Artigo de método

Desenvolvimento de Linhagens Organoides Derivadas de Camundongos a partir de Células Epiteliais da Trompa de Falópio para Modelagem de Carcinoma Seroso de Ovário de Alto Grau

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 de agosto de 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha o desenvolvimento de modelos de camundongos com carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir da derivação de organoides das trompas de Falópio murina, sua modificação genética para recapitular a genética do HGSOC humano e sua introdução na bursa ovariana de camundongos singênicos para o desenvolvimento in vivo de tumores.

Resumo

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A modelagem eficaz de doenças em ambientes realistas é crucial para melhorar nossa compreensão de diversas patologias. Nesse aspecto, os organoides oferecem um ambiente mais fiel do que suas contrapartes bidimensionais clássicas in vitro. Da mesma forma, os modelos murinos singênicos também permitem que os pesquisadores investiguem interações tumor-hospedeiro mais completas, como com o sistema imunológico, in vivo. Aqui apresentamos um protocolo completo de extração de células epiteliais da trompa de Falópio, a célula-de-origem dos carcinomas serosos de ovário de alto grau (HGSOC), de um camundongo e as derivamos como culturas organoides primárias, bem como sua cultura e manutenção in vitro . Em seguida, descrevemos como usar técnicas de engenharia genética, como superexpressão de genes lentivirais ou retrovirais, bem como deleção do gene CRISPR-Cas9, para modificar essas linhagens e transformá-las em tumoróides pré-cancerosos. Também relatamos como usá-los para validação in vitro , via extração de materiais genéticos e coloração por imunofluorescência. Finalmente, indicamos como injetar efetivamente esses tumoróides na bursa ovariana, o local autóctone do HGSOC, para a iniciação do tumor.

Introdução

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O carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) continua sendo uma doença pouco compreendida e altamente letal. Historicamente, a falta de modelos in vitro e in vivo fiéis que representem a biologia do HGSOC e a resposta à terapia tem sido uma grande barreira ao progresso. Por exemplo, vários (se não a maioria) estudos usaram linhagens celulares que não compartilham as principais características genômicas / genéticas do HGSOC, tornando questionável a relevância de suas descobertas 1,2,3,4. Por exemplo, o modelo de camundongo singênico ID8 comum é derivado do epitélio da superfície ovariana (OSE) e é Trp53-wild tipo5. Por outro lado, a maioria, senão todo o HGSOC, surge no epitélio da trompa de Falópio (FTE)6, e o HGSOC é quase universalmente mutante TP53 ousilenciado7. Desde então, os pesquisadores tentaram retificar essa linha integrando mutações Trp53 nela5, mas como a mutação Trp53 é um evento precoce na patogênese do HGSOC, essa modificação ocorre possivelmente tarde demais na transformação dessa linha celular e provavelmente não representa o desenvolvimento normal do HGSOC.

Na última década, foram feitas tentativas de corrigir esse estado de coisas, gerando modelos mais realistas de HGSOC. Por exemplo, modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) que abrigam mutações relevantes em células da linhagem do trato mülleriano, muitas vezes sob um sistema Cre-recombinase para controlar a patogênese, permitem que os pesquisadores mimetizem melhor a doença in vivo 8,9,10. Infelizmente, esses modelos são frequentemente complicados de gerar e podem ter outros problemas, como vazamento de Cre, efeito Cre ou "efeitos de campo" 11 , 12 , 13 . Nesse sentido, os modelos organoides singênicos parecem ser um compromisso robusto para pesquisadores que desejam mimetizar melhor a doença in vitro e in vivo14,15,16,17,18,19. De fato, embora a maioria dos modelos HGSOC disponíveis e usados no momento sejam modelos bidimensionais, eles infelizmente não podem simular adequadamente a complexidade da matriz extracelular (MEC), um elemento crucial que afeta a biologia celular. Organoides são tecidos 3D auto-organizados, muitas vezes gerados a partir de células-tronco, que podem recriar a complexidade estrutural e funcional inicial de um órgão na placa de Petri20. Sua geração normalmente funciona suspendendo células únicas, que são pluripotentes, em uma matriz de membrana basal (BMM), como o Matrigel21. In vitro, esses modelos são comparativamente mais precisos na recapitulação em condições in vivo do que os modelos 2D. Da mesma forma, devido à sua natureza singênica, esses modelos são capazes de serem transplantados para um camundongo com sistema imunológico em pleno funcionamento, permitindo uma reconstrução mais fiel da patogênese e do desenvolvimento14,15. Esta é uma clara vantagem sobre os xenoenxertos derivados de pacientes, que, embora tenham a genética tumoral mais realista, requerem enxerto em modelos de camundongos imunocomprometidos.

