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Artigo de método

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

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DOI:

10.3791/68749

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18 de julho de 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

Neste artigo

Resumo

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Resumo

Três processos críticos e interdependentes definem a prófase meiótica I: cromossomos homólogos devem se emparelhar, uma estrutura proteica chamada complexo sinaptonêmico se forma para amarrar homólogos (sinapse) e homólogos sofrem recombinação, trocando reciprocamente material genético para formar cruzamentos (COs). Erros nesses processos podem resultar em insuficiência ovariana prematura, aneuploidia e, finalmente, perda de gravidez e infertilidade. A recombinação meiótica é particularmente propensa a erros em oócitos, com mais de 7% dos oócitos humanos contendo pelo menos um par de cromossomos sem cruzamento, e entre 20% -80% dos óvulos versus 2,5% a 7% dos espermatozoides são aneuploides. No entanto, ainda não está claro por que os erros cromossômicos mostram disparidades sexuais tão marcantes. O presente protocolo descreve métodos para a preparação e análise de disseminações cromossômicas da prófase I e metáfase I de oócitos de camundongos fetais e juvenis, respectivamente. Para rastrear a dinâmica cromossômica crítica ao longo da prófase meiótica I, este protocolo emprega coloração por imunofluorescência de marcadores comuns para recombinação meiótica (RAD51 para quebras de fita dupla, MSH4 para intermediários de CO e MLH1 / MLH3 para identificar a maioria dos COs) e sinapse (SYCP3 para eixos cromossômicos, SYCP1 para regiões sinapsadas e HORMAD1 para regiões sinapsadas). Além disso, este protocolo usa a maturação in vitro de oócitos coletados para avaliar o número de cromossomos pareados (bivalentes) e o número total de cruzamentos (quiasmas) na metáfase I. Juntas, essas técnicas fornecem uma estrutura abrangente e quantitativa para examinar os mecanismos que regulam a dinâmica cromossômica inicial na meiose feminina.

Introdução

A meiose é uma divisão celular especializada essencial para a produção de gametas haplóides. Durante a prófase I, os cromossomos homólogos (cada um consistindo de cromátides irmãs mantidas juntas por coesina) devem realizar três tarefas críticas: 1) reconhecer e emparelhar uns com os outros, 2) fechar-se formando o complexo sinaptonêmico (SC) entre seus eixos laterais e 3) trocar DNA por meio de recombinação homóloga, resultando em cruzamentos (COs) entre cromátides não irmãs 1,2. A conexão física resultante da formação do cruzamento, mantida pela coesina, garante a biorientação e segregação cromossômica adequadas durante a metáfase I 3,4,5.

A prófase meiótica I compreende cinco estágios, cada um definido pelo status da sinapse6. No leptonema (grego para fio fino), os cromossomos se condensam à medida que o elemento axial (marcado por SYCP3) se forma ao longo dos eixos cromossômicos. Durante o zigema (fios unidos), os homólogos começam a fazer sinapses à medida que o elemento transversal do SC (SYCP1) se forma entre os eixos7. No paquinema (fio grosso), os cromossomos são sinapsados ao longo de todo o seu comprimento. O SC então se desmonta durante o diplonema (dois fios), deixando os homólogos conectados apenas em locais de cruzamento (quiasmas). Os quiasmas são o produto da recombinação homóloga, um processo iniciado com a indução programada de quebras de fita dupla de DNA (DSBs). De centenas de DSBs, apenas ~ 10% se tornam COs. Em camundongos, a maioria (90% -95%) se forma através da via de CO de classe I facilitada por MutLγ (MLH1-MLH3), com os COs restantes produzidos por MUS81-EME1 através da via de CO de classe II 8,9,10,11.

Emparelhamento, sinapse e recombinação são processos altamente regulados e interdependentes. Os erros geralmente acionam mecanismos de checkpoint, levando à morte celular. Nas mulheres, a perda de células germinativas por erros precoces da prófase I pode causar insuficiência ovariana prematura12,13, enquanto erros tardios (por exemplo, homólogos que não formam COs, mau posicionamento de COs ou perda prematura de coesina) podem levar à segregação cromossômica incorreta e aneuploidia. Em humanos, os erros meióticos são uma das principais causas de perda de gravidez e infertilidade. A meiose feminina é particularmente propensa a erros. Cerca de 20% a 80% dos óvulos humanos (versus 2,5% a 7% dos espermatozoides) carregam números cromossômicos anormais, a maioria resultante de erros na primeira divisão meiótica 14,15,16,17. Embora a idade tenha sido identificada como a maior causa de aneuploidia materna, a razão pela qual os oócitos são tão suscetíveis a erros permanece obscura.

