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Artigo de método

Métodos eletrofisiológicos para avaliar o bloqueio de dor periférica em um rato anestesiado

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DOI:

10.3791/68740

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21 de novembro de 2025

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1Department of Physical Medicine and Rehabiliation, The MetroHealth System, 2Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Case Western Reserve University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um método para avaliar a ativação e o bloqueio dos axônios sensoriais nos nervos periféricos em experimentos agudos, anestesiados e in vivo com ratos, utilizando dois tipos de medições eletrofisiológicas da coluna vertebral que podem discriminar a atividade dos subtipos de fibras nervosas: Potenciais de Campo Local e registros de neurônios únicos em Faixa Dinâmica Ampla.

Resumo

Registros eletrofisiológicos in vivo da região lombar da coluna do rato podem ser usados para estudar a ativação de sinais sensoriais neurais nos membros posteriores, bem como a eficácia de intervenções terapêuticas que interrompem sinais de dor ascendentes.

Aqui, descrevemos os procedimentos cirúrgicos (laminectomia e exposição ao nervo ciático), coleta de dados e análise de dois sinais eletrofisiológicos complementares: registros de potencial de campo local e registros de neurônios únicos em ampla faixa dinâmica. Ambos diferenciam a ativação de subclasses de fibras nervosas com base na velocidade de condução relativa a um pulso de estimulação elétrica.

Potenciais de campo local (LFP) podem diferenciar entre fibras nervosas A α/β e C, mas não conseguem detectar atividade Aδ. Eles fornecem informações sobre a ativação global de toda a ciática. Após a estimulação elétrica direta do nervo ciático usando um eletrodo bipolar estilo J-cuff, as medições da área sob a curva dos dois vales correspondentes a cada componente são calculadas.

Registros de neurônios únicos de ampla faixa dinâmica (WDR) avaliam a atividade de um subconjunto de ativação ciática e podem diferenciar os tipos de fibras Aα/β, Aδ e C. A estimulação elétrica pode ser aplicada diretamente na ciática, como na LFP, ou por meio de eletrodos de agulha colocados na superfície plantar da pata traseira. Esse sinal de frequência mais alta gera picos elevados de potencial de ação sinal-ruído. Contagens de picos dentro de janelas de latência predefinidas refletem o nível de atividade dos vários tipos de fibra.

Até o momento, essas técnicas foram usadas para avaliar as propriedades temporais de três diferentes modalidades de bloqueio de dor: bloqueio elétrico de corrente contínua usando um eletrodo de interface nervosa separada por carbono (CSINE) personalizado, corrente alternada de frequência de quilohertz e fotobiomodulação usando um laser de 830 nm. Essa preparação cirúrgica tem sido usada para intervenções de bloqueio nervoso por até 5 horas.

Introdução

Bloquear diretamente sinais de dor nos nervos periféricos antes de alcançar a medula espinhal tem potencial para várias aplicações de tratamento da dor, como osteoartrite no joelho e síndrome do membro fantasmapós-amputação 1,2,3,4. Em geral, tais intervenções de terapia da dor reduziriam ou eliminariam os efeitos colaterais sistêmicos observados nos atuais anestésicos farmacêuticose anestésicos 1,2.

