Fluxo de trabalho de caracterização de neuropeptídeos da amostragem à espectrometria de massa de aquisição independente de dados

Summary

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho neuropeptidômico abrangente no tecido cerebral de ratos que combina espectrometria de massa de aquisição dependente de dados-acumulação paralela-fragmentação serial (DDA-PASEF) e aquisição independente de dados (DIA).

Abstract

Os neuropeptídeos endógenos são moduladores-chave da função cerebral, desempenhando papéis críticos no comportamento, estresse, dor e regulação homeostática, mas sua análise permanece difícil. Biologicamente, eles são baixos em abundância, rapidamente degradados e processados de forma variável a partir de proteínas precursoras, com expressão limitada a pequenas populações de células localizadas. Tecnicamente, sua detecção é complicada por uma ampla faixa dinâmica, diversas modificações pós-traducionais e sinais esparsos em conjuntos de dados de espectrometria de massa. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho abrangente para análise de neuropeptídeos no tecido cerebral de Rattus norvegicus usando espectrometria de massa (MS) de aquisição dependente de dados (DDA) e aquisição independente de dados (DIA) em uma plataforma timsTOF. Após a preparação otimizada da amostra cerebral, incluindo dissecação, extração e limpeza de peptídeos, a nano cromatografia líquida (LC)-MS é realizada com fracionamento em fase gasosa de mobilidade iônica para melhorar a sensibilidade e a precisão da detecção. A biblioteca espectral gerada por DDA suporta quantificação baseada em DIA no Skyline, permitindo medições de nível MS2 de alta confiança. Esse fluxo de trabalho integrado aumenta a cobertura de neuropeptídeos e aumenta a reprodutibilidade quantitativa, fornecendo uma plataforma robusta para estudar neuropeptídeos em tecidos cerebrais complexos.

Introduction

Os neuropeptídeos são uma classe funcionalmente diversa de moléculas de sinalização endógena que servem como moduladores críticos da comunicação neuronal, funções do sistema nervoso e neuroendócrino. Atuando como neuromoduladores, hormônios ou cotransmissores, eles influenciam uma ampla gama de processos fisiológicos, incluindo modulação da dor, resposta ao estresse, regulação circadiana e controle do apetite. Ao contrário dos neurotransmissores clássicos, que são sintetizados como pequenas moléculas, os neuropeptídeos são codificados dentro de grandes proteínas precursoras que são sintetizadas por meio da tradução de mRNA. As proteínas precursoras, ou pró-hormônios, passam por processamento proteolítico para liberar os peptídeos ativos, que são empacotados em vesículas de núcleo denso (DCVs). Após a estimulação, os neuropeptídeos são liberados para exercer efeitos modulatórios, geralmente mais lentos e prolongados, por meio de interações com receptores acoplados à proteína G. Sua importância na manutenção da função do sistema nervoso central e periférico os tornou uma área de intenso interesse biológico e clínico 1,2,3,4,5.

Apesar de sua relevância, os neuropeptídeos permanecem analiticamente difíceis de caracterizar. Suas estruturas altamente heterogêneas - variando de sequências curtas a estendidas, muitas vezes apresentando diversas modificações pós-traducionais (PTMs), como amidação, acetilação, fosforilação, isomerização de aminoácidos ou truncamento - levam à variabilidade nos comportamentos de ionização e fragmentação na espectrometria de massa (MS) ^{1 , 6 , 7 , 8}. Além disso, eles estão tipicamente presentes em baixas concentrações em relação aos componentes da matriz biológica, facilmente degradados e estão localizados de maneira espacialmente restrita dentro do complexo tecido do sistema nervoso. Essas características complicam tanto a identificação quanto a quantificação, particularmente ao usar abordagens proteômicas tradicionais que dependem de digestão enzimática previsível e propriedades peptídicas uniformes ^9,10,11.

Aqui, apresentamos uma estratégia abrangente para a identificação e quantificação de peptídeos endógenos no cérebro de Rattus norvegicus, com ênfase específica em neuropeptídeos. O fluxo de trabalho aqui começa com procedimentos otimizados de amostragem cerebral, seguidos por extensas separações de cromatografia líquida (LC) e conclui com análise de MS de alta resolução usando fragmentação serial de acumulação paralela (PASEF) em uma plataforma de espectrometria de mobilidade iônica aprisionada (TIMS) 12,13,14,15,16. Ao incorporar o fracionamento em fase gasosa de mobilidade iônica (IM-GPF) antes da seleção do precursor, a abordagem PASEF de aquisição dependente de dados (DDA-PASEF) permite uma melhor separação de precursores e a detecção aprimorada de neuropeptídeos de baixa abundância, muitos dos quais seriam perdidos em fluxos de trabalho DDA unidimensionais¹⁷.