Apesar da importância de entender os fatores subjacentes às altas taxas de erro em oócitos, a maior parte do nosso conhecimento sobre a regulação dos eventos da prófase I vem de estudos da meiose masculina. Como um pequeno fragmento de material testicular adulto fornece material suficiente para avaliar todos os estágios das células germinativas meióticas e pós-meióticas, a meiose masculina há muito é mais acessível aos pesquisadores. Em contraste, a meiose feminina ocorre de maneira descontínua. Em camundongos, a prófase I progride de forma semi-síncrona no ovário fetal, começando cerca de 14 dias após o coito (dpc; Figura 1A), logo após a determinação do sexo gonadal 18,19,20. Na época do nascimento, os oócitos entram em parada de ditado até a ovulação meses (em camundongos) ou décadas (em humanos) depois 21,22,23. Consequentemente, estágios específicos da prófase I são acessíveis apenas durante janelas de desenvolvimento limitadas (Figura 1A), com eventos pós-prófase I ocorrendo em apenas alguns oócitos de cada vez no juvenil e adulto. Embora os avanços técnicos tenham melhorado os estudos de meiose de oócitos em mamíferos, esses métodos permanecem desafiadores e demorados em comparação com técnicas comparáveis usadas em estudos masculinos.

A análise meiótica feminina é ainda mais complicada pela limitação no subestadiamento de oócitos de paquiteno - crítico para estudar a designação e maturação cruzada. Estudos masculinos se beneficiam da dinâmica de emparelhamento cromossômico sexual bem caracterizada e da presença da variante histona, H1t, que servem como marcadores para paquinema precoce, médio e tardio 24,25,26. No entanto, nenhum método confiável foi formalizado para subestadiamento de oócitos de paquiteno.

Os protocolos apresentados aqui facilitam uma análise abrangente da sinapse e recombinação em oócitos de camundongos desde o início da prófase I até a metáfase I. Este trabalho baseia-se em técnicas clássicas de espalhamento cromossômico desenvolvidas por Peters et al.27 e Tarkowski28 e refinamentos anteriores desses métodos por Hunt29 e Sun e Cohen30. Este protocolo foi desenvolvido para enfatizar: 1) Enriquecimento e identificação de subestágios específicos da prófase I, 2) maximização do número de aplicações realizadas por par de ovários fetais e 3) métricas completas e acessíveis para avaliação de defeitos de sinapse e recombinação de focos para quiasmas.

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Protocolo

Todo o manejo e procedimentos dos animais foram realizados após a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Cornell (IACUC) sob o protocolo 2004-0063.