Neste protocolo, descrevemos como desenvolver modelos organoides singênicos de HGSOC. Desde a geração da cultura organoide FTE original do tipo selvagem extraída de um camundongo, sua engenharia genética para gerar genótipos informados sobre doenças, até finalmente seu transplante de volta para a bursa ovariana para gerar tumores totalmente desenvolvidos. Também incluímos alguns protocolos adicionais para ajudar em experimentos comuns, como coloração por imunofluorescência (IF) de organoides in vitro e conversão 2D de linhagens celulares para produção de células em larga escala, como para injeções. Este protocolo é destinado a pesquisadores que desejam desenvolver modelos organoides singênicos de HGSOC com controle sobre sua composição genética, com a intenção particular de estudar a biologia do HGSOC em condições in vitro mais realistas, bem como as interações presentes no microambiente tumoral in vivo.

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Protocolo

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Todas as coletas e procedimentos de tecidos animais foram realizados eticamente sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Alexandria Center for Life Sciences e no Perlmutter Cancer Center na NYU Langone Health, Nova York, Nova York.

1. Preparação de materiais

  1. Preparação de meios organoides murinos (MOM)
    1. Prepare o meio basal combinando os itens da Tabela 1.
      NOTA: O meio é estável por até um mês a 4 °C.
  2. Preparação de mídia 2D
    1. Combine EGF murino recombinante 50 ng/mL, insulina-transferrina-selênio (concentrações finais de 10 mg/L de insulina, 5,5 mg/L de transferina, 6,7 μg/L), soro fetal bovino inativado por calor a 3% (FBS) e penicilina-estreptomicina (100 U/mL), em DMEM (com piruvato e glicose alta).
  3. Preparação da mistura de digestão
    1. Combine colagenase / hialuronidase (3000 U / mL de colagenase, 1000 U / mL de hialuronidase) com DMEM (com piruvato e glicose alta) na proporção de 1:10. Prepare alíquotas de 1 mL em microtubos de 1,5 mL. Conservar as alíquotas a -20 °C e descongelar no gelo.
    2. Prepare alíquotas de uso único de DNAse I (10.000 U / mL) e Dispase (5 U / mL).
    3. Uma vez que uma alíquota de colagenase / hialuronidase no DMEM é descongelada, adicione DNAseI (10 μL, 100 unidades) e Dispase (25 μL, 0,1 unidades).
      NOTA: Esta solução de digestão também é útil para digerir até 0,5 g de tumor.
  4. Manuseio de BMM
    1. Armazene o BMM a -80 °C a longo prazo. Para evitar o congelamento e descongelamento da BMM, prepare alíquotas de 1 mL em tubos de 1,5 mL. Descongele uma alíquota colocando-a no gelo durante 2 h ou durante a noite a 4 °C.
      NOTA: O BMM solidifica à temperatura ambiente (RT). Portanto, é recomendável sempre manter o tubo do BMM no gelo ou em um suporte de tubo frio. Use ponteiras de pipeta pré-resfriadas em um freezer a -20 °C por pelo menos 2 h.