Embora o DDA continue sendo a estratégia mais comumente usada na identificação de peptídeos devido aos seus espectros MS / MS de alta qualidade, ele é inerentemente limitado por sua dependência da seleção de íons precursores por intensidade, o que influencia contra espécies de baixa abundância^{18 , 19 , 20} . Além disso, sua amostragem semi-estocástica leva à falta de valores entre as repetições, dificultando a quantificação reprodutível. Para superar essas limitações, construímos uma biblioteca espectral robusta usando nossos dados DDA-PASEF, que podem ser posteriormente empregados para análise de aquisição independente de dados (DIA). Em contraste com o DDA, o DIA coleta amostras de todos os íons precursores dentro de janelas m / z definidas, garantindo uma amostragem consistente de peptídeos abundantes e raros e, quando combinado com a biblioteca espectral e a análise direcionada no Skyline, permite a quantificação sensível e reprodutível no nível MS2^{21 , 22 , 23 , 24} .

Essa abordagem integrativa - abrangendo extração de peptídeos cerebrais, separação cromatográfica, aquisição de MS aprimorada por mobilidade iônica e quantificação híbrida baseada em DDA / DIA - foi desenvolvida com a complexidade dos neuropeptídeos em mente. Ele maximiza a cobertura de peptídeos enquanto minimiza a perda de dados, abordando as principais limitações de uma peptidomética mais simples orientada por DDA. Como tal, apresentamos uma plataforma flexível e poderosa para explorar a paisagem dos neuropeptídeos no cérebro de mamíferos, que pode ser prontamente adaptada a uma ampla gama de questões experimentais e amostras de tecido.

Protocol

Todos os experimentos com animais neste estudo foram conduzidos de acordo com o protocolo de uso de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Illinois (23228) com estrita adesão aos padrões nacionais e ARRIVE para o tratamento ético e cuidados com animais.

1. Dissecção de animais e isolamento cerebral

1. Realize a perfusão salina fria imediatamente seguida de congelamento do tecido para preservar a integridade do neuropeptídeo, minimizar os artefatos de degradação e melhorar a qualidade dos dados para análise peptidômica a jusante.
2. Eutanasiar o rato usando o método CO₂ seguindo as diretrizes institucionais de cuidados com os animais. Confirme a morte por ausência de batimentos cardíacos e falta de reflexos.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal; Faça uma incisão para expor a cavidade torácica.
4. Faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo do coração.
5. Faça uma pequena incisão no átrio direito para permitir a saída de sangue e solução de perfusão.
6. Insira uma ponta de pipeta de plástico cortada no tamanho certo conectada a uma seringa de 60 mL cheia de 50 mL de solução fisiológica gelada (por exemplo, solução salina a 0.9% ou mGBSS) no ventrículo esquerdo.
7. Perfunda o corpo do animal com a solução. Decapite o rato usando uma tesoura afiada ou uma guilhotina.
8. Remova a pele e o crânio que cobrem o cérebro com rongeurs ou tesouras finas.
9. Levante cuidadosamente o cérebro da cavidade craniana, cortando os nervos cranianos conforme necessário.
10. Congele imediatamente o cérebro em gelo seco ou congele em isopentano resfriado em gelo seco.
11. Transfira para criogenials ou papel alumínio rotulados e armazene a -80 ° C.

2. Extração de peptídeos do tecido cerebral de ratos

1. Para amostras de cérebro inteiro, pesar cada tecido congelado rapidamente usando uma balança analítica. Homogeneizar o tecido usando solução de grau LC-MS contendo 10% de ácido acético glacial e 1% de água em metanol, usando uma proporção de 10:1 (v/m) de solvente para tecido.
2. Incubar as amostras homogeneizadas em gelo por 20 min.
3. Centrifugar as amostras a 16.000 × g durante 20 min a 4 °C. Recolha cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o gancho.
4. Ressuspenda o pellet em água de grau LC-MS, usando uma proporção de 10:1 (v/m) solvente/tecido, e repita a incubação em gelo por 20 min.
5. Centrifugar novamente nas mesmas condições (16.000 × g, 20 min, 4 °C) e recolher o segundo sobrenadante.
6. Combine os dois sobrenadantes e transfira 1/10 do volume total para um novo tubo para processamento a jusante. Secar esta alíquota com um concentrador de vácuo até secar completamente. Conservar o extracto restante a -80 °C para utilização futura.