1. Preparação da lâmina de propagação do cromossomo prófase I do oócito

  1. No final da tarde, configure acasalamentos cronometrados de camundongos fêmeas C57BL / 6J (2 a 6 meses de idade) com machos (2 a 12 meses de idade). A partir do dia seguinte, verifique as fêmeas todas as manhãs (antes das 9h) para um tampão copulatório. O meio-dia do dia do plugue é definido como 0,5 dpc.
  2. Prepare o seguinte antes de sacrificar camundongos prenhes.
    1. Configure uma câmara umidificada com temperatura ambiente H2O.
    2. Prepare 10 mL de tampão de extração hipotônico (HEB; ver Tabela 1) consistindo de 30 mM de Tris-HCl, 50 mM de sacarose, 17 mM de citrato de sódio, 5 mM de EDTA, 2,5 mM de DTT e 0,5 mM de PMSF em água Milli-Q. Antes de adicionar DTT e PMSF, ajuste o pH para 8,2 - 8,4 usando ácido bórico 50 mM. Faça HEB fresco e use dentro de 2 horas após adicionar TDT.
    3. Prepare 100 mM de sacarose adicionando 342 mg de sacarose a 10 ml de H2O. Ultrapuro
    4. Pré-aqueça o H2O ultrapuro em um micro-ondas padrão por 1 min (até 90 - 95 ° C). Sob uma hotte, adicionar o H2O ultrapuro aquecido a 0,5 g de Paraformaldeído (PFA). Adicione duas gotas de NaOH 1 N, vórtice para misturar e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Ajustar o pH para 9,2-9,3 utilizando ácido bórico 50 mM e adicionar Triton X-100 a 0,15 % (v/v). Adicione H2O ultrapuro a um volume final de 50 mL (solução fixadora de PFA a 1%) e despeje o fixador em um frasco de coloração Coplin de vidro de 50 mL.
      NOTA: Este protocolo foi otimizado usando água quase fervente para preparar o PFA; no entanto, o aquecimento de PFA em solução acima de 65 °C pode causar degradação e liberação de vapores tóxicos. Em alternativa, pré-aquecer H2O ultrapuro a 60 °C em banho-maria.
    5. Limpe as lâminas de microscópio de vidro com etanol a 70%. Use uma caneta PAP de barreira hidrofóbica para desenhar até três quadrados (aproximadamente 20 x 20 mm; veja a Figura 1E). Um único par de ovários fornecerá material suficiente para seis quadrados (ou duas lâminas de 3 quadrados, cada).
  3. Sacrifique camundongos prenhes de 14,5 a 18,5 dpc por asfixia por CO2 e luxação cervical de acordo com as diretrizes da IACUC.
    1. Os pontos de tempo para o enriquecimento de estágios específicos da prófase I em camundongos C57BL / 6J são descritos na Figura 1A. Para os pontos de tempo de desenvolvimento fornecidos, a porcentagem aproximada de oócitos em cada estágio da prófase I foi fornecida usando dados de Evans et al. (1982) 31. Para oócitos zigotos, coletar em 16,5 dpc; paquiteno precoce em 17,5 dpc; e paquiteno médio - diploteno a 18,5 dpc.
  4. Use uma tesoura de dissecção para abrir a cavidade abdominal e remover os cornos uterinos.
  5. Disseque os camundongos fetais do corno uterino, tecido decidual e saco vitelino. Coloque os camundongos fetais em uma placa de Petri de 100 mm com 1x tampão fosfato salino (PBS).
  6. Dissecar os ovários de um feto feminino de cada vez, mantendo o restante em 1x PBS. Sacrifique camundongos fetais por decapitação de acordo com as diretrizes da IACUC. Usando pinos de amostra de aço inoxidável, prenda a superfície ventral do tronco até uma almofada de silicone em uma placa de dissecação.