Dois tipos de medições eletrofisiológicas complementares podem ser registradas a partir da medula espinhal lombar para avaliar a ativação sensorial periférica: potenciais de campo local (LFP)3,4 e registros de neurônios individuais de ampla faixa dinâmica (WDR). A LFP pode ser registrada a partir das colunas dorsais da coluna. Eles são usados para medir a ativação de todo o nervo ciático; a LFP representa as respostas de muitas células, incluindo potenciais pós-sinápticos excitatórios nos dendritos e potenciais de ação registrados nos terminais soma e axônico. Eles foram usados para estudar a neuroplasticidade da medulaespinhal 3 e os efeitos de alívio da dor da estimulação elétrica da medulaespinhal 8. A partir dos sinais de LFP, pode-se medir a amplitude de grandes Aα/β mielinizadas, bem como a amplitude das fibras Cnão mielinizadas 3. Neurônios WDR estão presentes no chifre dorsal da medula espinhal L4 e L5. Esses neurônios são multirreceptivos; eles recebem e transmitem fielmente a entrada de todas as subclasses de neurônios sensoriais: fibras Aδ e C nociceptivas, e fibras Aα/β nãonociceptivas 7,9,10,11. Portanto, com base na latência em relação ao estímulo sensorial, a atividade dos neurônios WDR fornece informações detalhadas sobre a atividade sensorialperiférica 5. Tais gravações já foram usadas anteriormente para avaliar bloqueios sensoriais usando corrente contínua (DC)9 e corrente alternada de frequência kilohertz (KHFAC)10. Ambas as técnicas utilizam a latência dos sinais registrados para discriminar entre as várias subclasses de fibras sensoriais periféricas do nervo; Isso se deve às diferentes velocidades de condução das subclasses de fibrasnervosas 12. Os sinais são complementares porque as gravações do LFP refletem a atividade de todo o nervo ciático, mas só conseguem distinguir Aα/β das fibras C e não detectam Aδ, 13,14. Ao mesmo tempo, os registros de WDR refletem a atividade de uma subpopulação de fibras do nervo ciático, mas podem discriminar as fibras Aα/β, Aδ eC 7,9,10,11. Essa desvantagem pode ser superada por matrizes de eletrodos multicontato para registrar simultaneamente múltiplos neurôniosWDR 15.

Diferentes subtipos de fibras nervosas periféricas transmitem diferentes tipos de sinais sensoriais ou motores. Por exemplo, fibras sensoriais grandes e mielinizadas transmitem sinais táteis, enquanto fibras menores, não mielinizadas, transmitem sinaisde dor 16, 17 e 18. Ao avaliar tecnologias de bloqueio nervoso, é importante entender quais subtipos de fibras são principalmente afetados, pois seria clinicamente vantajoso bloquear sinais de dor enquanto preserva a sensação tátil. Além disso, propriedades complexas temporais do bloqueio do nervo periférico foram observadas. Por exemplo, a lidocaína anestésica local inicialmente bloqueia apenas fibras C não mielinizadas, depois bloqueia as fibras mielinizadas19. Após um bloqueio completo de todas as fibras nervosas com lidocaína, diferenças nos tipos de fibras também foram observadas na recuperação dobloco 20. A técnica eletrofisiológica descrita aqui permite aos pesquisadores elucidar as propriedades temporais das metodologias de bloqueio dos nervos periféricos nas várias subpopulações de fibras sensoriais nervosas. Até o momento, usamos esse método para avaliar blocos usando blocos elétricos de correntecontínua 21,22, bloco elétrico de corrente alternada de frequência kilohertz23 e fotobiomodulação usando comprimentos de onda infravermelhopróximo 24,25. Essas técnicas também seriam adequadas para investigar outras intervenções que atuam localmente em um nervo periférico, como frio, calor e injeçõesquímicas 26,27,28.

A avaliação das terapias para nervos periféricos frequentemente utiliza modelos de doençasinflamatórias 29 ou dor neuropática30 , combinadas com testes comportamentais de hipersensibilidade mecânica etérmica 31. Os métodos eletrofisiológicos descritos aqui podem quantificar as mudanças na atividade neural que contribuiriam para a redução da sensação de dor. Além disso, podem fornecer dados úteis sobre quaisquer efeitos indesejáveis do bloqueio nervoso periférico, como o bloqueio de grandes fibras sensoriais envolvidas na sensação tátil.

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Protocolo

Esse protocolo envolvendo experimentos com animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University (CWRU). A Case Western Reserve University é uma instituição credenciada pela AAALAC e está em conformidade com as leis e regulamentos federais, estaduais e locais apropriados, bem como com as políticas institucionais. Nosso grupo de pesquisa foi treinado e certificado pela equipe da CWRU. Ao trabalhar em protocolos aprovados pela IACUC, seguimos a política do Serviço de Saúde Pública e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição)32.

NOTA: Os parâmetros para ventilação, anestesia e outros medicamentos descritos aqui foram usados com sucesso em ratos adultos de ambos os sexos na faixa de peso de 350-500 g.