3. Extração em fase sólida (SPE) usando colunas de centrifugação C18

NOTA: Todos os solventes devem ser de grau LC-MS. Salvo indicação em contrário, as etapas de centrifugação são realizadas a 1.500 × g à temperatura ambiente usando uma centrífuga de bancada.

1. Preparação de reagentes
   1. Prepare a solução de ativação (A): 50% de acetonitrila / 50% de ácido fórmico a 0,1% em água.
   2. Prepare a solução de equilíbrio e lavagem (B): 0,1% de ácido fórmico em água.
   3. Prepare a solução de eluição (C): 50% de acetonitrila / 50% de ácido fórmico a 0,1% em água.
2. Preparação da amostra
   1. Reconstituir o extracto peptídico seco em 200 μL de solução (B).
   2. Centrifugar a amostra a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C.
   3. Recolha cuidadosamente o sobrenadante para SPE.
3. Condicionamento e equilíbrio de colunas
   1. Adicionar 150 μL de solução (A) à coluna de centrifugação C18.
   2. Centrifugue por 1 min a 1.500 × g.
   3. Repita as etapas 3.3.1 e 3.3.2 duas vezes para garantir a ativação completa.
   4. Adicionar 150 μL de solução (B).
   5. Centrifugue por 1 min.
   6. Repita as etapas 3.3.4 e 3.3.5 duas vezes.
4. Carregamento e lavagem de amostras
   1. Carregar 200 μL da solução de amostra preparada na coluna.
   2. Centrifugue por 1 min.
   3. Recarregue o fluxo de volta na coluna três vezes para maximizar a retenção de peptídeos.
   4. Adicionar 150 μL de solução (B).
   5. Centrifugue por 1 min.
   6. Repita as etapas 3.4.4 e 3.4.5 três vezes para remover contaminantes não retidos.
5. Eluição peptídica
   1. Adicionar 150 μL de solução de eluição (C) à coluna.
   2. Centrifugue por 1 min.
   3. Repita as etapas de eluição 3.5.1-3.5.2 mais uma vez.
   4. Combine os dois eluatos e armazene no gelo ou prossiga para secar sob vácuo.

4. Análise LC-MS/MS

1. Prepare a solução (A): 0,1% de ácido fórmico em água, solução; (B): 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila, solução; (C): 25 fmol/μL padrão de tempo de retenção (iRT) 0,1% de ácido fórmico em água.
2. Ressuspenda as amostras em solução de 20 μL (C) antes da injeção de LC-MS.
   NOTA: Duas amostras biológicas foram analisadas e cada uma foi injetada cinco vezes para as execuções DDA e DIA, resultando em cinco réplicas técnicas por método por amostra.
3. Realize a separação de peptídeos usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com a fase móvel A consistindo de solução (A) e a fase móvel B consistindo de solução (B).
4. Carregar 1 μL de amostras numa coluna analítica de vinte e cinco C18 (150 μm × 250 mm, partículas de 1,9 μm, tamanho de poro de 120 Å) e manter a 40 °C durante todo o ensaio.
5. Realize a separação LC a uma taxa de fluxo de 600 nL/min usando o seguinte perfil de gradiente: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; seguido por alta lavagem orgânica e reequilíbrio.
   NOTA: O LC foi acoplado diretamente a um timsTOF MS por meio de uma fonte de íons.
6. Para análise de DDA, use o método de aplicação padrão DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime em timsTOF MS.
   1. Resumidamente, opere o espectrômetro de massa no modo PASEF com exclusão dinâmica habilitada. Defina cada ciclo para consistir em 10 varreduras PASEF MS/MS em um ciclo de trabalho de 1,1 s.
   2. Defina a faixa de massa para m/z 100-1700 e a faixa de mobilidade iônica de 0,60 a 1,60 V·s/cm², usando um tempo de rampa de 100,0 ms. Aumente a energia de colisão de 20,0 para 59,0 eV em função da mobilidade iônica.
7. Fracionamento da fase gasosa de mobilidade iônica (IM-GPF)
   1. Segmente a faixa de mobilidade iônica de 0,6-1,6 V·s/^cm2 em três janelas sobrepostas: 0,6-1,0, 0,9-1,3 e 1,2-1,6 V·s/^cm2.
   2. Para fazer isso, altere os valores de início e término de mobilidade no toque de configuração TIMS do timsControl ou do editor timsControl para os valores de janela correspondentes.
   3. Adquira dados para cada janela. Para todas as janelas de aquisição de mobilidade iônica, use um tempo constante de acumulação e rampa de 100 ms.
   4. Adquira dados no modo DDA-PASEF usando os mesmos parâmetros detalhados na etapa 4.6.
8. Para análise DIA, empregue uma largura de janela de isolamento de 25 m/z na faixa de massa de 400-1200 m/z. Empregue as mesmas configurações experimentais de mobilidade iônica (IMEX) usadas no método DDA.
   1. As configurações adicionais de DIA incluem uma rampa MS1 seguida por 16 rampas MS/MS por ciclo, produzindo um tempo de ciclo total de 1,8 s.
   2. Use o método proteômico padrão DIA-PASEF como modelo para o desenvolvimento do método DIA. Depois de criar o método DIA, carregue-o na guia de método do Hystar. Nenhuma ativação do modo DIA é necessária.
      NOTA: O método DIA será registrado automaticamente assim que for carregado com sucesso.