  7. Use uma tesoura de microdissecção para fazer uma incisão abdominal logo abaixo do umbigo, tomando cuidado para evitar cortar as artérias. Use uma pinça fina para deslocar o intestino até que os chifres uterinos fetais fiquem visíveis.
  8. Para localizar os ovários, siga cada corno uterino para fora da bexiga em direção ao rim. O ovário e o oviduto aparecerão como pequenas estruturas glóbulas nos terminais dos cornos uterinos, localizados logo abaixo do rim e próximos à parte posterior da cavidade peritoneal (Figura 1B).
  9. Use uma pinça fina para arrancar os ovários e colete-os em um pequeno vidro de relógio cheio de 750 μL de 1x PBS.
  10. Disseque o ovário dos tecidos circundantes e coloque ambos os ovários em um vidro de relógio contendo 750 μL de HEB, tomando cuidado para garantir que os ovários estejam completamente submersos (ver Figura 1C e 1D). Incube os ovários por 15 min em temperatura ambiente.
  11. Pipetar 35 μL de sacarose 100 mM para uma lâmina de concavidade. Use uma pinça fina para transferir ambos os ovários de HEB para sacarose.
  12. Use uma agulha 25G para prender um ovário à lâmina enquanto usa uma segunda agulha, chanfrada para baixo, para pressionar os oócitos do ovário.
    1. Quando o ovário ficar transparente e gelatinoso, remova o ovário do HEB e repita o processo com o segundo ovário. Pipete suavemente a solução para dispersar as células.
  13. Mergulhe a lâmina no frasco de coloração Coplin de PFA e passe brevemente a borda da lâmina contra uma toalha de papel. Uma vez que o PFA tenha sido coletado em pequenas gotas ao longo do limite hidrofóbico de cada quadrado (Figura 1E), pipete 5 μL da solução de oócito-sacarose em cada gota de PFA.
  14. Espalhe os oócitos sobre as seções quadradas, inclinando suavemente as lâminas para frente e para trás. Tenha cuidado para não permitir que a solução de qualquer quadrado se espalhe para os quadrados adjacentes.
  15. Coloque a lâmina em uma câmara úmida e continue fazendo lâminas até que a solução de oócito-sacarose se esgote.
  16. Repita as etapas 1.6 - 1.15 até que todos os fetos femininos tenham sido usados. Incubar as lâminas em uma câmara úmida à temperatura ambiente por 2 h.
  17. Após a incubação, abra a câmara úmida. Como a maioria (se não todos) o líquido/fixador ainda deve estar presente na superfície da lâmina (aproximadamente 10 μL em cada seção quadrada), transfira suavemente as lâminas para uma toalha de papel e deixe as lâminas secarem completamente ao ar livre em temperatura ambiente em uma bancada de laboratório (esse processo normalmente leva de 30 a 60 minutos, dependendo da umidade local).
    NOTA: As lâminas também podem ser secas ao ar sob uma capela para mitigar a exposição potencial a vapores residuais de PFA. Isso também reduzirá a secagem para cerca de 20 a 30 minutos.
  18. Lave as lâminas em agente umectante a 0,4% em H2O ultrapuro por 2 min. Deixe as lâminas secarem completamente.
    NOTA: Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas a -80 °C; no entanto, certos epítopos são instáveis (por exemplo, em nossa experiência, MLH1 cora mal e a coloração SYCP3 tem artefatos significativos após o congelamento). É altamente recomendável que as lâminas sejam imunomarcadas imediatamente.