1. Anestesia e ventilação

  1. Induza anestesia em uma caixa acrílica lacrada com isoflurano a 5%. Quando o rato estiver completamente inconsciente, vá para um cone do nariz para se barbear. Usando uma máquina de cortar elétrica, remova o pelo das costas e da pata traseira esquerda da crista ilíaca até a articulação do joelho.
    NOTA: O rato está pronto para a intubação quando a respiração espontânea ocorre a uma taxa de 15-30 respirações/minuto.
  2. Intube o rato em posição supina com a bainha de um cateter angiocath IV de 14 G (um cateter de 16 G pode ser mais adequado para animais menores) e um laringoscópio com lâmina tamanho Miller 0 ou 00.
  3. Para melhorar a visibilidade das cordas vocais, apoie suavemente a língua usando pinças que não esmaguem. Valide a intubação por excursão torácica e frequência ventilatória, que coincide com a taxa de elevação torácica.
  4. Use ventilação sob pressão positiva com uma taxa de curso de 60/min e um volume de 3-5 cc/stroke, mantendo a concentração de isoflurano entre 1% e 3%.
  5. Cateterize uma veia caudal caudal lateral com cateter intravenoso de 22 G. Para melhorar a visibilidade, limpe a veia caudal do lado lateral da cauda com água morna e álcool isopropílico a 70%.
  6. Injete aproximadamente 1 mL de soro fisiológico estéril enquanto monitora cuidadosamente o fluxo através do cateter. Qualquer edema indica colocação incorreta do cateter.
  7. Usando tubos de polietileno, conecte o cateter inserido a uma seringa de solução de rocurônio (2 mg/mL) montada em um driver de seringa. Não inicie a infusão até estar pronto para realizar as gravações da coluna.

2. Cirurgia

NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados na base de um aparelho estereotáxico de pequenos animais. O restante dos equipamentos estereotáxicos pode ser montado em etapas à medida que a cirurgia avança.