5. Processamento de dados

NOTA: Após a aquisição dos dados, a identificação do peptídeo deve ser realizada usando ferramentas de bioinformática, como PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant ou plataformas semelhantes. Este estudo utilizou o Peaks Online, capaz de trabalhar com dados brutos no formato .d.

1. Pesquisa de banco de dados
   1. Use um banco de dados de referência apropriado para pesquisas de peptídeos, como um banco de dados de peptídeos de sinalização de rato com curadoria, um proteoma de rato ou o proteoma humano, ou um banco de dados de peptídeos de sinalização com curadoria com base na fonte da amostra.
      NOTA: Esses bancos de dados podem ser obtidos de fontes confiáveis, como NCBI ou UniProt (https://www.uniprot.org/). Observe que apenas proteínas ou peptídeos no banco de dados serão identificados. Os dados de sinal de rato foram selecionados filtrando o proteoma de rato pela anotação "Peptídeo sinal" no UniProt. Nos termos Uniprot, filtrar por "peptídeo sinal" significa restringir o proteoma a proteínas envolvidas na secreção, localização da membrana ou tráfego compartimental. Este banco de dados personalizado contém 5630 proteínas. Limitar o tamanho do banco de dados de proteínas de 50.000 a 5.000 oferece várias vantagens. Primeiro, aumenta a confiança na identificação, reduzindo a probabilidade de correspondências aleatórias do espectro de peptídeos, aumentando assim a precisão das atribuições de peptídeos. Em segundo lugar, um banco de dados menor melhora a eficiência computacional, permitindo tempos de processamento mais rápidos e menor demanda por recursos computacionais. Terceiro, um banco de dados mais conciso pode levar a um melhor controle da taxa de descoberta falsa (FDR), resultando em identificações de proteínas mais confiáveis e estatisticamente robustas. No entanto, o banco de dados precisa ser relativamente grande para evitar inflação artificial de pontuações de confiança e estimativa imprecisa de FDR.
   2. Configure a pesquisa de banco de dados na GUI do programa com os seguintes parâmetros recomendados: Tolerância de erro de massa do precursor: 10-25 ppm; tolerância de erro de massa do fragmento: 0,01-0,05 Da; especificidade enzimática: nenhuma (digestão inespecífica); Faixa de comprimento do peptídeo: 4-45 aminoácidos.
   3. Defina o conjunto de PTMs a serem incluídos na pesquisa.
   4. Depois de concluir a pesquisa no banco de dados, exporte os arquivos pepxml e mzXML (ou MGF) correspondentes a cada janela de mobilidade iônica, incluindo a faixa de mobilidade completa padrão (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Construção da biblioteca Skyline
   1. Abra o Skyline e crie um novo documento, certifique-se de que a interface Proteomics esteja selecionada e use as configurações padrão , a menos que especificado de outra forma.
   2. Navegue até Arquivo > Importar > Pesquisa de peptídeos.
   3. No Assistente de Importação de Pesquisa de Peptídeos , selecione Compilar e adicione os arquivos pepxml relevantes (certifique-se de que os arquivos mzXML ou MGF correspondentes estejam no mesmo diretório).
   4. Defina os peptídeos padrão do iRT como Automático, escolha DIA como o fluxo de trabalho e clique em Avançar.
   5. Após a construção da biblioteca, escolha aproximadamente 10-15 peptídeos como padrões iRT para alinhamento entre as réplicas. Se solicitado a recalibrar o iRT, clique em OK para continuar.
   6. Na página Extrair cromatogramas , clique em Procurar para selecionar e importar todos os arquivos raw do DIA e clique em continuar.
