SCAnED - Uma macro de segmentação de pele de código aberto para detecção semiautomatizada de células e núcleos em compartimentos epidérmicos e dérmicos da pele

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo semiautomatizado para identificar e quantificar células imunes e não imunes em seções de pele usando SCAnED, uma macro gratuita baseada em ImageJ para segmentação de pele.

Resumo

A distribuição espacial de células imunes e não imunes dentro dos tecidos e a expressão de marcadores específicos da célula fornecem informações essenciais sobre a função celular in situ. A pele humana é um órgão altamente complexo com compartimentos definidos que compreendem diferentes células com fenótipos diversos. Usando a marcação de multifluorescência, populações distintas de células da pele podem ser determinadas e caracterizadas posteriormente. No entanto, atualmente, a disponibilidade de ferramentas não comerciais para análise de imagens de amostras de pele que permitem a segmentação in silico de células especificamente dentro da epiderme ou da derme em uma resolução de célula única é limitada. Fornecemos aqui um protocolo passo a passo para coloração por imunofluorescência de seções de pele, microscopia confocal e análise de imagem usando nossa ferramenta disponível gratuitamente SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis). A macro SCAnED permite a identificação e classificação precisas de células e núcleos nos compartimentos epidérmico e dérmico da pele humana. Fornecemos diretrizes sobre como determinar os níveis médios de intensidade da expressão do criador em diferentes células e compartimentos celulares, como o citoplasma e o núcleo, e como quantificar as células que expressam quantidades variadas desses marcadores com um pipeline Python fornecido como um notebook Jupyter pronto para uso executado no Google Colab. Este protocolo permitirá que usuários inexperientes determinem perfis de expressão específicos de células no tecido da pele e forneçam informações sobre a distribuição espacial das células nos compartimentos epidérmico e dérmico, permitindo uma compreensão mais profunda da intrincada estrutura do tecido e da composição celular da pele humana.

Introdução

Compreender os tecidos da pele em nível celular e discernir os fenótipos celulares, a morfologia e sua localização nos compartimentos epidérmico e dérmico são fundamentais na pesquisa dermatológica e na histopatologia ^1,2. A composição celular dentro da epiderme, abrangendo queratinócitos, melanócitos e células de Langerhans em condições saudáveis, torna-se muito desequilibrada em doenças inflamatórias da pele e câncer. Além disso, o fenótipo e a localização das células dentro da derme, situadas abaixo da epiderme e abrigando fibroblastos e a maioria das células imunológicas, podem mudar significativamente na doença. Assim, a segmentação de células e núcleos é imperativa para avaliar atributos celulares, como número de células, expressão de proteínas, morfologia e organização espacial, e características do núcleo, como tamanho, forma e expressão do fator de transcrição, auxiliando na compreensão da homeostase e doenças da pele ^3,4,5.

Apesar da disponibilidade de plataformas de análise de imagem de uso geral, como QuPath⁶, CellProfiler⁷ e ilastik⁸, essas ferramentas geralmente exigem ampla personalização e scripts para se adaptar à complexidade estrutural e à morfologia celular heterogênea do tecido da pele. Poucas ferramentas foram especificamente adaptadas para segmentação automatizada de compartimentos epidérmicos e dérmicos, e muitas soluções disponíveis são comerciais e não são de livre acesso. Essas limitações tornam difícil para os não especialistas implementar pipelines eficientes para análises específicas da pele.

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a análise de células e núcleos dentro do tecido da pele e seus compartimentos, cobrindo todas as etapas vitais, desde a coloração do tecido até a análise de imagem usando nosso pipeline de análise de imagem semiautomatizado. Começamos com informações detalhadas sobre a coloração por imunofluorescência do tecido da pele, incluindo coloração com E-caderina para segmentação de epiderme/derme e 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para detecção de células/núcleos. Dois marcadores de interesse, Vimentina (VIM) e CD90, foram incluídos para fins de validação. Recomendamos o uso de anticorpos em concentrações otimizadas (consulte a Tabela 1) e a captura de imagens usando microscopia confocal com configurações consistentes de intensidade do laser, tempo de exposição e resolução para garantir a reprodutibilidade.