2. Coloração por imunofluorescência de propagações cromossómicas da prófase I

  1. Prepare 10x tampão de diluição de anticorpos (ADB; ver Tabela 2) contendo 10% (v / v) de soro de cabra normal, 3% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) e 0,05% de Triton X-100 em 1x PBS. Esterilizar o filtro com um filtro de 0,45 μm e conservar a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
  2. Lave as lâminas em um frasco de coloração Coplin de agente umectante a 0,4% em 1x PBS por 10 min. Lave as lâminas em um frasco de coloração Coplin de 0,1% Triton X-100 em 1x PBS por 10 min. Bloqueie as lâminas em um frasco de coloração Coplin de 1x ADB por 10 min.
  3. Dilua os anticorpos primários selecionados em 10x ADB (consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de anticorpos e suas respectivas diluições).
    1. Prepare quatro combinações de anticorpos para imunomarcação multiplex: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; e (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Remova as lâminas do ADB, retire o excesso de líquido e coloque as lâminas em uma câmara umidificada com água em temperatura ambiente. Aplique 30 μL de anticorpos diluídos por seção quadrada de cada lâmina, tomando cuidado para que os anticorpos de um quadrado não se espalhem para os quadrados adjacentes.
  5. Feche a câmara umidificada e deixe as lâminas incubarem durante a noite em temperatura ambiente.
  6. Na manhã seguinte, abra a câmara úmida e retire os anticorpos diluídos das lâminas. Repita a etapa 2.2.
  7. Dilua anticorpos secundários selecionados em 10x ADB (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: A partir deste ponto, as lâminas e os anticorpos são fotossensíveis. Complete todas as incubações subsequentes no escuro.
  8. Remova as lâminas do ADB, retire o excesso de líquido e coloque as lâminas em uma câmara umidificada com água em temperatura ambiente. Aplique 30 μL de anticorpos diluídos selecionados por seção quadrada de cada lâmina, tomando cuidado para que os anticorpos de um quadrado não se espalhem para os quadrados adjacentes.
  9. Feche a câmara umidificada e deixe as lâminas incubarem por 2 h em temperatura ambiente.
  10. Lave as lâminas 3x por 5 min cada em frascos de coloração Coplin de agente umectante a 0,4% em 1x PBS. Lave as lâminas por 5 min em um frasco de coloração Coplin de agente umectante a 0,4% em H2O ultrapuro.
  11. Aplique uma pequena gota (aproximadamente 10 μL) de meio de montagem antidesbotamento com 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou corante de ácido nucleico equivalente. Coloque uma lamínula de vidro nº 1.5 de 60 mm x 24 mm em cada lâmina e seque cuidadosamente o excesso de líquido.
    NOTA: As lâminas podem ser seladas com esmalte transparente ou cimento de borracha. Se estiver usando um suporte de cura, a vedação das corrediças é desnecessária. As lâminas devem ser armazenadas em uma caixa ou pasta de lâminas a 4 °C. Embora seja uma prática recomendada obter imagens de lâminas logo após a coloração, em nossa experiência, as lâminas armazenadas no escuro a 4 ° C podem reter a intensidade do sinal por vários meses a um ano. Para armazenamento de longo prazo, as lâminas de manutenção podem ser mantidas a -20 °C por vários anos sem perda significativa da qualidade do sinal.
  12. Células de imagem em 63x usando microscopia de epifluorescência (ver Tabela de Materiais). Use um software de análise de imagem (por exemplo, Zen of ImageJ, consulte a Tabela de Materiais) para medir o comprimento SC e a intensidade de fluorescência de todos os canais ao longo do eixo. Trace o comprimento de cada eixo cromossômico (SYCP3), começando no centrômero (região densa CREST ou DAPI).
    1. Para análise de HORMAD1 e SYCP1, registre os comprimentos dos picos do sinal de fluorescência. Calcule os comprimentos totais dos picos de HORMAD1 ou SYCP1 e divida-os pelo comprimento do eixo cromossômico.
    2. Para análise de MSH4, quantificar o número de picos de sinal de fluorescência para cada medição de SYCP3. Registre o número total de picos de MSH4 por núcleo e o número de picos de MSH4 sobrepostos aos picos de MLH3. Confirme as contagens de MSH4 comparando os picos com a contagem de focos correspondente.

