expansão, siga as etapas 3.2-3.4 para preparar as suspensões celulares para transdução subsequente com o volume previamente determinado de SFFV-PIB-IRES-eGFP, resultando na proporção mais próxima de 1:1 de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-) no dia 3.
  7. Adicione 8 μg/mL de polibreno à suspensão celular, juntamente com o volume previamente determinado de lentivírus à suspensão celular em tubos cônicos de 50 mL. Misture bem sem criar bolhas.
  8. Pipetar 2 ml da suspensão celular (contendo 105 células) por alvéolo numa placa de cultura de tecidos de 6 poços e incubar durante 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: Alternativamente, coloque as células em 5 mL de meio de transdução em placas de cultura de tecidos de 100 mm. No entanto, observe que a eficiência de transdução pode ser reduzida em volumes maiores e deve ser determinada empiricamente conforme descrito nas etapas 3.1-3.13.
    Recomenda-se transduzir pelo menos 10% mais células para compensar a perda potencial de células durante o processo de transdução e garantir volume suficiente para pipetagem ou injeção durante o estabelecimento do tumor.
  9. Após 24 h, remova o meio contendo lentivírus, lave duas vezes com PBS, adicione 500 μL de tripsina a cada poço e incube por 5-10 min a 37 ° C com 5% de CO2.
  10. Verifique ao microscópio óptico se as células se dissociaram completamente das placas e, em seguida, colete-as com meio completo em tubos cônicos de 50 mL.
  11. Pulverize as células centrifugando-as por 5 min a 350 × g, lave o pellet com PBS e centrifugue novamente por 5 min a 350 × g. Pegue uma alíquota e conte as células viáveis usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano.
  12. Ressuspenda o pellet em PBS gelado para atingir uma concentração de 2-4 × 107 células por mL, o que corresponde a 1-2 × 106 células em 50 μL de volume de injeção por tumor.
    NOTA: É importante ressaltar que esses números foram validados para tumores de melanoma YUMM1.7 para isolar células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vivo para análise de citometria de fluxo. Para outras linhagens celulares e para outras leituras experimentais, como experimentos de crescimento e sobrevivência de tumores, os números precisam ser testados empiricamente. Para experimentos de crescimento e sobrevivência do tumor, recomenda-se um número menor de células - variando de 100.000 a 250.000 células por tumor.
  13. Mude para a área de trabalho onde os experimentos com animais são realizados e mantenha as células no gelo.
    NOTA: Após a preparação celular, execute as injeções celulares o mais rápido possível, pois a viabilidade celular é reduzida com o tempo.
  14. Prepare a solução anestésica contendo 3 μL de xilazina (20 mg / mL), 27 μL de cetamina (100 mg / mL) e 30 μL de PBS por camundongo.
  15. Anestesiar camundongos CD45.1 injetando 60 μL de anestésico por via intraperitoneal. Randomize os ratos e mantenha-os em uma almofada de aquecimento para evitar uma queda na temperatura corporal. Aplique creme para os olhos nos olhos para evitar a desidratação ocular durante a anestesia.
    NOTA: É fundamental usar camundongos CD45.1 para permitir a distinção entre células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vivo que expressam o alelo CD45.2 do tipo selvagem e células imunes endógenas. Se a linha celular for CD45.1, camundongos C57BL/6 (CD45.2) podem ser usados como receptores. Os camundongos devem ser pareados por sexo e idade entre os grupos experimentais e randomizados antes do estabelecimento do tumor.
  16. Aguarde de 5 a 10 minutos até que todos os ratos estejam totalmente anestesiados.
  17. Raspe o flanco direito dos ratos usando uma navalha; Opcionalmente, marque-os usando um cortador de orelha. Desinfete a área e retire o cabelo restante com etanol 70%.
  18. Ressuspenda as células cancerígenas pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Carregue a suspensão celular em uma seringa de 0,5 mL 30 G.
  19. Levante suavemente a pele do flanco raspado do mouse usando dois dedos e insira a ponta da agulha onde a pele forma um vinco.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar perfurar os dedos com a agulha.
  20. Solte a pele, segure a seringa no lugar com uma mão e use dois dedos da outra mão para esticar a pele do mouse.
  21. Injete lentamente 50 μL da suspensão de células cancerígenas para criar uma protuberância oval (inchaço subcutâneo) no local da injeção.
    NOTA: Se uma protuberância não se formar, a suspensão pode ter vazado para o tecido subcutâneo circundante, o que pode levar à formação de tumor inconsistente ou com falha.
  22. Após o procedimento, monitore todos os camundongos acordarem para garantir a sobrevivência após a anestesia.
  23. Manter os ratos num ambiente de temperatura controlada com 23 ± 2 °C e um ciclo fixo, claro/escuro, de 12 h e livre acesso a alimentos e água.
    NOTA: Se você deseja monitorar o crescimento do tumor, prossiga com as etapas 4.24-4.26. Caso contrário, ignore essas etapas e prossiga diretamente para as próximas seções.
  24. Para monitorar o crescimento do tumor, prenda suavemente o mouse com uma mão, permitindo uma visualização clara do tumor.
  25. Usando um paquímetro eletrônico, meça o comprimento (l), a largura (w) e a altura (h) do tumor. Calcule o volume do tumor (V) usando a fórmula: V = (l x w x h) / 2.
  26. Meça as dimensões do tumor a cada dois ou três dias. Quando o tumor atingir um volume que atenda ao critério de desfecho humano (por exemplo, 1.500 mm³), eutanasiar o animal de acordo com as diretrizes éticas e institucionais.