2. Isolamento de células de FTE de camundongo

  1. Descongele uma alíquota de BMM, enzima TrypLE Express pré-aquecida e uma placa de 24 poços a 37 °C (armazene a placa na incubadora por 24 h para obter melhores resultados). Em seguida, prepare a área de operação: ferramentas para dissecção e limpeza do tecido no microscópio de dissecação, placa com PBS + P/S frio e mistura de digestão quente.
  2. Eutanásia de camundongos C57BL/6J fêmeas por asfixia por dióxido de carbono. Realize o método de eutanásia secundária (luxação cervical) conforme exigido pela IACUC.
  3. Dissecar e remover o ovário e a trompa de Falópio e transferi-los para uma placa de Petri estéril contendo DMEM + P-S a 4 °C. Usando um microscópio de dissecação, um conjunto fino de pinças e tesouras remove a quantidade residual de gordura do ovário e isola a trompa de Falópio (infundíbulo e parte da ampola distal) do ovário e do útero.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar tocar na pele ou no cabelo do mouse com as ferramentas para evitar a contaminação microbiana.
  4. Transfira o tecido para o tubo que contém a mistura completa de digestão e use uma tesoura fina para picar a trompa de Falópio em pedaços pequenos (<0,5 mm). Incubar durante 40-50 min a 37 °C.
  5. Após a dissociação, centrifugue as células a 350 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Adicione 500 μL de TrypLE Express pré-aquecido. Incubar durante 15 min a 37 °C.
  6. Extinguir a tripsinização com 500 μL de FBS a 3% em DMEM (meio 2D). Coe a mistura através de um filtro de células de 70 μm para um novo microtubo. Gire por 5 min a 350 g e descarte o sobrenadante.
  7. Ressuspenda o pellet celular (pouco visível, dependendo do número de FTs usados) em 12,5 μL de meio murino organoide e incube brevemente no gelo. Misture com 37,5 μL de BMM gelado e semeie todo o volume (50 μL) no fundo de um poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços.
  8. Colocar a placa a 37 °C durante pelo menos 20 min, mas não mais de 48 h, para definir o BMM. Tenha cuidado para não perturbar as cúpulas ao transferir a placa para a incubadora.
  9. Adicione 500 μL de MOM pré-aquecido a cada poço, pipetando o meio suavemente pela lateral do poço. Nunca adicione mídia diretamente à cúpula, pois isso pode causar danos ou desprendimentos. Coloque a tampa na placa de cultura e incube a 37 °C e 5% de CO2.