3. Preparações de diacinese/prometáfase para observação de quiasmas

  1. Para maximizar o rendimento de oócitos meioticamente competentes, use camundongos fêmeas juvenis (25 a 28 dias de idade).
    NOTA: A estimulação por camundongos fêmeas injetados intraperitonealmente com 5 UI de gonadotrofina sérica (PMSG) de égua prenhe 48 h antes da coleta de oócitos pode ser realizada para aumentar o rendimento. No entanto, para fins de análise de quiasmas, oócitos de vesículas germinativas (GV) suficientes podem ser coletados de fêmeas não estimuladas.
  2. Antes de sacrificar os ratos, prepare os seguintes reagentes e soluções.
    1. Deixar o M2 (3 ml por ratinho) e o KSOM (1 ml por ratinho) equilibrarem numa incubadora de cultura celular (37 °C, 5 % CO2) durante, pelo menos, 1 h.
      NOTA: Tubos de alíquotas de meios congelados podem ser colocados na incubadora com as tampas afrouxadas na noite anterior à coleta de oócitos, permitindo aproximadamente 14 h de equilíbrio.
    2. Prepare o meio M2 com 2,5 μM de milrinona (um inibidor da isoenzima fosfodiesterase que impede a retomada meiótica) 36 . Pipetar cinco gotas de 20 μL de M2 + milrinona para uma placa de Petri de 35 mm e cobrir com óleo mineral leve (Figura 2C).
    3. Pipetar cinco gotas de KSOM de 20 μL em uma placa de Petri de 35 mm e cobrir com óleo mineral leve (Figura 2C).
      CUIDADO: O controle da temperatura e do pH é fundamental para a maturação in vitro do oócito. A colheita de ovócitos deve ser realizada numa bancada aquecida (37 °C). Todos os meios devem ser mantidos na incubadora até que sejam usados, e os pratos de mídia devem ser removidos um de cada vez para limitar a interrupção causada pela exposição ao ar ambiente.
    4. Limpe as lâminas de vidro do microscópio com etanol a 70% e deixe secar ao ar. Na parte de trás das lâminas de microscópio de vidro, marque levemente (com uma caneta de ponta de diamante) ou desenhe (com uma tinta resistente à água) uma grade de 5 x 5 de quadrados de ~ 4 mm x 4 mm (um exemplo é mostrado na Figura 2B e pode ser usado para traçar a grade).
  3. Colete oócitos de um camundongo de cada vez. Sacrifique um camundongo fêmea por asfixia por CO2 e luxação cervical de acordo com as diretrizes da IACUC.
  4. Use uma tesoura de dissecção para abrir a cavidade abdominal. Use uma pinça fina para deslocar os intestinos.
  5. Siga cada corno uterino da bexiga em direção ao rim. Ovários e ovidutos estarão associados a uma pequena almofada de gordura perto do rim.
  6. Use uma tesoura de microdissecção para remover os ovários e coloque-os em meio M2 gaseificado com milrinona.
  7. Use uma tesoura de microdissecção para remover toda a gordura e outros tecidos (incluindo a bursa) dos ovários. Use agulhas 25G para romper os folículos antrais.
  8. Use uma pipeta de transferência para espalhar os oócitos em M2 + milrinona em uma camada fina em uma placa de Petri de 100 mm, tomando cuidado para não deixar a mídia tocar nas laterais da placa (Figura 2C).
  9. Use um microscópio de dissecção (aumento de 25x - 50x) para visualizar oócitos GV (Figura 2F). Os oócitos GV podem estar associados a células do cumulus em um complexo cumulus-oócito (COC). Remova as células do cumulus com pipetagem repetida.
  10. Colete oócitos GV usando uma pipeta de vidro operada por boca (100 - 150 μm de diâmetro; Figura 2A). Transfira os oócitos GV para uma gota de 20 μL de M2 + milrinona revestida com óleo mineral leve (Figura 2C). Não coloque mais de 30 oócitos em uma única gota.