5. Isolamento tumoral para análise por citometria de fluxo

  1. Prepare tesouras, pinças, tampão FACS e placas de cultura não tecidual de 12 poços com meio completo RPMI gelado para coleta de amostras de tumor.
  2. Prepare a solução de digestão do tumor misturando 30 μL de 100 mg / mL de colagenase D e 3 μL de 10 mg / mL de DNAse I em 3 mL de meio completo de RPMI por tumor (para atingir uma concentração de trabalho de 1 mg / mL de colagenase D e de 10 μg / mL de DNAse I).
    NOTA: Se a eficiência da digestão for abaixo do ideal, adicione 2-5 mM de CaCl2 para apoiar a atividade da colagenase.
  3. Eutanasiar os camundongos por luxação cervical ou asfixia por CO2 no dia do isolamento.
  4. Extirpe os tumores subcutâneos com tesoura e fórceps e coloque cada tumor em um poço da placa de cultura não tecidual de 12 poços com RPMI gelado. Tente minimizar a excisão de tecido não tumoral.
  5. Corte as amostras de tumor em pedaços de 1-2 mm3 usando uma tesoura, colete os pedaços em tubos cônicos de 50 mL contendo 3 mL de solução de digestão e incube a 37 ° C agitando a 200-250 rpm por 30-45 min.
    NOTA: Vórtice ou pipeta a cada 15 minutos para facilitar o processo de digestão.
  6. Após a digestão, pipetar vigorosamente a mistura durante 1 min utilizando uma pipeta serológica de 5 ml. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para um novo tubo cónico de 50 ml.
  7. Use o êmbolo de uma seringa de 10 mL para esmagar pedaços não digeridos contra o filtro de células de 70 μm e enxágue o filtro com 10 mL de meio completo RPMI.
  8. Centrifugue a suspensão celular a 350 × g por 5 min a 4 ° C, ressuspenda em 1 mL de tampão FACS e conte as células viáveis.
  9. Transfira a suspensão celular para tubos de poliestireno de 5 mL, células de pellet a 350 × g por 5 min e ressuspenda 106 células viáveis por 100 μL de tampão FACS.
  10. Separe as células para controles de cor única (SC) e FMO em tubos de poliestireno separados.
  11. Preparar uma mistura principal de coloração de anticorpos contendo soro de rato (1:100) para bloquear a ligação inespecífica; um corante de viabilidade fixável (1:100) para excluir células mortas na análise; e anticorpos marcados com fluorescência anti-CD45.1, anti-CD45.2 e anti-MHC-II em sua concentração ideal. Adicione 100 μL da mistura principal a cada amostra e incube por 20 min a 4 ° C no escuro.
  12. Lave as amostras 2x com 2 mL de tampão FACS e prossiga com a análise de citometria de fluxo.
  13. Quantifique as porcentagens de células semelhantes a cDC1 que expressam CD45.2 e / ou MHC-II, por gating em células cancerígenas transduzidas (eGFP +) (CD45.1-mCherry +).
    NOTA: Este protocolo pode ser usado para realizar imunofenotipagem de tumores após reprogramação in vivo de cDC1, complementando o painel de coloração com anticorpos contra populações de células imunes linfóides e/ou mieloides endógenas.

6. Congelamento e seccionamento de tumores para análise de microscopia confocal

  1. Prepare-se para o isolamento do tumor seguindo as etapas 5.1 e 5.3. Extirpar tumores subcutâneos com tesoura e fórceps.
  2. Fixe os tumores em paraformaldeído a 4% (PFA) recém-preparado em PBS a 4 ° C com agitação suave. Ajuste o tempo de fixação de acordo com o tamanho do tumor, usando 1 h por mm³ de tecido como diretriz.
  3. Transfira os tumores para sacarose a 15% em PBS e incube a 4 ° C enquanto agita suavemente os tecidos até que eles afundem no fundo do tubo. Em seguida, mova-os para 20% de sacarose em PBS nas mesmas condições.
  4. Uma vez que os tumores tenham se acomodado no fundo do tubo, incube-os em uma mistura 1:1 de sacarose a 20% em PBS e composto OCT por 30 min a 4 ° C com agitação.
  5. Remover a mistura, incorporar os tecidos num criomoldor com OCT a 100% e congelar com azoto líquido.
    NOTA: Sempre use equipamento de proteção individual adequado (luvas criogênicas, protetor facial e jaleco) para evitar queimaduras de frio ou ferimentos causados pela rápida expansão do vapor. Trabalhe em uma área bem ventilada para evitar o risco de asfixia.
    1. Armazene os blocos a -80 °C em recipientes fechados para evitar a desidratação.