3. Manutenção de organoides murinos derivados de FTE

  1. Mudando de mídia
    1. Usando uma ponta estéril e não filtrada de 10 μL, aspire o meio do fundo do poço enquanto a placa é mantida em uma inclinação de 45°. Se a cúpula se desprender da placa, aspire cuidadosamente a mídia do topo do poço enquanto a cúpula destacada está na parte inferior.
    2. Adicione lentamente 750 μL de MOM, pré-aquecido a 37 °C, com a ponta pressionada contra a parede lateral do poço.
    3. Troque a mídia a cada 2 a 3 dias ou até que a mídia mude de cor de rosa para amarelo. Se o meio ficar amarelo menos de 24 horas após a troca, os organoides estão prontos para serem passados.
  2. Organoides de passagem
    1. Remova o meio e lave cada poço com 500 μL de PBS frio (4 ° C). Aspire PBS e adicione 500 μL de solução de recuperação celular fria (4 ° C) diretamente na cúpula BMM para dissolvê-la. Continue pipetando até que o BMM esteja totalmente dissolvido e transfira-o para um tubo de 1,5 mL.
    2. Coloque o tubo no gelo por 30 min e retorne a placa para a incubadora para que permaneça quente. Se estiver usando uma placa nova, certifique-se de que ela esteja pré-aquecida a 37 °C por 24 h.
      NOTA: Se passar mais de 2x cúpulas de 50 μL, como durante as expansões descritas abaixo, a incubação no gelo pode ter que ser estendida por mais de 30 minutos para obter melhores resultados.
    3. Centrifugar a 350 g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante cuidadosamente sem aspirar o pellet e lave com 500 μL de PBS frio. Repita esta etapa três vezes.
      NOTA: Se uma centrífuga fria não estiver disponível, deixe o tubo esfriar entre as lavagens, colocando-o no gelo ou em uma grade fria.
    4. Após a última lavagem, centrifugue a 350 g durante 5 min, retire o sobrenadante e adicione 500 μL de enzima TrypLE Express pré-aquecida (37 °C). Para evitar a perda de células por pipetagem, arraste o tubo contra a grade de ventilação na capa de cultura de tecidos para homogeneizar as células.
    5. Incubar o tubo a 37 °C durante 30 a 60 min.
      NOTA: O tempo pode ser adaptado dependendo do genótipo do organoide e do tempo de passagem, pois alguns podem exigir tripsinização mais longa para produzir suspensões unicelulares.
    6. Pare o processo de dissociação celular adicionando 500 μL de DMEM + 3% de HI FBS e misture pipetando para cima e para baixo até que a solução seja homogeneizada.
    7. Centrifugue a 350 × g por 5 min e aspire o sobrenadante até que haja ~ 20 μL de volume restante. Remova manualmente o sobrenadante restante com uma pipeta P20 em vez de um aspirador a vácuo, pois é comum aspirar o pellet nesta etapa.
    8. Ressuspender as células em 100 μL de MOM frio (4 °C) e medir a concentração celular. Prepare as diluições celulares conforme desejado e mantenha-as no gelo. Em seguida, misture com BMM gelado usando pontas de pipeta que foram armazenadas a -20 °C antes.
      NOTA: Recomenda-se preparar duas cúpulas de 50 μL a 2 × 105 células/mL, onde a proporção de MOM para BMM é de 1:4. Portanto, você deve ter; 25 μL de células em MOM a 8 × 105 células/mL e 75 μL de BMM para um total de 100 μL, divididos em 2 cúpulas. Assim, a pessoa irá efetivamente semear 1 × 104 células por cúpula.
    9. Semeie cada cúpula de 50 μL no meio do poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por pelo menos 30 min para permitir que o BMM solidifique. Adicione 500 μL de MOM a 37 °C conforme mostrado anteriormente na etapa 3.1.2 e retorne a placa para a incubadora.
  3. Expansão
    1. Para expandir a cultura de células organoides para uma placa de 6 poços (pré-aquecida), prepare cinco cúpulas de 50 μL a 8 × 105 células/mL. Ressuspenda as células em um total de 62,5 μL de MOM e misture com 187,5 μL de BMM gelado e semeie as 5 cúpulas no mesmo poço.
    2. Mova a placa para a incubadora por 30 min para permitir que o BMM solidifique. Adicione 2 ml de MOM a 37 °C, conforme indicado anteriormente no passo 3.1.2, e volte a colocar a placa na incubadora. Altere a mídia conforme necessário até que as células sejam confluentes.
      NOTA: Para coletar células para passagem, use 1 mL de solução de recuperação celular em vez de 500 μL e incube no gelo por 45 min em vez de 30 min.
  4. Criopreservação
    1. Para o armazenamento a longo prazo de organoides, passagem conforme descrito nos passos 3.2.1-3.2.7. Em seguida, ressuspenda em 250 μL de meio de congelamento organoide (80% MOM, 10% FBS e 10% dimetilsulfóxido (DMSO)) e transfira para um criotubo. Congele 1 × 105 células por criogenia.
    2. Armazene o tubo em um recipiente de congelamento de frasco criogênico (por exemplo, Sr. Frosty) e deixe-o esfriar em um freezer a -80 ° C. Para armazenamento de longo prazo, mantenha as células em armazenamento de nitrogênio líquido ou em um freezer a -150 °C.