Além disso, apresentamos nossa macro ImageJ⁹ SCAnED personalizada, que significa Skin Compartment Analysis of Epidermis e Dermis, e fornecemos todas as etapas necessárias para a segmentação in silico e detecção de núcleos e células dentro da epiderme e derme. Os usuários podem escolher entre dois métodos diferentes de detecção de núcleos, usando limites simples e rápidos ou a ferramenta de aprendizado profundo StarDist¹⁰ e nosso modelo de pele treinada, antes de prosseguir com o protocolo SCAnED. Ao contrário das ferramentas gerais, o SCAnED foi desenvolvido especificamente para histologia da pele e as supera ao permitir a compartimentalização automática das regiões epidérmicas e dérmicas e a quantificação integrada de vários marcadores em ambas as regiões. Isso é particularmente útil para pesquisadores que não têm experiência em programação ou aprendizado profundo, oferecendo uma ferramenta pronta para uso adaptada para análise de imagens da pele.

Mostramos ainda como os níveis médios de intensidade são extraídos por célula a partir de imagens de imunofluorescência de até cinco marcadores distintos de interesse. Por fim, fornecemos um código Python para a análise estatística dos dados unicelulares obtidos gravados e executados no Google Colab¹¹ e compartilhados como um notebook Jupyter. Nosso protocolo e a macro SCAnED visam fornecer aos pesquisadores de pele sem imunofluorescência avançada e experiência em computação uma ferramenta prática para rotular e quantificar semiautomaticamente as células e a expressão de marcadores na pele humana, com foco nos compartimentos epidérmico e dérmico.

Protocolo

1. Marcação de imunofluorescência de E-caderina, VIM e CD90 e coloração nuclear com DAPI em cortes de pele embebidos em parafina

NOTA: O protocolo mostra etapas para seções incorporadas em parafina. Para amostras de tecido fresco e congelado, fixe as seções de tecido e continue com a etapa 1.3 do protocolo.

1. Derreta a parafina usando um ventilador ou forno.
2. Reidrate as seções passando por álcoois graduados com teor crescente de água (por exemplo, xileno → 100% de etanol → 85% de etanol → 70% de etanol → água).
3. Execute as etapas de recuperação de antígenos conforme apropriado para os antígenos.
4. Permeabilize seções de tecido com 0,3% de Triton X em PBS (3 x 20 min) (ver Tabela 2).
5. Lave as lâminas com PBS (1 x 5 min).
6. Circunde cada amostra com uma caneta marcadora hidrofóbica para evitar derramamento de líquido e minimizar o volume de reagentes e deixe secar.
7. Aplique anticorpos primários (tampão para Abs: PBS + 2% BSA) (ver Tabela 1 e Tabela 2). Coloque as lâminas em uma caixa de câmara umidificada (caixa úmida) e incube durante a noite.
8. Lave as lâminas com 0,3% de Triton X em PBS (3 x 5 min).
9. Remova o excesso de detergente lavando as lâminas com PBS (1 x 5 min).
10. Aplique anticorpos secundários e soro de cabra (ver Tabela 1). Incube as lâminas em local escuro por 1 h.
11. Lave as lâminas com 0,3% de Triton X em PBS (3 x 5 min).
12. Remova o excesso de detergente lavando as lâminas com PBS (1 x 5 min).
13. Adicione DAPI para coloração de núcleos (consulte a Tabela 1). Incube as lâminas em local escuro por 30 min.
14. Lave as lâminas com 0,3% de Triton X em PBS (3 x 5 min).
15. Lave as lâminas com PBS (1 x 5 min).
16. Aplique 1 gota (~5-15 μL) de meio de montagem de fluorescência em cada amostra e coloque cuidadosamente as lamínulas (remova as bolhas, se necessário). Deixe as lâminas secarem no escuro.

Anticorpos e corantes	Concentração de trabalho	Diluição
anticorpo anti-Vimentina	0,8 μg/mL	1:50
anticorpo anti-E-caderina	1 μg/ml	1:333
anticorpo anti-CD90		1:1000
AF488 anti-mouse		1:500
AF568 anti-coelho		1:500
AF647 anti-mouse		1:500
DAPI	1 μg/ml

Tabela 1: Anticorpos e corante.

1. Tampão de coloração
Reagente	Concentração final	Quantidade
BSA	2%	1 g
PBS	1x	50 mL
Total	n/a	50 mL
2. Tampão de permeabilização
Reagente	Concentração final	Quantidade
Tritão X	0.30%	300 μL
PBS	1x	100 mL
Total	n/a	100 mL

Tabela 2: Receitas para soluções.

2. Imagem confocal

NOTA: Para este protocolo, foi utilizado um microscópio confocal de varredura a laser, equipado com objetiva de 10x (NA 0,4) e 4 linhas de laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

1. Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência (veja a imagem de exemplo na Figura 1).
2. Use o seguinte parâmetro de tamanho de varredura para criar a macro, treinar o modelo StarDist e, idealmente, para aquisição de imagem: Tamanho da imagem = 4.096 x 4.096 pixels (ou 1.273 x 1.273 mícrons), profundidade de bits = 16 bits, tamanho mínimo de pixel = 0,3 mícrons, relação sinal-ruído (SNR) = mínimo de 3.