7. Coloração por imunofluorescência de seções tumorais

  1. Usando um criostato, corte os tumores em seções de aproximadamente 8 μm de espessura e monte-os em lâminas de vidro de microscópio. Se necessário, guarde as lâminas a -80 °C.
    NOTA: Para preservar a integridade do tecido, mantenha os blocos e lâminas com cortes tumorais montados em gelo seco durante o transporte de e para o criostato. Certifique-se de que o criostato seja mantido a -20 °C durante o seccionamento.
  2. Descongele as lâminas em PBS por 5 min e fixe-as em uma solução de PFA a 4% por 10 min em RT.
  3. Após a fixação, lave as lâminas em PBS por 5 min.
    NOTA: Certifique-se de que os tecidos permaneçam hidratados; Mantenha-os sempre em líquido durante todas as etapas de coloração subsequentes. Se o experimento precisar ser pausado, as lâminas podem ser armazenadas em PBS no RT por até 3 horas. Evite armazenar as lâminas no PBS durante a noite.
  4. Para recuperação de antígeno, encha um vaporizador com água e ligue-o. Coloque um frasco contendo água deionizada e um frasco contendo 10 mM de citrato de sódio (pH 6) no vaporizador e cubra a abertura com papel alumínio. Sem remover a tampa, insira um termômetro nas aberturas da tampa do vaporizador, fure a folha de alumínio e monitore a temperatura, garantindo que as soluções atinjam ~99 °C.
  5. Quando os tampões atingirem ~99 °C, mergulhe as lâminas em água deionizada durante 10 s e depois transfira-as rapidamente para a solução de recuperação de antigénio.
  6. Incube as lâminas a ~99 °C por 15 min.
  7. Lave as lâminas em 1x PBS por 3 x 5 min.
  8. Use uma caneta de Papanicolau de barreira hidrofóbica para delinear cada seção do tecido, formando um perímetro hidrofóbico que evita que qualquer líquido adicionado aos tecidos vaze.
    NOTA: As lavagens subsequentes de PBS podem interromper o perímetro hidrofóbico ao redor dos tecidos e exigir renovação. Desenhe-o novamente conforme necessário.
  9. Bloqueie e permeabilize os tecidos com 150 μL de tampão bloqueador (5% de soro e 0,5% de Triton X-100 em 1x PBS) por 60 min em RT. Para todas as etapas de coloração, use soro da mesma espécie que o hospedeiro do anticorpo secundário.
  10. Lave as lâminas em 1x PBS por 3 x 5 min.
  11. Incubar tecidos com 20 μg / mL do anticorpo anti-CD45 primário em tampão de bloqueio (5% de soro e 0,5% de Triton X-100 em 1X PBS) durante a noite a 4 ° C.
    NOTA: Para usar outros anticorpos, valide empiricamente a concentração de anticorpos.
  12. Lave as lâminas em 1x PBS por 3 x 5 min.
  13. Incubar as seções de tecido com o anticorpo secundário anti-rato de cabra conjugado com AlexaFluor-647 em uma diluição de 1:250 em tampão de bloqueio (soro a 5%) por 2 h no escuro em RT.
    NOTA Depois de adicionar o anticorpo secundário, execute todas as etapas subsequentes no escuro para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos.
  14. Lave as lâminas em 1x PBS por 3 x 5 min.
  15. Incubar tecidos com 1 μg/mL de DAPI e 20 μg/mL de anticorpos conjugados AlexaFluor-594 em tampão de bloqueio (5% de soro) por 1 h no escuro em RT.
  16. Lave as lâminas em 1x PBS por 3 x 5 min.
  17. Adicione uma gota de solução de montagem em cada seção do tumor e, em seguida, aplique algumas gotas de meio de montagem na lamínula. Inverta rapidamente a lamínula na lâmina para montá-la e garantir a ausência de bolhas perto dos tumores.
  18. Deixe as lâminas secarem durante a noite e faça a imagem por microscopia confocal.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma visão geral esquemática do protocolo de reprogramação in vivo tratável é apresentada na Figura 1. Primeiro, produzimos o vetor lentiviral policistrônico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), codificando os fatores de reprogramação instrutores de cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, seguido por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) e proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) na linha celular de empacotamento HEK 293T. Para controlar a imunogenicidade mediada por lentivírus, produzimos um vetor SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vazio, contendo um sítio de clonagem múltipla (MCS) e IRES-eGFP, mas excluindo os fatores de reprogramação. Após a produção viral, colhemos o sobrenadante contendo lentivírus e o concentramos por ultracentrifugação. Titulamos funcionalmente o vírus para determinar a quantidade necessária para atingir uma proporção de 1:1 de células transduzidas (eGFP+) para não transduzidas (eGFP-), que avaliamos no dia 3 após a transdução. Em seguida, usamos a quantidade de vírus resultante para transduzir a linhagem de células cancerígenas selecionada no dia -1. Após 24 h, coletamos as células e as implantamos por via subcutânea para estabelecer tumores. Essa estratégia garantiu que as células transduzidas fossem reprogramadas em células semelhantes a cDC1 in vivo, dentro do TME. Nos pontos de tempo indicados após o enxerto, extirpamos e processamos tumores para análises a jusante, incluindo citometria de fluxo de células tumorais dissociadas, para quantificar a eficiência de reprogramação in vivo ou coloração por imunofluorescência de seções tumorais criopreservadas para caracterizar alterações no TME.