4. Modificação genética de organoides murinos derivados de FTE para desenvolver novas linhagens celulares

  1. Transdução por espinização (lentiviral ou retroviral)
    1. Prepare uma mistura de 25 μL de MOM e 75 μL de BMM e adicione-a a um poço de uma placa fria (4 ° C, permite que o BMM "molhe" totalmente o poço) de 48 poços. Incubar a 37 °C durante 30 a 60 min para permitir que o BMM solidifique antes de semear as células.
    2. Obtenha células individuais derivadas de organoides (etapa 3.2.5) e semeie cerca de 2 × 104 em cima do BMM. Adicione 200 μL de MOM quente (37 ° C) e incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 48 h.
    3. Adicione o vírus na concentração desejada. Determinar o MOI experimentalmente; sugere-se um MOI aproximado abaixo de 30%.
      NOTA: Os organoides são particularmente difíceis de infectar em comparação com as linhagens celulares 2D e esperam MOIs baixos, mesmo com altos títulos de vírus. Centrifugar as células a 600 × g durante 60 min a 32 °C. Retorne a placa à incubadora após o término da inoculação.
    4. Após 8 h, remova o meio e adicione uma mistura de 25 μL de MOM e 75 μL de BMM no topo das células para "ensanduichar" em BMM, permitindo que os organoides cresçam naturalmente em 3 dimensões. Deixe o BMM solidificar colocando a placa na incubadora por 30-60 min. Em seguida, adicione 250 μL de MOM quente (37 °C).
    5. Assim que as células estiverem confluentes, prossiga para passá-las conforme detalhado na etapa 3.2, expandindo todo o volume de células em 2 cúpulas em uma placa de 24 poços.
      NOTA: Se estiver usando uma seleção de antibióticos, recomenda-se realizar a seleção diretamente nos 48 poços, começando 48 h após a inoculação inicial. Se estiver realizando a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), recomenda-se expandir ainda mais em uma placa de 6 poços, conforme descrito acima, para adquirir células suficientes. Tempos de tripsinização mais longos (1 h) também são recomendados para garantir células únicas antes de filtrar amostras para fluxo.
  2. Transformação por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação
    NOTA: Para concentrações e preparação do complexo ribonucleoproteína (RNP), consulte o Guia de Reparo Dirigido por Homologia IDT (pp. 9-11)22. No entanto, omita o HDR Enhancer V2 para nocautes, pois é recomendado apenas para edição de genoma que requer recombinação homóloga.
    1. Preparar uma suspensão unicelular derivada de organoides (passo 3.2.7). Lave com PBS e meça a concentração celular. Transfira uma suspensão celular contendo uma quantidade dentro da ordem de magnitude 104 (1 × 104 a 9 × 104 células) para um tubo de 1,5 mL.
    2. Centrifugue a 350 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 10 μL de tampão de edição do genoma. Se forem necessárias > 1 × 104 células para eletroporação, prepare um volume suficiente para eletroporações seriais, garantindo que cada 10 μL contenha 1 × 104 a 9 × 104 células.
    3. Usando um sistema de pipeta de eletroporação, colete 10 μL da suspensão celular, garantindo que nenhuma bolha seja introduzida. Eletroporate sob as seguintes condições: tensão de 1200 V, duração de pulso de 20 ms, 4 pulsos no total. Coloque as células em um tubo com MOM frio.
    4. Depois de as células serem electroporadas, centrifugar toda a suspensão a 350 × g durante 5 min. Ressuspenda o pellet em MOM e BMM gelados (proporção de 1:4), preparando o suficiente para semear uma cúpula por rodada de eletroporação (1 cúpula por 1 104 células).
    5. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por pelo menos 30 min para permitir que o BMM solidifique. Adicione 500 μL de MOM a 37 °C conforme mostrado anteriormente na etapa 3.1.2 e retorne a placa para a incubadora.
  3. Selecionando clones únicos
    1. Para obter um clone proveniente de uma única célula, passe as células conforme descrito acima, mas semeie 50 a 100 células por cúpula (4 × 103 a 8 × 103 células / mL em suspensão celular antes de misturar com BMM).
    2. Troque o MOM a cada 3 dias. Verifique se os organoides crescem adequadamente e observe quais estão bem separados dos outros.
    3. Quando os organoides atingirem um tamanho discernível (cerca de 500 μm), use um microscópio óptico para identificar 4-5 organoides grandes que estão separados o suficiente.
      NOTA: Eles devem ser visíveis a olho nu, mas é útil marcar a parte inferior da placa com um marcador de ponta fina desenhando um círculo ao redor da área da placa onde está o organoide.
    4. Usando uma pipeta de 20 μL no exaustor estéril, insira suavemente a ponta no BMM e aspire o organoide único (aspire um volume de cerca de 12,5 μL). Coloque o organoide em um tubo coletor de 1,5 mL com 500 μL de MOM.
    5. Centrifugue a 350 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 500 μL de enzima TrypLE Express. Incubar a 37 °C durante 30 min.
    6. Extinguir a reação de dissociação celular com 500 μL de FBS a 3% em DMEM (meio 2D) e centrifugar a 350 × g por 5 min. Remova com muito cuidado o sobrenadante, ressuspenda em 12,5 μL de MOM frio, misture com 37,5 μL de BMM gelado e semeie toda a suspensão como uma única cúpula de 50 μL em uma placa de 24 poços, conforme descrito acima.
    7. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por pelo menos 30 min para permitir que o BMM solidifique. Adicione 500 μL de MOM a 37 °C conforme mostrado anteriormente na etapa 3.1.2 e retorne a placa para a incubadora.
    8. Troque de mídia a cada 3-4 dias e passe quando a cúpula estiver confluente.