  1. Cirurgia da coluna
    1. Para um cirurgião destro, posicione o rato com a cauda para a direita e a cabeça para a esquerda. Um cirurgião canhoto pode preferir posicionar o rato com a cabeça para a direita.
    2. Sinta a costela mais caudal no flanco esquerdo do rato e siga até a espinha. Usando um bisturi, faça uma incisão na linha média de aproximadamente 60 mm centrada neste ponto.
    3. Use o bisturi para raspar o tecido dos processos espinhosos. Use tesouras para expor as costelas e localizar a costela mais caudal.
    4. Usando a técnica de dissecação romba (insira tesouras fechadas, depois tesouras abertas para separar o tecido), confirme a costela caudal visual e tátilmente. Use um microscópio cirúrgico nessa etapa (ampliação de 3,5x a 45x). A costela caudal se une à face rostral da vértebra T13. Marque o processo espinhoso T13 usando um marcador permanente.
    5. Estabilize a coluna usando pinças vertebrais nas vértebras T11 e L4. Para isso, use dissecação romba para criar um bolso em ambos os lados de cada vértebra.
    6. Deslize os dois postes verticais com suportes base na trilha em T na plataforma estereotax, alinhe-se com as vértebras T11 e L4, mas não aperte. Insira os eixos cilíndricos das pinças das vértebras nas pinças de poste, mas não aperte.
    7. Começando pelo T11, segure a coluna usando pinças dentadas, insira as mandíbulas dos grampos da coluna em cada lado das vértebras, aproximadamente a 45° da vértebra T13, e aperte as mandíbulas da pinça da coluna. Depois, aperte o eixo do grampo de coluna no grampo de poste. Repita esse processo para a vértebra L4.
    8. Eleve ambos os pinças de poste para levantar a coluna de modo que o torso do rato seja sustentado pelas grampos da coluna (Figura 1A). Isso reduz artefatos de movimento relacionados à respiração nos registros eletrofisiológicos.
    9. Marque a posição rostro-caudal dos processos espinhosos T13 e L1 usando suturas individuais na superfície muscular lateralmente à coluna.
      NOTA: Os marcos do processo espinhoso serão removidos durante a laminectomia.
  2. Laminectomia
    1. Posicione temporariamente a estrutura estereotáxica em forma de U para que o trilho horizontal possa ser usado para apoiar os calcanhares das mãos durante esse procedimento delicado (Figura 1B). Deve ser removido antes da cirurgia do nervo ciático.
    2. Limpe músculos e tecido conjuntivo da superfície das lâminas vertebrais entre T12 e L3 usando pinças dentadas, tesoura e raspagem com bisturi. Sob microscópio cirúrgico, utilize os Rongeurs de Friedman-Pearson para remover as lâminas vertebrais de L2 a T13.
    3. Para começar, posicione os rongeurs próximos à horizontal e dê pequenas mordidas da parte caudal do L2, onde ela se sobrepõe ao L3. Estenda a laminectomia rostral para expor a linha média da medula espinhal, tomando cuidado para minimizar a pressão sobre a medula e eliminando regularmente fragmentos ósseos dos guardas.
    4. Por fim, estenda a laminectomia lateralmente 2 mm de cada lado da linha média. Remova a dura-máter da medula espinhal exposta usando pinças finas e tesoura de mola.
    5. Coloque a dura-máter na tenda antes de fazer qualquer corte. Uma pequena quantidade de líquido cefalorraquidiano fluirá da dura-máter-máter após o primeiro corte. Absorva suavemente com um pedaço torcido de tecido sem fiapos antes de remover o restante da dura-mater.
    6. Cubra a laminectomia com um pedaço de tecido umedecido com soro até o período de registro eletrofisiológico.
  3. Cirurgia do nervo ciático
    1. Remova a estrutura estereotáxica em forma de U para acessar a perna do animal. Expor o nervo ciático na parte média da coxa fazendo uma incisão com um bisturi (Figura 1C). Limpe o tecido conjuntivo do nervo usando dissecação contunda. A quantidade de nervo exposto vai depender se o nervo está sendo estimulado eletricamente.
    2. Coloque o dispositivo para um bloqueio nervoso adjacente ao nervo exposto. Certifique-se de que o eletrodo de estimulação e o dispositivo de bloqueio nervoso estejam ambos próximos ao ponto de ramificação onde a ciática se divide nos nervos tibial, sural eperoneal 33. Substitua a estrutura de estereotaxa e adicione o braço de estereotaxa para preparar gravações eletrofisiológicas (Figura 1D).
    3. Realize estimulação para registros de neurônios WDR seja na superfície plantar da pata traseira ou por meio de estimulação direta da ciática usando um eletrodo do manguito nervoso. Para gravações de LFP, realize a estimulação por meio de estimulação direta do nervo, pois a ativação por estimulação do pé faz com que a incisura da fibra C fique muito difusa para ser detectada.
    4. Se a estimulação sensorial estiver sendo aplicada diretamente ao nervo ciático, coloque um eletrodo bipolar de platina no estilo J-cuff personalizado ao redor do nervo34, contato exposto de tamanho 1 mm x 3 mm (eletrodos comparáveis para cuff nervoso podem ser feitos sob medida pela MicroProbes for Life Science, Gaithersburg, MD, ou World Precision Instruments, Sarasota, FL).
    5. Para a estimulação direta mais eficaz do nervo, certifique-se de que o eletrodo seja colocado proximal ao ponto de ramificação onde a ciática se divide nos nervos tíbio, sural eperoneal 33.
    6. Para estimulação plantar, insira dois eletrodos de agulha de aço inoxidável de 13 mm, dentro do5º e fora do4º dedo, próximos à superfície plantar.