Primeiro, para garantir a produção de altos títulos lentivirais, monitoramos as células HEK 293T antes da transfecção, visando atingir 70-80% de confluência e 24 h depois, avaliamos a eficiência da transfecção por meio da expressão de eGFP por microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em seguida, coletamos meio contendo vírus 48 h e 60 h após a transfecção, ultracentrifugamos e armazenamos em alíquotas a -80 °C (Figura 2B). Em seguida, determinamos a quantidade viral ideal necessária para atingir uma proporção de 1:1 de células eGFP+ para eGFP- em células de melanoma YUMM1.7. Semeamos 105 células YUMM1.7 por poço em uma placa de 6 poços, transduzimos as células com volumes crescentes de lentivírus e substituímos o sobrenadante contendo vírus por meio completo DMEM / F12 fresco após 24 h ( Figura 2C ). No dia 3, avaliamos a expressão de eGFP por microscopia de fluorescência, antes de quantificar as porcentagens precisas de células eGFP+ por citometria de fluxo (Figura 2C). Para quantificar a proporção de células eGFP+ para eGFP- , incluímos células vivas e únicas para excluir células mortas e dublês (Figura 2D). O volume ideal do lote de lentivírus produzido foi determinado tanto para PIB-eGFP quanto para o vírus eGFP de controle como 2 μL por 105 células YUMM1.7, resultando em 50,0 ± 0,3% e 63,0 ± 0,9% de células eGFP+ , respectivamente (Figura 2E).

Em seguida, para avaliar a eficiência de reprogramação in vivo, geramos uma linha de células cancerígenas marcadas com fluorescência (mCherry +) (YUMM1.7-mCherry). Isso garantiu que pudéssemos discriminar entre células cancerígenas e células estromais ou imunes por meio de células mCherry + vivas na análise de citometria de fluxo (Figura 3A, B). Em seguida, transduzimos células YUMM1.7-mCherry com 2 μL de PIB-eGFP ou vírus eGFP de controle por 105 células para atingir uma proporção de 1:1 eGFP+ para eGFP-. Implantamos subcutaneamente 1,6 × 106 células por tumor em camundongos CD45.1 e mantivemos uma alíquota de células para cultura in vitro para comparação. Avaliamos a eficiência de reprogramação por citometria de fluxo, bloqueando células vivas mCherry+, eGFP+ e CD45.1- para excluir células imunes do hospedeiro que engolfaram eGFP ou mCherry (Figura 3B). Dos dias 1 a 9, observamos a aquisição gradual da expressão de CD45.2 e/ou MHC-II, marcando células parcialmente reprogramadas do tipo cDC1 (CD45.2+ MHC-II- ou CD45.2- MHC-II+) e células totalmente reprogramadas do tipo cDC1 (CD45+ MHC-II+) (Figura 3C). Validamos que a reprogramação de células cancerígenas de camundongos in vivo resultou em porcentagens mais altas de células semelhantes a cDC1 no dia 9 em comparação com condições in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). A cinética de reprogramação também foi acelerada, pois observamos uma porcentagem maior de células semelhantes a cDC1 já no dia 4 (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), indicando que a presença de pistas ambientais promove uma reprogramação mais rápida e eficiente em direção a células semelhantes a cDC119. Enquanto as células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vitro estavam presentes até o dia 15, as células semelhantes a cDC1 in vivo persistiram por 9 dias, mas não foram detectadas no dia 15, sugerindo depleção do TME pelo sistema imunológico do hospedeiro ( Figura 3C ). 