  11. Quando todos os oócitos GV tiverem sido coletados, passe-os por duas ou três gotas de 20 μL de M2 + milrinona revestidas com óleo mineral leve para remover quaisquer células somáticas.
  12. Transfira os oócitos GV (com o mínimo de mídia possível) para uma gota de 30 μL de KSOM. Lave a milrinona passando os oócitos por cinco gotas de KSOM ( Figura 2C ).
  13. Transfira todos os oócitos GV para gotas de 20 μL de KSOM revestidas com óleo mineral leve, um máximo de 30 oócitos por gota de KSOM ( Figura 2C ). Colocar os ovócitos numa estufa de cultura de células (37 °C, 5 % CO2).
  14. Incube os oócitos por aproximadamente 5 h.
    NOTA: Quebra do GV (marcando desaparecimento do envelope nuclear e retomada meiótica; Figura 2G) Geralmente ocorre após 2 h em cultura, mas a taxa de maturação do oócito pode variar dependendo da cepa do camundongo ou da estimulação hormonal. Em nossa experiência, um total de 5 h em cultura otimiza melhor a propagação de quiasmas na maioria das cepas de camundongos. Se deixada para amadurecer por muito tempo, a primeira divisão meiótica e a extrusão do corpo polar podem ocorrer ( Figura 2H ).
  15. Transferir 5 a 10 ovócitos (com o mínimo de KSOM possível) para uma gota de 30 μL de solução hipotónica (citrato de sódio a 0,9% em H2O ultrapuro). Incube os oócitos na solução hipotônica por 5 a 10 min.
  16. Pipetar uma pequena gota (~ 1 μL) de água acidificada (8 gotas de ácido acético glacial em 50 ml de H2O ultrapuro) num dos quadrados das lâminas preparadas (Figura 2B).
  17. Use uma pipeta de vidro de 100 a 150 μm de diâmetro operada por boca para transferir rapidamente um oócito da gota de água acidificada. Transfira o mínimo possível de solução hipotônica com o oócito. Use a mesma pipeta para remover um pouco do líquido até que o oócito grude na lâmina.
    NOTA: O volume de líquido ao redor do oócito é crítico. Deve haver líquido suficiente para que o oócito não seque antes da fixação, mas não tanto que o oócito não possa aderir à lâmina.
  18. Mude rapidamente para uma ponta de pipeta de vidro de 150 μm de diâmetro. Adicione uma gota de fixador de Carnoy fresco (três partes de metanol absoluto para uma parte de ácido acético glacial) ao oócito. Deixe o fixador se dispersar sobre a lâmina. O oócito deve parecer menos distinto e derreter à medida que o ácido do fixador dissolve a zona pelúcida e as células estouram.
  19. Quando a frente do fixador começar a se contrair, adicione rapidamente mais 2 a 3 gotas de fixador. Sopre suavemente na corrediça para acelerar a secagem.
  20. Repita as etapas 3.16 - 3.19 com oócitos adicionais da solução hipotônica.
  21. Repita as etapas 3.15 - 3.20 até que todos os oócitos tenham sido fixados. Verifique a propagação dos cromossomos usando um microscópio de contraste de fase.
  22. Quando a lâmina estiver totalmente seca ao ar, coloque-a em um frasco de coloração Coplin com 50 mL de Giemsa a 4% (v/v) em ddH2O. Lâminas de coloração em Giemsa por 6 min em temperatura ambiente.
  23. Lave as lâminas 3x por 3 min cada em ddH2O em temperatura ambiente. Deixe as lâminas secarem completamente.
  24. Aplique uma camada fina (~60 μL) de Permount em uma lamínula de vidro nº 1.5 de 60 mm x 24 mm. Monte as lâminas invertendo-as nas lamínulas e enxugando cuidadosamente o excesso de líquido. Deixe as lâminas secarem durante a noite antes de obter imagens a 63x em campo claro.