3. Estimulação elétrica

  1. Se estiver usando estimulação do manguito nervoso, inicie a infusão sistêmica de solução de rocurônio (2 mg/mL a uma taxa de 1-1,4 mL/h). A infusão sistêmica de rocurônio deve fazer efeito em 30-60 segundos. Procure movimentos relacionados à estimulação na pata traseira e ajuste a taxa de infusão conforme necessário para garantir que todo movimento seja eliminado.
  2. Aplique estimulação elétrica controlada por corrente na superfície plantar do pé ou no nervo ciático usando um estimulador de pulso isolado retangular bifásico, usando parâmetros de estimulação: largura do pulso 1-5 ms, frequência do pulso 0,1-0,2 Hz, amplitude 1-10 mA de pico a pico.
  3. Ajuste os parâmetros de estimulação durante os registros eletrofisiológicos, descritos na seção a seguir, para garantir a máxima estimulação de todos os subtipos de fibras.
  4. O estimulador possui um sinal de saída de gatilho, separado do pulso de estimulação controlado por corrente. Conecte isso ao dispositivo de aquisição de dados para sincronizar os dados eletrofisiológicos com o pulso de estimulação. Veja a próxima seção para mais detalhes.

4. Registros eletrofisiológicos

  1. Insira agulhas hipodérmicas (21 G, 1 1/2 polegada) no músculo de cada lado da coluna, paralelas à coluna. Conecte a agulha de aterramento à carcaça metálica de cada um dos estágios da cabeça.
  2. Conecte a agulha de referência a cada uma das entradas de referência nos estágios da cabeça. Cada um dos 8 canais do amplificador possui sua própria porta de saída BNC, conectada a um canal analógico-digital separado no dispositivo de aquisição de dados.
  3. Digitalize os sinais continuamente (frequência de amostragem de 20 kHz) e exiba (software Spike2). Usando um cabo BNC, conecte a saída de pulso de disparo (rotulada como 'TRIG OUT') do estimulador de pulso isolado a um dos canais digitais de entrada do dispositivo de aquisição de dados.
  4. No software, configure o canal de gatilho para registrar Eventos. Isso permitirá a análise dos sinais LFP ou WDR relativos ao tempo de cada estimulação elétrica.
    NOTA: Gravações LFP e WDR podem ser feitas com a mesma matriz personalizada de microeletrodos (matriz multieletrodo de 1 x 8, espaçamento de 500 μm entre eixos, impedância de 1 MΩ, feita sob medida). Profundidade de penetração e configurações de filtro passa-banda do amplificador são as principais diferenças entre os tipos de sinal. O array era mantido e conectado à estéreotaxa usando um conector personalizado impresso em 3D (Figura 2A). No entanto, uma alternativa comercialmente disponível está disponível (Figura 2B, Suporte de Eletrodo Padrão [Tabela de Materiais]).
  5. Para LFPs, insira a matriz orientada na direção rostrocaudal, com o eletrodo mais rostral, ao nível da sutura, marcando o processo espinhoso T13, próximo da linha média, sem danificar o vaso sanguíneo médio. Os sinais mais fortes estão entre a superfície do cordão e a 300 μm de profundidade.
  6. Ajuste os filtros passa-banda do amplificador para 10-100 Hz, com ganho de 1.000x. Adicione um filtro de entalhe de 60 Hz (ou 50 Hz, dependendo da localização geográfica) para remover o ruído da rede elétrica. A qualidade da intensidade do sinal variará entre as instalações. Selecione o melhor sinal para usar para análises adicionais.
  7. Os neurônios WDR estão distribuídos por todo o aumento lombar da medula espinhal, no chifre dorsal de 600-1200 μm de profundidade e de 200-800 μm de lateral a linha média, ipsilateral à estimulação. Ajuste filtros passa-banda no amplificador para 300-10.000 Hz, com ganho de 10.000x. Use um filtro de entalhe para essas gravações também, embora o ruído principal normalmente seja removido pelo filtro passa-banda.
  8. Ajuste os parâmetros de estimulação enquanto observa o sinal eletrofisiológico. Ajuste a amplitude da estimulação e a largura do pulso para garantir a máxima ativação de todos os subtipos de fibras nervosas.
    NOTA: Fibras mielinizadas grandes (Aα/β) apresentam os limiares de ativação mais baixos, seguidas pelas fibras mielinizadas pequenas (Aδ). Fibras C não mielinizadas requerem larguras e amplitudes de pulso de estimulação maiores para gerar potenciais de ação por meio de estimulação elétrica.
  9. A partir de 1 ms de largura de pulso, aumente a amplitude até que todos os componentes do sinal sejam vistos. Se as fibras C de limiar mais alto não forem vistas, aumente a largura do pulso de estimulação.
  10. Para gravação LFP, observe a latência curta, a resposta da fibra A de baixo limiar entre 40-100 ms, e a resposta da fibra C de latência mais longa e alto limiar entre 150-350 ms (Figura 3B)3,8.
  11. Para registros de WDR, use as seguintes latências pós-estímulo para identificar subtipos de fibras nervosas: Aα/β: 0 - 25 ms, Aδ: 25 - 100 ms e C: 100-500 ms (Figura 3C) 5,6,7.