Por fim, nosso objetivo foi caracterizar as alterações precoces do TME como resultado da reprogramação in vivo de cDC1 nos primeiros 9 dias. Realizamos coloração por imunofluorescência de tecidos tumorais criopreservados e seccionados de tumores eGFP e PIB-eGFP após 3 e 9 dias de reprogramação in vivo , com foco na infiltração de células imunes marcadas pelo marcador pan-hematopoiético CD45. Notavelmente, as células semelhantes a cDC1 recrutaram significativamente mais células CD45 para o TME prontamente no dia 3, em comparação com os tumores eGFP (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 intensidade média de fluorescência eGFP da coloração CD45 por área tumoral; Figura 4A, B). Curiosamente, detectamos TLS dentro do TME de tumores após 9 dias de reprogramação in vivo . Isso sugere que as células semelhantes a cDC1 podem remodelar rapidamente o TME de um ambiente "imune-frio" para um ambiente "imuno-quente" em 3 dias, o que subsequentemente leva à formação de TLS no dia 9.

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Figura 1: Visão geral do protocolo para gerar células semelhantes a cDC1 por reprogramação in vivo de células cancerígenas. Os vetores lentivirais SFFV-PIB-IRES-eGFP-encoding PU.1, IRF8 e BATF3 em um policistrônico sob o controle do promotor do vírus formador de foco do baço (SFFV) e eGFP após um local de entrada do ribossomo interno (IRES) para rastrear células transduzidas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência - são produzidos na linha celular de empacotamento HEK 293T. Em seguida, os vetores lentivirais são ultracentrifugados e funcionalmente titulados para determinar a quantidade de vírus necessária para transduzir células cancerígenas em uma proporção de 1:1 eGFP+ transduzido para células eGFP- não transduzidas. Para experimentos de reprogramação in vivo , as células cancerígenas são revestidas com a quantidade ideal de lentivírus no dia -1. No dia seguinte, esta mistura 1:1 de células GFP+ transduzidas e GFP- não transduzidas é lavada e coletada para o estabelecimento de tumor subcutâneo em camundongos. Culturas paralelas in vitro são mantidas para validar a transdução no dia 3 por citometria de fluxo. Os animais são monitorados a cada 2-3 dias quanto ao crescimento e sobrevivência do tumor. Os tumores são coletados em pontos de tempo definidos, dissociados e corados para expressão de marcadores de superfície para análise de citometria de fluxo. Alternativamente, os tecidos inteiros são fixados, criopreservados e seccionados para coloração por imunofluorescência e análise de microscopia confocal. A eficiência de reprogramação in vivo é avaliada por análise de citometria de fluxo, enquanto as alterações no microambiente tumoral são caracterizadas por imagens confocais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Produção e titulação funcional de lentivírus para reprogramação in vivo de cDC1. (A) Quando as células HEK 293T atingem ~ 70-80% de confluência, elas são transfectadas com uma mistura contendo 10 μg de plasmídeo de transferência SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) ou controle de vetor lentiviral vazio SFFV-eGFP (eGFP), juntamente com 7,5 μg de psPAX2 e 2,5 μg de mPD2.G e 60 μL de 1 mg / mL PEI. Imagens de microscopia de campo claro e fluorescência de células HEK 293T mostrando expressão de eGFP 24 h após a transfecção, indicando entrega bem-sucedida de plasmídeo. Barras de escala = 200 μm. (B) Representação esquemática do fluxo de trabalho de ultracentrifugação para concentrar lentivírus. O sobrenadante contendo lentivírus de células HEK 293T é coletado 48 h e 60 h após a transfecção, filtrado através de filtro PES de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm e 37 g são pesados em tubos de polipropileno de parede fina de topo aberto usando uma balança de bancada. Os tubos são ultracentrifugados em um rotor de caçamba oscilante, o sobrenadante é aspirado e o pellet seco por 5 min. Os pellets são então ressuspensos em DMEM gelado contendo HEPES e incubados durante a noite antes de aliquotar e armazenar a -80 ° C. (C) Estratégia experimental da titulação funcional para determinar a dose viral ideal para atingir uma proporção de 1: 1 de células GFP + para GFP-. Imagens de microscopia de campo claro e fluorescência mostrando a expressão de eGFP em células de melanoma YUMM1.7, 72 h após a transdução, indicando a entrega bem-sucedida dos fatores de reprogramação e eGFP. Barras de escala = 100 μm. (D) Gráficos de citometria de fluxo representativos mostrando a estratégia de gating para quantificar a proporção de células eGFP+ . As células vivas foram fechadas para a população negativa do corante de viabilidade (DAPI) seguida de exclusão dupla. (E) Quantificação por citometria de fluxo da eficiência de transdução com doses virais crescentes para determinar o volume ideal para atingir células GFP+/GFP- 1 :1. Para o lentivírus PIB-eGFP e eGFP, o volume de 2 μL por 105 células atingiu a proporção desejada. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; PEI = polietilenimina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Avaliando a eficiência de reprogramação do cDC1 in vivo. (A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental para avaliar a eficiência de reprogramação do cDC1 in vivo. As células cancerígenas são inicialmente transduzidas com um lentivírus expressando mCherry para gerar uma linha celular marcada com fluorescência (YUMM1.7-mCherry), seguida de transdução com a dose otimizada de lentivírus PIB-eGFP no dia -1. As células são então injetadas por via subcutânea com uma proporção de 1:1 de células eGFP+/eGFP- no dia 0 para estabelecer tumores em camundongos CD45.1 e permitir que as células transduzidas por PIB se reprogramem em células semelhantes a cDC1 dentro do TME. Os tumores são então isolados em pontos de tempo indicados, dissociados e corados para CD45.1, CD45.2 e MHC-II usando citometria de fluxo. Isso permite a exclusão de células imunes do hospedeiro CD45.1 para quantificar in vivo a eficiência de reprogramação de cDC1 pela expressão de CD45.2 e MHC-II. Culturas in vitro paralelas são mantidas ao longo dos pontos de tempo como uma comparação com a reprogramação in vivo. (B) Gráficos de citometria de fluxo representativos ilustrando a estratégia de gating no dia 9. As células foram bloqueadas em mCherry+ e GFP+ para identificar células cancerígenas transduzidas com sucesso. As células imunes do hospedeiro foram excluídas por gating out de células CD45.1 +. (C) Quantificação da eficiência de reprogramação in vivo (à esquerda) de células YUMM1.7-mCherry por citometria de fluxo como a porcentagem de células CD45+ MHC-II+ (completamente reprogramadas) e células CD45.2+ HLA-DR- ou CD45.2- HLA-DR+ cDC1-like (parcialmente reprogramadas) controladas dentro de eGFP+ mCherry+ Células. Gráficos de citometria de fluxo representativos (à direita) mostrando a aquisição gradual da expressão de CD45.2 e MHC-II em células YUMM1.7-mCherry transduzidas por PIB-eGFP ao longo dos pontos de tempo indicados. Células YUMM1.7-mCherry transduzidas por eGFP foram usadas como controle e células semelhantes a cDC1 reprogramadas in vitro foram usadas para comparação. Os dados em (C) indicam ± DP médio de 3-5 experimentos de replicação biológica. A análise estatística em (C) foi realizada para células CD45+ MHC-II+ usando o teste de Mann-Whitney. *P < 0,05. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; TME = microambiente tumoral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Analisando a infiltração imune no microambiente tumoral após a reprogramação in vivo do cDC1. (A) Imagens confocais representativas mostrando células CD45+ em tumores YUMM1.7 após implantação subcutânea de células PIB-eGFP- ou células transduzidas por eGFP controle (proporção de 1:1 de células transduzidas para parentais) nos dias 3 e 9. Barras de escala = 500 μm. (B) Quantificação do MFI para coloração de CD45 em tumores YUMM1.7 tratados com PIB e transduzidos por eGFP de controle nos dias 3 e 9. Os dados em (B) indicam ± DP médio de 3-6 experimentos de replicação biológica. A análise estatística em (B) foi realizada por meio do teste de Mann-Whitney. *P < 0,05 e ***P < 0,001. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionais tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; MFI = intensidade média de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos um método tratável para gerar células semelhantes a cDC1 com base na reprogramação in vivo de células cancerígenas de tumores sólidos. Nossos resultados demonstram que a superexpressão de PU.1, IRF8 e BATF3 impulsiona a aquisição gradual de um fenótipo cDC1 no TME até o dia 9, após o qual as células semelhantes a cDC1 são esgotadas dos tumores. Em última análise, isso leva a um aumento na infiltração de células CD45 no TME no dia 3, fazendo com que a remodelação de um TME "imune-frio" se torne "imunoquente".