   7. Na janela Configurações de transição , defina o intervalo de cargas precursoras para 1-5, o intervalo de cargas do produto para 1-3, os tipos de íons para ,p,y,b e defina a seleção de íons do produto Do íon 2 até o último íon. Outras configurações recomendadas: tolerância de correspondência de íons: 0,05 Da, Picos a serem escolhidos: 5.
   8. Na janela Configurações de peptídeos , defina as modificações que correspondam à configuração de pesquisa de picos descrita em 4.1.3.
   9. Na página Esquema de Isolamento , insira um nome para o isolamento e o esquema e selecione Janelas de Isolamento Pré-especificadas. Clique em importar e carregue um dos arquivos DIA para importar automaticamente a configuração da janela de isolamento do experimento.
   10. Defina as configurações de aquisição de varredura completa com os seguintes parâmetros. Método de aquisição: DIA; Analisador de massa do produto: Centróide; Esquema de isolamento: Use o definido acima; Precisão de massa: 10-20 ppm; Poder de resolução de mobilidade: 30-50; Ative Usar somente varreduras dentro de 5 minutos do RT previsto; Opcionalmente, modifique a filtragem MS1 se for necessário importar cromatogramas MS1. Selecione um analisador de massa e resolução apropriados para a extração ideal do cromatograma MS1.
   11. Importe FASTA e gere iscas. Defina o método de geração de isca: Sequência aleatória.
   12. Selecione a enzima: a digestão é inespecífica na análise de peptídeos endógenos. Edite a enzima selecionando adicionar no menu suspenso de enzimas. Defina o nome da enzima, Tipo para ambos, clive c-terminal para KR e cliva o N-terminal para KR, permita semi-clivagem e clique em OK. Defina as clivagens perdidas para 3.
   13. Importe o arquivo FASTA de destino e clique em Concluir. Confirme a página de proteínas associadas , se solicitado.
   14. Certifique-se de que a biblioteca espectral tenha sido criada com êxito e que os dados do DIA tenham sido importados. Inspecione manualmente a lista de peptídeos identificados e prossiga com a análise quantitativa e qualitativa a jusante.
3. Medições qualitativas e quantitativas
   NOTA: As análises qualitativas e quantitativas são feitas no Skyline. Para obter detalhes sobre a análise dos dados do DIA no Skyline, visite https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Se os dados DDA forem carregados, selecione Configurações > Configuração de transição no menu, escolha DDA em Método de aquisição; em Configurações > Configuração de peptídeos, escolha o nível MS 1 para quantificação.
   2. Se os dados DIA forem carregados, Configurações > Configuração de transição, escolha DIA em Método de aquisição; em Configurações > Configuração de peptídeos, escolha o nível MS 2 para quantificação.
   3. Em Exibir > Grade de Documentos, selecione Quantificação de Peptídeos e, em seguida, Exportar a planilha. Combine as planilhas dos resultados do DDA e dos resultados do DIA.
      NOTA: A planilha resume as áreas de pico para todos os peptídeos na biblioteca em todas as amostras. Neste experimento, as áreas de pico do peptídeo foram normalizadas para o peptídeo padrão de tempo de retenção GISNEGQNASIK, que faz parte da mistura de tempo de retenção de Pierce. A normalização foi realizada calculando-se a razão entre a área de pico de cada peptídeo e a do padrão.

Results

Um esquema experimental representativo é mostrado na Figura 1. A análise dos dados DDA-PASEF (Figura 2) adquiridos usando a faixa de mobilidade iônica padrão e o IM-GPF revelou uma cobertura peptídica substancialmente maior para a abordagem IM-GPF (Figura 2B). Notavelmente, a maioria dos peptídeos identificados usando o método DDA-PASEF padrão se sobrepôs aos encontrados no conjunto de dados IM-GPF. Para maximizar a cobertura de identificação de peptídeos, uma biblioteca espectral abrangente foi gerada integrando identificações de ambas as abordagens.