5. Bloqueio do nervo periférico

  1. Utilizando um eletrodo de interface nervosa separada por carbono (CSINE)21, aplique corrente contínua catódica de 0,1 a 5 mA no nervo ciático, proximal ao manguito estimulante (se aplicável). Exemplos de testes em bloco de gravações LFP e WDR são mostrados nas Figuras 4 e 5.

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Resultados

Os dados gerados com esse protocolo permitem avaliar a quantidade relativa de bloqueio para subclasses de fibras sensoriais do nervo. Também permite avaliar as propriedades temporais do bloco; tanto a taxa com que o bloqueio é induzido quanto a taxa de recuperação após a cessação do estímulobloqueante 35. Para as medições de LFP, a ativação das fibras é determinada calculando a área sob a curva para o período de tempo específico correspondente ao tipo de fibra de ...

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Discussão

Este método descreve a coleta de dois sinais eletrofisiológicos complementares que podem ser usados para medir a eficácia de intervenções potencialmente terapêuticas para bloquear sinais sensoriais nos nervos periféricos.

Potenciais de campo local (LFP) podem ser registrados das colunas dorsais da coluna vertebral usando microeletrodos de alta impedância (1 MΩ). Eles são usados para medir a ativação de todo o nervo ciático; a LFP representa as respostas de mui...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo NIH NINDS R01NS116009.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 x 8 matriz multieletrodo, 500 & micro; espaçamento m entre os eixos  MicrosprobasProduto personalizadoMatriz personalizada de microeletrodos  
14 G de cateter angiogênicoBencton DickinsonSKU: 381164, GTIN: 382903811649
Bioamplificador de 8 canaisInstrumentos de Precisão MundialISO-DAM8AEstágio principal
Microscópio estéreo triocular zoom série AmScope SM-6T 3,5-45x Ampliação com braço articulado com luz anelarAmscopeSM-8TW2-144SMicroscópio cirúrgico
Dispositivo de aquisição de dados  Cambridge Electronic DesignPower1401-3A
Pinça Dumont #5Ferramentas Científicas Finas11251-20
Friedman-Pearson Rongeurs (tamanho de copo de 1mm)Ferramentas Científicas Finas16021-14
Ventilador de aparelho HarvardAparato de Harvard Modelo 683
Isoflurane, USPPiramel Cuidados Críticos66794-017-25
LaringoscópioSarnova HC301-B802
Lâmina laringascópica Miller 00Sarnova HC301-B5100-20
Agulhas subdérmicas pareadasRhythmLinkRLSND121-1.0Eletrodos de agulha de aço inoxidável de 13 mm  
Rocuronium bromium, USPSolco43547-530-10
Spike2Cambridge Electronic Design
Estimulador de pulso isolado por onda quadrada  Sistemas AMModelo 2100Estimulador de pulso retangular bifásico isolado
Plataforma estereotáxica  com  suportes base ajustáveis   com pino e grampoInstrumentos David KopfModelo 982
SureSite IV 22G x 1" cateter de segurança  MedlineDYNA2210022 G de cateter intravenoso  
Condutor de seringaCole ParmerModelo 74900
Micro manipulador ultra preciso
resolução de 10 micrômetros		Instrumentos David KopfModelo 961
Suporte universalInstrumentos David KopfModelo 1772 Conector alternativo impresso em 3D  
Quadro estereotáxico em formato de U  Instrumentos David KopfModelo 1430
Tesoura mola Vannas - lâmina de corte de 2 mmFerramentas Científicas Finas15000-03 
Pinças de vértebras  Instrumentos David KopfModelo 986C 

Referências

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