Os protocolos atuais para gerar cDC1 incluem enriquecimento de DCs autólogas do sangue periférico, diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas CD34+ ou diferenciação de células-tronco pluripotentes 14,15,16,17,18,19. No entanto, esses métodos apresentam fatores limitantes: maturação insuficiente, redução da apresentação de antígenos e capacidade de produção de citocinas/quimiocinas in vivo, suscetibilidade à imunossupressão, alta heterogeneidade de DC e baixo número de células geradas7. Aqui, fornecemos um protocolo que permite a geração escalável de células semelhantes a cDC1 in vivo para estudos funcionais e mecanísticos.

Com este método, testamos se a expressão da combinação de fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3 era suficiente para conduzir a reprogramação in vivo . Esse protocolo permite um controle preciso sobre a eficiência da entrega, pois a variação da dose de células geneticamente modificadas implantadas influencia diretamente na eficácia do tratamento. Mostramos anteriormente que 2% de células transduzidas, que correspondem a 0,15% de células CD45+ e MHC-II+ cDC1-like, são suficientes para induzir imunidade antitumoral20. Além disso, a rápida infiltração imunológica observada no dia 3 sugere que células parcialmente reprogramadas do tipo cDC1 são funcionalmente ativas in vivo, pois não há aumento substancial de células do tipo cDC1 totalmente reprogramadas neste momento. No futuro, será interessante desvendar o papel funcional de células semelhantes a cDC1 parcialmente versus totalmente reprogramadas na eficácia antitumoral usando vetores modificados contendo um gene suicida para induzir a morte celular em populações de células selecionadas em pontos de tempo definidos24. Este protocolo pode ainda ser usado para explorar a combinação com adjuvantes epigenéticos, o que pode aumentar a eficiência da reprogramação25. Finalmente, esse método também pode ser adaptado para gerar outros subtipos de DC in vivo, lançando diferentes tipos de respostas imunes, por exemplo, respostas antivirais ou tolerogênicas14. Além disso, podemos aproveitar a reprogramação in vivo como uma plataforma para realizar telas com código de barras para combinações de fatores de transcrição para gerar diversos tipos de células imunes. Essa possibilidade pode aumentar a flexibilidade dos tratamentos, aproveitando diversas propriedades funcionais de subconjuntos imunológicos específicos.

Em nosso estudo anterior, demonstramos que o ambiente imunossupressor in vivo não impede a reprogramação de células cancerígenas humanas em cDC1s imunogênicos20. Neste artigo, mostramos que em camundongos, a reprogramação é mais rápida e eficiente in vivo do que in vitro, sugerindo que a reprogramação aprimorada observada in vivo é um fenômeno conservado em ambas as espécies. No entanto, uma das limitações desse método é a falta do ambiente in vivo durante a entrega inicial do vetor; portanto, não pode discernir se as pistas ambientais afetam a eficiência da entrega in vivo. Isso deve ser determinado in situ comparando diferentes metades. Os vetores adenovirais, que identificamos como mais eficientes do que os vetores lentivirais para entrega in situ 20 , podem ser comparados a porções não virais, como RNAs lineares, circulares e autoamplificadores ou coquetéis de moléculas pequenas2 6,27.

Mostramos anteriormente que a reprogramação de cDC1 confere às células cancerígenas citocinas pró-inflamatórias e secreção de quimiocinas recrutadoras de linfócitos e processamento e apresentação profissional de antígenos em MHC-I e MHC-II em modelos de melanoma23,28. Isso resulta na remodelação do TME de um estado "imuno-frio" para um estado "imuno-quente", induzindo a formação de TLS, que aumenta a infiltração de células T efetoras citotóxicas, células NK e células B, e reduz as populações imunossupressoras, como células T reguladoras e exaustas20. Em pacientes, as respostas positivas à imunoterapia têm sido associadas à presença de TLS dentro dos tumores, onde o priming sustentado de células T e B contra antígenos tumorais gera respostas de anticorpos específicos do tumor29,30. No futuro, prevemos empregar este protocolo de reprogramação cDC1 tratável in vivo para desvendar os mecanismos de neogênese induzida por TLS, remodelação de TME e imunidade antitumoral em diferentes tipos de câncer e caracterizar se a produção de anticorpos específicos do tumor é estimulada.

Observamos anteriormente sinergismo entre a reprogramação in vivo de cDC1 e ICB com anti-PD-1 ou anti-CTLA-420. Isso sugere que o TME "imune-quente" criado pela reprogramação de cDC1 pode fornecer um ambiente favorável para possíveis combinações com outras imunoterapias, como ACT, incluindo células T receptoras de células T (TCR)-T, células T receptoras de antígeno quimérico (CAR)-T ou linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). Outra vantagem desse método é a possibilidade de realizar grandes triagens combinatórias ou CRISPR imparciais, nas quais receptores imunológicos, citocinas, quimiocinas ou linfotoxinas podem ser superexpressos ou esgotados em células semelhantes a cDC1 em tipos de tumores resistentes, desvendando assim o papel de vias distintas no aumento da imunidade mediada por cDC1. Em conclusão, o protocolo atual fornece um recurso valioso para uma ampla comunidade científica, uma vez que a reprogramação in vivo de cDC1 é uma plataforma flexível e poderosa para estudos mecanicistas e inovação terapêutica em imunoterapia contra o câncer.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.-F.P. tem participação acionária e atua em cargos de gestão na Asgard Therapeutics AB, que desenvolve imunoterapias contra o câncer baseadas em tecnologias de reprogramação DC in vivo. C.-F.P é um inventor das patentes concedidas US 11,345,891, JP 7303743 e CN ZL201880005047.3 e pedidos de patente WO 2018/185709 e WO 2022/243448 (juntamente com EA) detidos pela Asgard Therapeutics, que cobrem a abordagem de reprogramação celular descrita aqui.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Mariana Lopes e Camille Chatelain, membros do Laboratório de Reprogramação Celular em Hematopoiese e Imunidade, pela edição e revisão do manuscrito.