Uma análise adicional do banco de dados de conjuntos de dados replicados adquiridos via DDA- e DIA-PASEF (Figura 3), usando um banco de dados de peptídeos de sinalização de ratos com curadoria, revelou 217 proteínas comuns a ambos os métodos. Além disso, 115 proteínas foram identificadas exclusivamente por DIA-PASEF, enquanto 69 eram exclusivas para DDA-PASEF. Análises exploratórias utilizando bibliotecas espectrais derivadas de dados DDA e IM-GPF demonstraram que o DIA-PASEF permitiu a detecção confiável de neuropeptídeos como NPAFLFQPQRF (neuropeptídeo SF) e YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (derivado da proencefalina). Esses neuropeptídeos não foram detectados de forma confiável nos conjuntos de dados DDA-PASEF correspondentes devido à má atribuição de pico (Figura 3B, C).

De uma perspectiva quantitativa, o gráfico de dispersão na Figura 4A revela uma correlação positiva moderada entre a intensidade do precursor de DDA e a intensidade do íon do fragmento DIA, como esperado, uma vez que ambas as abordagens quantificam os mesmos peptídeos, mas capturam diferentes tipos de íons. Os gráficos de caixa para peptídeos selecionados mostrados na Figura 4B ilustram ainda mais a reprodutibilidade das medições quantitativas obtidas por ambas as abordagens. Os gráficos de caixa mostram as áreas de pico relativas para cada peptídeo medido por DIA e DDA, com barras de erro representando a variabilidade da medição entre as réplicas técnicas. Os peptídeos selecionados são derivados de pró-hormônios opióides, incluindo proencefalina (PENK) e prodinorfina (PDYN), ambos os quais desempenham papéis centrais na modulação da dor e analgesia.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho peptidômico para identificação e quantificação de peptídeos endógenos do tecido cerebral de ratos. O fluxo de trabalho inclui dissecção de tecidos, extração e purificação de peptídeos, aquisição de dados LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) usando fracionamento em fase gasosa (IM-GPF) e processamento de dados para gerar bibliotecas espectrais e realizar análises quantitativas. Partes da Figura foram criadas no BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Identificação de peptídeos e proteínas do banco de dados. (A) Gráfico de barras comparando o número total de precursores, correspondências de espectro de peptídeos (PSMs) e peptídeos exclusivos identificados em diferentes janelas de mobilidade iônica. (B) Gráfico de pizza ilustrando a proporção de peptídeos comumente identificados em todas as janelas de mobilidade e aqueles detectados exclusivamente em janelas individuais. (C, D) Mapas de calor que descrevem a distribuição de sinais de íons nas dimensões m/z e mobilidade iônica para toda a faixa de mobilidade (0,6-1,6 V·s/^cm2) (C) e a janela de mobilidade restrita (0,6-1,0 V·s/^cm2) (D). (E) Gráfico de virada mostrando o número de proteínas identificadas em conjuntos de dados adquiridos usando métodos DDA e DIA, destacando identificações de proteínas compartilhadas e exclusivas. (F) Mapa de calor representando peptídeos derivados do precursor de proencefalina identificado em réplicas adquiridas por DIA (painel superior) e réplicas adquiridas por DDA (painel inferior). A leu-encefalina não foi detectada em duas das quatro réplicas de DDA, indicando potenciais valores ausentes na aquisição baseada em DDA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise comparativa e exploratória de dados DDA-PASEF e DIA-PASEF usando bibliotecas espectrais. (A) Alinhamento do tempo de retenção do neuropeptídeo SF nas réplicas DIA e DDA-PASEF. (B) EIC de íons de fragmentos PENK (212-229) de conjuntos de dados DIA (superior) e DDA (inferior). (C) Cromatogramas de íons de fragmentos de neuropeptídeo SF de réplicas DIA demonstrando alta coeluição e qualidade espectral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de medições quantitativas entre DIA-PASEF (nível MS2) e DDA-PASEF (nível MS1). (A) Este gráfico de dispersão compara as intensidades de sinal peptídico obtidas usando os modos DIA e DDA. Especificamente, o eixo x representa a área de pico do precursor transformada em log₁₀ do DDA, enquanto o eixo y mostra a área do pico do fragmento transformado em log₁₀ do DIA para cada peptídeo. (B) Os gráficos de caixa representam as áreas de pico relativas de quatro peptídeos representativos, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 e PDYN 235-248. As barras de erro representam a variabilidade entre replicações técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Em peptidomas, particularmente ao analisar peptídeos endógenos, preservar o perfil de peptídeos nativos é essencial para a integridade dos dados e interpretação biológica. A perfusão salina fria não apenas remove o sangue, mas também resfria o cérebro, o que reduz significativamente a degradação proteolítica post-mortem que ocorre rapidamente devido à atividade das proteases endógenas. Ao diminuir a temperatura do cérebro, a atividade enzimática é retardada e as proteases circulantes são liberadas da vasculatura, ao mesmo tempo em que reduzem as alterações metabólicas post-mortem^25,26. A perfusão com solução salina gelada também elimina o sangue da vasculatura do cérebro. Esta etapa é especialmente importante, pois o sangue contém proteínas de alta abundância (como albumina e globulinas) e proteases circulantes que podem interferir na detecção de neuropeptídeos. A degradação post-mortem de proteínas sanguíneas abundantes pode aumentar a complexidade dos extratos de neuropeptídeos e mascarar sinais de baixa abundância, comprometendo a identificação e a quantificação 25,26,27. O congelamento imediato do tecido cerebral, seja em gelo seco ou por meio de congelamento instantâneo em isopentano resfriado, interrompe os processos enzimáticos quase instantaneamente. Essa preservação é especialmente importante para detectar neuropeptídeos maduros de baixa abundância e comprimento total e garantir uma quantificação confiável. Sem essas etapas, a degradação do peptídeo pode levar ao aumento da variabilidade e artefatos que comprometem a identificação e a quantificação. Assim, a remoção de sangue, a perfusão fria e o resfriamento rápido do cérebro são técnicas fundamentais que afetam diretamente a qualidade, a sensibilidade e a reprodutibilidade dos dados peptidômicos antes das medições.