Figura 1: Coloração por imunofluorescência do corte cutâneo. DAPI: rólebros de núcleos, CD90: marcador de fibroblastos, E-caderina: usado para marcar epiderme, VIM: células que expressam VIM, Mesclar: Fusão de coloração DAPI (magenta), CD90 (azul), E-caderina (amarelo) e VIM (verde). Barras de escala = 100μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Análise de imagem usando a macro SCAnED (Arquivo Suplementar 1, Vídeo Suplementar S1 e Vídeo Suplementar S2)

1. Inicie a macro (SCAnED.mp4 filme).
   1. Abra imagens de imunofluorescência em Fiji/ImageJ usando Bio-Formatos com configurações padrão.
      NOTA: Não divida os canais nesta etapa.
   2. Baixe e execute a macro SCAnED navegando até Plugins | Macros | Execute e selecione o script de macro SCAnED (Arquivo Suplementar 1).
   3. Siga as instruções passo a passo na tela fornecidas pela macro.
2. Segmentação in silico da epiderme e derme usando a macro SCAnED.
   1. Selecione o canal E-caderina quando solicitado.
   2. Ajuste o limite manualmente navegando até Imagem | Ajustar | Limiar e clicando em OK para que o canal de E-caderina capture totalmente a região epidérmica.
   3. Se necessário, confirme a etapa Flood Fill para fechar as lacunas na máscara de E-caderina selecionando o ícone Flood Fill Tool no ImageJ, clicando na parte superior da epiderme e clicando em OK (Figura Suplementar S1A-E e dicas de solução de problemas na seção de discussão).
   4. Se a máscara estiver invertida, selecione Sim e OK quando solicitado a inverter a seleção; caso contrário, selecione Não e OK (consulte a Figura Suplementar S1F,G e dicas de solução de problemas na seção de discussão).
   5. Selecione o canal DAPI quando solicitado. As imagens dos núcleos antes e após a segmentação epidérmico-dérmica são mostradas na Figura 2.
3. Segmentação de núcleos usando a função de limiar
   1. Defina automaticamente os níveis de intensidade.
4. Segmentação de núcleos usando StarDist
   1. Abra StarDist em ImageJ (Figura 3).
   2. Carregue o modelo de detecção de núcleos (Supplemental File 2) na GUI do StarDist (Figura 4). O par de treinamento correspondente para criar o modelo StarDist é mostrado na Figura Suplementar S2.
      NOTA: O Tensor Flow versão 1.15 deve ser usado para este modelo se ocorrer um erro StarDist (consulte a Figura Suplementar S3).
   3. Clique primeiro no canal de núcleos.
   4. Ajuste as configurações de bloco de acordo (certifique-se de que o número de blocos corresponda ao tamanho de patch esperado (256 x 256 px) (consulte a Figura 3 e a Figura 4).
      NOTA: A segmentação StarDist pode levar algum tempo, dependendo do número de núcleos.
5. Medição de intensidade e quantificação de proteínas nucleares
   NOTA: Antes de executar o SCAnED, vá para Analisar | Defina as medições e configure os parâmetros para garantir uma saída de dados precisa e relevante (Figura 5).
   1. Quando solicitado, selecione Sim para medir a intensidade do marcador nos núcleos.
   2. Escolha o canal de marcador apropriado (até cinco possíveis).
   3. Salve os resultados como arquivos CSV, conforme instruído pela macro.
   4. Repita para cada canal.
   5. Depois que todos os canais forem processados, salve os resultados como arquivos CSV, conforme instruído pela macro.
      NOTA: Para melhor visualização, incluímos uma visão ampliada de uma região específica da pele para o restante da análise (Figura 6).
6. Segmentação celular (região citoplasmática)
   NOTA: A segmentação celular é baseada na expansão da ROI nuclear e, portanto, deve ser iniciada após a segmentação dos núcleos.
   1. Quando a função de limiar tiver sido usada para segmentação de núcleos, aplique dilatação binária.
   2. Quando StarDist tiver sido usado para segmentação de núcleos, use a expansão de ampliação, que tem um tempo de processamento mais longo (consulte a Figura S4 suplementar).
7. Medição de intensidade e quantificação de proteínas citoplasmáticas
   1. Selecione Sim para medir a intensidade do marcador em células inteiras.
   2. Salve os arquivos CSV de resultado conforme as instruções da macro.
   3. Repita para cada canal marcador em ordem.
   4. Mantenha a mesma ordem de canais para medições de núcleo e célula para manter a consistência nos dados de saída.
   5. Escolha Descartar sempre que a macro solicitar, para evitar a mistura de dados de núcleos entre epiderme e derme. A Figura 7 ilustra todas as etapas da segmentação baseada em limite.