Este estudo foi realizado no contexto da Escola Nacional de Pesquisa ATMP, financiada pelo Conselho de Pesquisa da Suécia. Os projetos aqui discutidos foram cofinanciados pelo Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (866448-TrojanDC e 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), Conselho Europeu de Inovação (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), Conselho Sueco de Pesquisa (2020-00615), Agência Sueca de Inovação (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) e Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). A Fundação Knut e Alice Wallenberg, a Faculdade de Medicina da Universidade de Lund e a Região Skåne são reconhecidas pelo generoso apoio financeiro.

Disponibilidade de materiais:

Construções e vetores usados para reprogramação estão disponíveis na Asgard Therapeutics sob um contrato de transferência de material com a empresa. Todos os outros dados necessários para avaliar as conclusões do artigo estão presentes no texto principal ou nos materiais suplementares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 μ m filtro de ligação de baixa proteína, filtro de vácuo superior de garrafa de 150 mLFisher científico15983297
2-Mercaptoetanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Anticorpo monoclonal CD45 anti-camundongo (clone: 30-F11), IgG2b de rato e kappa;ThermoFisher Scientific14-0451-82
B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)O Laboratório Jackson002014
Seringas de insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 mL)Fisher Científico11395751
Camundongos C57BL/6JO Laboratório Jackson000664
Colagenase DSigma Aldrich11088882001
Filtro de células de falcão Corning para uso com tubos cônicos de 50mlSigma AldrichCLS352340
Cobertura de óculos Corning 24 x 50 mm Sigma AldrichCLS2975245
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)ThermoFisher ScientificD1306
DNase ISigma Aldrich10104159001
Corante de Viabilidade Fixável eBioscience eFluor 450Invitrogen65-0863-14
Solução de Recuperação de Antígeno IHC eBioscience - pH Baixo (10x)ThermoFisher Scientific00-4955-58
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher ScientificA5256701
Meio de montagem Fluoromount-GThermoFisher Scientific00-4958-02
Anticorpo GFP [Alexa Fluor 594]Novus BiológicosNB600-308AF594
Gibco DMEM / Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM / F-12)ThermoFisher Scientific31331028
Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco MEM (100x)ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Instituto Memorial do Parque Gibco Roswell (RPMI) 1640 MédioThermoFisher Scientific52400025
Piruvato de Sódio Gibco (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Solução Gibco Trypan Blue, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
Suplemento GlutaMAX ThermoFisher Scientific35050061
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-rato, policlonal, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11006
Células HEK 293TATTCCRL-11268
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)Sigma AldrichH9268
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicoseCytivaSH30243.01
Solução HyClone de Penicilina Estreptomicina 100x (Caneta / Estreptococos)CytivaSV30010
Solução salina tamponada com fosfato HyClone (PBS)CytivaSH30028.02
Cetaminol vet. Solução injetável 100 mg/mlMSD Saúde Animal SuéciaQN01AX03
Lâmina de micrótomo - C35PFM Médico207500005
Camundongo anti-CD45.2 (104), Superfície, APC, MonoclonalBiolenda109814
Mouse anti-MHCII (M5 / 114.15.2), Superfície, PE-Cy7, MonoclonalBiolenda107630
Soro de cabra normalAbcamAB7481
Soro de rato normal (estéril)Abcamab7488
Tubos de polipropileno de parede fina de topo abertoCiências da Vida Beckman Coulter326823
Paraformaldeído, 16% p/v aq. soln., sem metanolThermoFisher Scientific043368.9 milhões
pFUW-tetO-Batf3, um monocistrônico que codifica o mouse Batf3Addgene139837
pFUW-tetO-Irf8, um monocistrônico que codifica o mouse Irf8Addgene139838
pFUW-tetO-Pu.1, um monocistrônico que codifica o mouse Pu.1Addgene139839
Plasmídeo pMD2.GAddgene12259
Plasmídeo psPAX2Addgene12260
Plasmídeo SFFV-eGFP (eGFP)Clonagem interna-
Plasmídeo SFFV-mCherry (mCherry)Clonagem interna-
Plasmídeo SFFV-PIB-eGFP,  um policistrônico que codifica o mouse PU.1, IRF8 e BATF3 (PIB) Clonagem interna-Construções e vetores usados para reprogramação estão disponíveis na Asgard Therapeutics sob um contrato de transferência de material com a empresa
Polietilenonimina (PEI), Linear, MW 25000, Grau de TransfecçãoPoliciências23966
Caneta de Papanicolau com Barreira Hidrofóbica ReadyProbesThermoFisher ScientificR3777
Butirato de sódioSigma Aldrich303410
SacaroseSigma-AldrichS7903
Lâminas de microscópio de adesão SuperFrost PlusEprediaJ1800AMNZ
Composto Tissue-Tek OCTSakura Finetek4583
Enzima TrypLE Express (1x) sem vermelho de fenolThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold Intermédio, quadrado (15 x 15 x 5 mm)Sakura Finetek4566
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
Veterinário Xysol. Solução injetável 20 mg/mlVM PharmaQN05CM92
Células YUMM1.7Antineo

Referências

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