A análise de peptídeos extraídos do cérebro de ratos revelou a presença de duas plumas distintas de mobilidade iônica (Figura 2C, D). Este fenômeno pode ser atribuído a diferentes classes moleculares ou a estados de carga variáveis dos peptídeos. Se as plumas corresponderem a classes moleculares distintas, as espécies não peptídicas coeluidoras podem competir com os peptídeos por seleção e fragmentação. Além disso, se a separação surgir de diferenças nos estados de carga, espera-se que a pluma contendo peptídeos altamente carregados produza espectros MS / MS de maior qualidade, facilitando uma identificação mais confiável do peptídeo.

Para investigar isso, implementamos uma estratégia de fracionamento de mobilidade iônica, adquirindo dados em três janelas de mobilidade discretas: 0,6-1,0, 0,9-1,3 e 1,2-1,6 V · s / cm². Essas janelas abrangem coletivamente toda a faixa de mobilidade iônica normalmente analisada em experimentos DDA-PASEF padrão para peptídeos. Conforme ilustrado na Figura 2, embora o número total de precursores detectados tenha sido maior na faixa de varredura completa (0,6-1,6 V · s / cm²), um número significativamente maior de correspondências de espectro de peptídeos (PSMs) foi observado dentro da janela de 0,6-1,0 V · s / cm² . Essa descoberta sugere que a presença de duas plumas pode de fato ser devido à interferência de outras moléculas.

O fracionamento de precursores baseado em mobilidade iônica resultou em um aumento de 30% na cobertura de peptídeos em comparação com o método convencional de varredura completa. Aproximadamente 82% dos peptídeos identificados no conjunto de dados de varredura completa se sobrepuseram aos peptídeos identificados usando fracionamento (Figura 2B), destacando a consistência e robustez da estratégia de fracionamento. Com base nessas observações, empregamos o fracionamento da mobilidade iônica e os dados de varredura completa para construir bibliotecas espectrais para a análise quantitativa de peptídeos neuroendócrinos usando DIA-PASEF.

A análise do banco de dados de conjuntos de dados replicados adquiridos via DDA e DIA revelou um número maior de identificações de peptídeos e proteínas nos dados do DIA, incluindo 115 proteínas identificadas exclusivamente pelo DIA (Figura 2E). Estes incluíram neuropeptídeos, como os peptídeos relacionados à pró-FMRFamida FF e VF. Em contraste, 69 proteínas foram identificadas exclusivamente por DDA, muitas das quais estão associadas à adesão celular e ao desenvolvimento neuronal. Esses achados sugerem que as metodologias DDA e DIA podem ser aplicadas de maneira complementar para obter uma cobertura peptídica mais ampla.