Figura 2: Análise e separação de núcleos específicos do canal em núcleos epidérmicos e dérmicos. A coloração por imunofluorescência do DAPI demonstra a morfologia e a distribuição espacial dos núcleos em toda a pele (imagem à esquerda). Representação do canal de núcleos de núcleos epidérmicos corados com DAPI, fornecendo informações sobre a distribuição dos núcleos dentro do compartimento epidérmico (imagem do meio). Representação do canal de núcleos dos núcleos dérmicos corados com DAPI, oferecendo visualização da distribuição dos núcleos dentro do compartimento dérmico (imagem à direita). Barras de escala = 100μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Utilizando a opção "StarDist". Captura de tela destacando a localização da opção "StarDist 2D" no menu/Plugins/StarDist/StarDist 2D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Instruções para usar o modelo de detecção de núcleos. Baixe o arquivo "nuclei_detection_model.zip" e forneça seu caminho de arquivo na seção Procurar . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Configurando as configurações de medição. (A) Captura de tela destacando a localização da opção Definir medidas no menu, permitindo a personalização dos parâmetros de medição para análise subsequente. (B) Definir caixa de medições exibindo a interface para ajustar as configurações de medição, permitindo que os usuários especifiquem parâmetros para coleta e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Visão ampliada de uma região específica. (A) Fusão da coloração DAPI (magenta) e VIM (verde). (B) Visão ampliada de uma região específica de A, fornecendo visualização detalhada da expressão de VIM no tecido da pele. Observe a morfologia diferente dos núcleos dentro da epiderme e da derme. Barras de escala = 100 μm (A), 20 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Segmentação SCAnED na epiderme e derme para núcleos e células usando o limiar. (A) Imagem inteira: Fusão da coloração DAPI (magenta) e VIM (verde). Parte superior: (B) Fusão de núcleos epidérmicos corados com DAPI e VIM após separação. (C) Máscara de núcleos epidérmicos usando limiar. (D) Segmentação de núcleos epidérmicos sobrepostos à fusão de DAPI e VIM, auxiliando na visualização da distribuição dos núcleos dentro do compartimento epidérmico. (E) Segmentação celular de núcleos epidérmicos sobrepostos à fusão de DAPI e VIM, auxiliando na visualização da distribuição dos núcleos dentro do compartimento epidérmico usando limiar e dilatação, pois mostra que a região de seleção é maior que os núcleos. Parte inferior: (F) Fusão de núcleos dérmicos corados com DAPI e VIM após separação. (G) Máscara de núcleos dérmicos usando limiar. (H) Segmentação de núcleos dérmicos sobrepostos à fusão de DAPI e VIM, auxiliando na visualização da distribuição dos núcleos dentro do compartimento dérmico. (I) Segmentação celular de núcleos dérmicos sobrepostos à fusão de DAPI e VIM, auxiliando na visualização da distribuição dos núcleos dentro do compartimento dérmico. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Classificação e visualização de dados unicelulares extraídos (Vídeo Suplementar S3)

NOTA: Cada marcador de imunofluorescência gera dois arquivos CSV: um para o compartimento epidérmico e outro para o compartimento dérmico.

1. Estabelecer limiares de intensidade específicos dos marcadores utilizando amostras de controlo de isotipos.
   1. Importe os arquivos de saída CSV gerados pela macro SCAnED para o Google Colab usando o Jupyter Notebook fornecido. Primeiro, baixe o Jupyter Notebook apropriado (por exemplo, Supplemental File 3 ou Supplemental File 4), acesse o Google Colab (https://colab.research.google.com/), clique em File, abra o notebook, selecione o arquivo, execute as células de código uma a uma. Quando solicitado com Escolher arquivos, clique no botão e carregue o arquivo .csv.
   2. Para cada anticorpo, calcule a intensidade média de fluorescência dos controles de isotipo. Para determinar o corte para cada anticorpo, abra o notebook DotPlot (Arquivo Suplementar 4), carregue o arquivo de controle de isotipo correspondente e execute o código.
   3. Com base na distribuição de pontos no controle de isotipo e gráficos de anticorpos específicos, escolha um limite de intensidade apropriado para separar o fundo (controle de isotipo) do sinal (coloração específica). Use esses valores como pontos de corte para classificar células individuais como positivas ou negativas para a expressão do marcador.
2. Compare as intensidades dos marcadores em amostras experimentais com os limites calculados.
   1. Classifique as células com intensidade ≥ limiar como positivo.
   2. Classifique as células com intensidade < limiar como negativo.
   3. Classifique subpopulações com base em combinações de expressão de marcadores, por exemplo, identifique populações de células single-positive, double-positive ou triplo-positivas.
3. Visualize a distribuição e as relações da expressão do marcador usando dois tipos de gráficos:
   1. Crie histogramas e histogramas de sobreposição para comparar a distribuição de intensidade entre as condições (por exemplo, controle versus pele doente) executando o código do histograma (baixe o Supplemental File 3, vá para o Google Colab (https://colab.research.google.com/), clique em File, abra o notebook, selecione o arquivo, execute o código) (Figura 8).
   2. Crie gráficos de pontos para simular gráficos de dispersão no estilo de citometria de fluxo para avaliar padrões de coexpressão executando o código DotPlot (baixe o Arquivo Suplementar 4, vá para o Google Colab (https://colab.research.google.com/), clique em Arquivo, abra o notebook, selecione o arquivo, execute o código) (Figura 9).
   3. Exporte dados processados para análises adicionais e avaliação de diferenças significativas usando testes estatísticos.