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Resultados

Avaliação de defeitos de sinapse em células paquiteno-símile
Este experimento avalia defeitos de sinapse em oócitos de paquiteno e monitora a progressão da prófase I (Figura 3A). A imunocoloração para SYCP3 (elementos SC axial/lateral), SYCP1 (elemento SC central) e HORMAD1 (eixos cromossômicos não sinapsados/dessinapsados) permite a avaliação do estadiamento e da sinapse. HORMAD1 colocaliza com SYCP3 dura...

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Discussão

Os oócitos de mamíferos são particularmente propensos a erros em comparação com os espermatócitos. Embora o ponto de verificação de montagem do fuso (SAC) menos eficiente do oócito contribua para essa vulnerabilidade 14,52,53, Hassold e Hunt propõem que vários acertos levam à aneuploidia, sendo a recombinação defeituosa um fator primário 54. Estudos em humanos ligam a ane...

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Divulgações

O autor não tem conflitos a divulgar.

Agradecimentos

O financiamento para este projeto foi fornecido por um prêmio K99 do Instituto Nacional de Saúde e Desenvolvimento Infantil Eunice Kennedy Shriver (HD112986 a TH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 & mu; Filtro de Seringa mMillipore SigmaSLHAR33SBpara fabricar pipetas operadas por boca
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI para HEB
Seringa estéril de 1 mL com agulha de calibre 25, 16 mmFisher Scientific14-817-125 para romper ovários
Placa de Petri de 100 x 15 mmVWR25384-302 
Pipetas descartáveis de vidro Pasteur de borosilicato de 14,6 cmFisher Scientific13-678-20B para fabricar pipetas operadas por boca
Placa de Petri de 35 x 10 mmCorning351008
Pinos de aço inoxidável #3 de 40 mm x 0,45 mm para entomologiaAmazonB0CSSPW5S7para imobilização de camundongos fetais para dissecação
Ácido acético, glacialFisher ScientificA38-212para o fixador de Carnoy
Conjuntos de tubos aspiradores para microcapilares calibradosMillipore SigmaA5177-5EApara fabricar pipetas operadas por boca
Vidro de Relógio B.P.I.NDS Technologies & nbsp;1580-00Alternativamente, use um prato embrionário de 30 mm de diâmetro x 12 mm de profundidade (SKU de Ciências da Microscopia Eletrônica: 70543-30)
Ácido BóricoFisher ScientificBP168-1para ajustar o pH do HEB, PFA
Albumina Sérica BovinaMillipore SigmaA7906-100Gpara ADB
Tanque de CO2para incubadora
Lâminas de Microscópio CorningMillipore SigmaCLS294875X25L x L 75 mm x 25 mm, com um lado fosco
Lâminas de microscópio Corning, com geado de um lado e uma das extremidadesVWR294875X25
Cubra o vidro retangular. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
Prato DissecadorCiências da Microscopia Eletrônica70540
Microscópio de DissecaçãoQualquer modelo padrão
Tesoura de dissecação, ponta afiada, 4,5"VWR82027-578
Pinças extra finas e afiadasVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500para tingir espalhamentos de chiasmatas
Caneta PAP de barreira hidrofóbica ImmEdgeLaboratórios VectorH-4000
IncubadoraQualquer modelo padrão com tecnologia de CO2 e jaqueta d'água
Estação de trabalho FIVK-SystemsQualquer modelo com bancada aquecida
Solução Kodak Photo-Flo 200BH Photo & Vídeo1464510para lavagens deslizantes
MetanolFisher ScientificA412-4para o fixador de Carnoy
Pota de Coloração Coplin da MP BiomedicalsFisher ScientificICN17006201
Soro Normal de CabraGibco16210-072para ADB
Paraformaldeído, grau EM, prill purificadoCiências da Microscopia Eletrônica19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Slides de montagem para espalhamentos de chiasmata
Montagem Antidesvanecimento de Vidro ProLong com Mancha NucBlueTermo CientíficaP36985para montagem de lâminas imunocoloridas
Tubo de silicone, diâmetro interno: 0,125", diâmetro externo: 0,25"VWR89068-474para fabricar pipetas operadas por boca
Diidrato de citrato de sódioFisher ScientificS279-500para HEB, solução hipotônica
Sistema de Coloração por Corredores StainTrayCiências da Microscopia Eletrônica71396-BPara uso como câmara umidificada. É preciso usar a tampa preta para a coloração por imunofluorescência. Alternativamente, pode forrar o fundo de uma caixa de deslizamento opaca ou de utensílios de papel toalha úmidos para uso como câmara umidificada 
Dicas para Stripper - 100Cooper SurgicalMXL3-100para pipeta operada por boca
Ponteiras de stripper - 150Cooper SurgicalMXL3-150para pipeta operada por boca
SacaroseMillipore SigmaS-8501para HEB, solução hipotônica de sacarose
Tris BaseFisher ScientificBP152-5para HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 para PFA, ADB e Triton-PBS
Vaso de Coloração Coplin da United ScientificFisher ScientificS17495APlástico branco opaco para lavagens e lâminas de bloqueio após adição de anticorpos secundários fotossensíveis
Slides de Concavidade de Vidro da United ScientificFisher ScientificS1395331,3 mm de espessura, contagem de 2 poços
Tesoura de Microdissecação Vannas 5mm retaVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 SoftwareCarl ZeissSoftware de aquisição e análise de imagens
Anticorpos
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Mouse IgG, específico do fragmento FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071diluição usada 1:1.000
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Rabbit IgG, Fc específico do fragmentoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046diluição usada 1:1.000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragmento de Cabra Anti-Humano IgG, Fcγ Específico do fragmentoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170diluição usada 1:1.000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Cabrit Anti-Porquinho-da-Índia IgG, especificação do fragmento FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008diluição usada 1:1.000
Porquinho-da-Índia anti-MLH3 pAbFeito sob medida com Thermo-Fisher, usado diluição 1:500
Porquinho-da-índia anti-SYCP1 pAbde Christer Hö ö g (Kouznetsova et al. 2005), usou diluição 1:200
Proteína anti-Centrômero humana pAbAntibodies Inc.15-234diluição usada 1:1.000
Mouse anti-MLH1 mAbBD em Biociências550838diluição usada 1:100
Mouse anti-SYCP3 mAbAbcamab97672diluição usada 1:1.000
Rabbit anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APDiluição 1:500 usada
Rabbit anti-MSH4 pAbAbclonalA8556diluição usada 1:100
Rabbit anti-RAD51 pAbMilliporePC130Diluição 1:500 usada
Rabbit anti-SYCP3 pAbAbcamab15093diluição usada 1:1.000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Mouse IgG, específico do fragmento FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071diluição usada 1:1.000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Rabbit IgG, Fc específico do fragmentoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046diluição usada 1:1.000

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