Uma análise mais aprofundada demonstrou que a aquisição de DIA aborda efetivamente alguns dos problemas de valor ausente frequentemente encontrados na análise de peptídeos endógenos usando DDA. Por exemplo, a leu-encefalina foi detectada em apenas duas das quatro réplicas de DDA (Figura 2F, painel inferior), enquanto foi consistentemente identificada em todas as quatro réplicas de DIA (Figura 3F, painel superior).

Skyline, uma plataforma amplamente utilizada para proteômica quantitativa, foi utilizada para analisar conjuntos de dados DDA e DIA-PASEF²⁸. O software facilita a identificação de peptídeos por meio da correspondência de bibliotecas espectrais, coeluição de íons de fragmentos e alinhamento do tempo de retenção. Para avaliar a capacidade do DIA-PASEF de reduzir a identificação ausente, realizamos uma avaliação qualitativa de peptídeos detectados exclusivamente no conjunto de dados do DIA.

Conforme mostrado na Figura 3D, o neuropeptídeo SF foi consistentemente detectado em todas as réplicas de DIA dentro da mesma janela de tempo de retenção. A detecção nas réplicas DDA exibiu variabilidade considerável, com tempos de retenção variando de 25 min a 45 min (Figura 3A). As inconsistências observadas, incluindo erros de atribuição de pico com baixos escores de confiança, provavelmente foram devidas à cobertura limitada ou de baixa qualidade do íon fragmento, conforme mostrado na Figura 3B. Em contraste, a Figura 3C mostra que os íons fragmentos correspondentes ao neuropeptídeo SF estavam bem alinhados em todas as réplicas de DIA, apoiando a identificação automatizada confiável.

Uma comparação da qualidade espectral MS/MS para o peptídeo PENK (212-229), derivado da proencefalina, demonstrou ainda mais as vantagens do DIA-PASEF. Os espectros obtidos do DIA exibiram maior intensidade e melhor qualidade do íon fragmento em relação ao DDA (Figura 3), o que é particularmente benéfico para detectar peptídeos endógenos de baixa abundância.

A análise quantitativa confirmou que o DIA-PASEF produziu medições consistentes e reprodutíveis em todas as réplicas biológicas, com desempenho comparável ao DDA (Figura 4). Além disso, o DIA permitiu a quantificação no nível MS2, oferecendo especificidade no nível do íon do fragmento e maior confiança na identificação de peptídeos em relação ao DDA baseado em MS1. Esses achados apóiam o uso do DIA-PASEF como uma abordagem confiável e eficiente para a quantificação de neuropeptídeos direcionados em matrizes biológicas complexas, particularmente quando a integridade e a reprodutibilidade dos dados são críticas.

Este protocolo descreve uma estratégia abrangente para análise e quantificação de neuropeptídeos. A abordagem IM-GPF facilita a construção de bibliotecas espectrais de alta qualidade. Embora o DIA-PASEF ofereça melhor reprodutibilidade e maior cobertura peptídica em comparação com o DDA-PASEF, ele também melhora a quantificação baseada em MS2. A combinação de ambas as estratégias de aquisição aumenta a cobertura geral de peptídeos, pois cada método contribui exclusivamente para a identificação de peptídeos distintos (Figura 2E). A limitação deste protocolo é a necessidade de amplo material de amostra para suportar a geração de bibliotecas espectrais e a aquisição de dados por meio dos métodos DDA e DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1% de Ácido Fórmico Água	Fisher Scientific	de grau LC/MS	LS118-500
	Fisher Scientific	A11350	Acetonitrila de grau LC/MS
	Fisher Scientific	AA47138K7	Ácido Fórmico de grau LC/MS
	Fisher Scientific	PI28905	Metanol de grau LC/MS
	Fisher Scientific	AA47192K7
		da Fisher	nanoELute2
	Fisher Scientific
Mistura de calibração de tempo de retenção de peptídeos	Pierce Thermo Fisher	A11351	LC / MS grau
SpeedVac concentrador de vácuo	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	O modelo específico usado neste estudo não está mais disponível no fabricante. Um link para o modelo equivalente atual é fornecido para
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water Fisher	Scientific	AA47146M6	Grau LC/MS