Figura 8: Histograma de sobreposição comparando a intensidade média de células VIM-positivas. Sobreposição de histograma comparando a intensidade média de células VIM em amostras saudáveis (H) em azul e amostras de psoríase (P) em laranja dentro da derme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Sinais positivos duplos em um gráfico de pontos. Uma demonstração do gráfico de pontos de coloração dupla que pode ajudar na melhor visualização de populações de um único positivo, duplo positivo e duplo negativo. Este exemplo mostra a dupla coloração de CD90 e VIM na derme de (A) pele saudável e (B) psoríase, e na epiderme de amostras de pele (C) saudável e (D) psoríase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Em um estudo anterior, usamos com sucesso o SCAnED para detectar e quantificar células e níveis de expressão de lisil oxidase (LOX), uma proteína citoplasmática, e o fator de transcrição hipóxia-induzível 1 (HIF-1) em células dentro da derme da pele humana¹² , destacando a aplicabilidade dessa ferramenta para pesquisa da pele.

Para avaliar ainda mais a precisão de nossa macro de segmentação da pele na identificação de células e núcleos nos compartimentos epidérmico e dé...

Discussão

O protocolo SCAnED é um método semiautomatizado para análise específica de compartimento de células imunes e não imunes no tecido da pele humana. O fluxo de trabalho integra um protocolo de coloração baseado em E-caderina para permitir a segmentação da epiderme e da derme, detecção de núcleos e células baseada em DAPI, seguida pela quantificação da expressão do marcador em núcleos e células usando nossa macro baseada em ImageJ. Além disso, orientamos os usuários na análise de nosso fluxo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,3% Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
BSA (albumina sérica bovina)	Sigma Aldrich
CD90	Sinalização celular	D3V8A
DAPI	Roche	10236276001
Água desionizada
E-cadherina	Abcam	ab1416
Meio de montagem por fluorescência	Dako	S3023
Anticorpo secundário Cross-Adsorbed IgG1 anti-camundongo, Alexa Fluor 488  (AF 488 anti-rato)	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Anticorpo secundário anti-camundongo IgG2a adsorvido cruzadamente, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-rato)	Thermo Fisher Scientific	A-21241
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) adsorbido cruzadamente para cabras, Alexa Fluor 568 (AF 568 anti-coelho)	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Soro de cabra	Agilent Technologies & Ouml; sterreich GmbH, Dako	X0907
PBS	Gibco	14190-094
Vimentin	Dako	M7020
Materiais
Caixa de câmara (caixa úmida)
Coversslip	Thermo Fisher
Caneta marcadora deslizante repelente de líquidos para coloração (hidrofóbica) & nbsp;	Daido Sangyo	Z377821	24x50mm
Soluções
Buffer de permeabilização (0,3% Triton X em PBS) & nbsp;			Consulte a Tabela 2
Buffer de coloração (2% BSA em PBS) & nbsp;			Consulte a Tabela 2
Software e Conjuntos de Dados
Microscópio de varredura a laser confocal	Olimpo	FV3000 baseado no IX83 invertido	equipado com um objetivo 10x (NA 0,4), 4 linhas laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, coerente)
Fiji (ImageJ)		V1.54h
Google Colab	Google
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Prisma 10	para análise estatística adicional
HALO	Indica Labs
Programa em Python		Python 3.11.12
QuPath	software aberto (Bankhead, P. et al, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)	v0.5.1
StarDist			Instalar a versão da CPU TF1.15.0