5. Derivação de linha celular 2D de organoides

  1. Cultura de células de transição
    1. Comece com uma única suspensão celular, como quando depois de passar organoides.
    2. Proceda como faria para semear uma placa de 6 poços (etapa 3.3), mas usando uma pré-resfriada (4 ° C por 24 h). Semeie as cúpulas em uma placa de 6 poços armazenada a 4 ° C durante a noite e deixe a placa descansar na coifa estéril por 5 a 10 minutos antes de introduzi-la na incubadora.
      NOTA: Esta etapa permitirá que as células se assentem suavemente na parte inferior da placa para acomodar uma condição de crescimento 2D enquanto ainda têm acesso aos componentes ECM do BMM.
    3. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 durante 30 min e, em seguida, adicionar 2 ml de MOM a 37 °C. Altere a mídia conforme necessário.
    4. Quando os organoides atingem a confluência, passagem conforme descrito nas etapas 3.2.1-3.2.7. Após a lavagem final do PBS do poço para remover o BMM restante, adicione 2 mL de mídia 2D pré-aquecida no poço.
      NOTA: A remoção do BMM não removerá as células que estão presas ao poço, e elas agora podem invadir livremente o resto do poço enquanto se adaptam às condições/meios 2D.
    5. Uma vez alcançada uma única suspensão celular com as células que permaneceram no BMM, semear metade do volume das células, repetindo o passo 5.1.2. Adicione a outra metade do poço original, permitindo que mais células se semeem, o que acelerará a confluência.
    6. Troque a mídia 2D após 24 h para remover as células não anexadas.
      NOTA: Deve haver muitas células não aderidas, pois as células cultivadas no BMM não estão acostumadas a substratos plásticos e não se fixam facilmente.
    7. Repita a etapa 5.1.4. Em seguida, ressuspenda todo o volume de células em 4 mL de meio 2D e semeie 2 mL em cada um dos poços usados anteriormente. Troque a mídia 2D a cada 3-4 dias.
  2. Cultura de células 2D para expansão
    1. Quando as células atingirem cerca de 80% de confluência, prossiga para a primeira passagem.
    2. Para passagem, aspire o meio, lave uma vez com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de tripsina a 0,25%. Incubar as células a 37 °C durante 5 a 10 min.
      NOTA: Diferentes linhagens celulares podem ter diferentes propriedades aderentes, fazendo com que a duração da tripsinização varie. Verifique ao microscópio se as células se desprenderam antes de prosseguir para a próxima etapa. Bater suavemente na placa de cultura de células com a mão pode ajudar a separar as células.
    3. Uma vez que todas as células tenham se desprendido, extinguir a dissociação com DMEM + 10% FBS e centrifugar a 350 × g por 5 min.
    4. Para a primeira expansão (quando 80-100% confluente), semeie novamente em uma proporção de divisão de 1:1. Repita a etapa 5.1.6 e troque a mídia 2D a cada 2-3 dias.
    5. Na segunda expansão (80-100% de confluência), semeie todas as células em um prato de 100 mm, ressuspendendo as células em 10 mL de meio 2D a 37 ° C. Repita a etapa 5.1.6 e troque de mídia a cada 2-3 dias.
      NOTA: Este processo é demorado e pode levar até um mês inteiro. Se estiver trabalhando com linhagens celulares que possuem genes integrados viralmente para superexpressão de proteínas, recomenda-se manter antibióticos de seleção presentes no meio de crescimento por toda parte. Se o marcador for uma proteína fluorescente, execute a classificação de células ativadas por fluorescência o mais rápido possível (ou seja, fim da expansão do prato de 100 mm).
  3. Criopreservação
    1. Para o armazenamento destas células, passagem conforme descrito nos passos 5.2.1-5.2.3. Em seguida, ressuspenda ~ 1 × 106 células em 1 mL de meio de congelamento 2D, que é composto por 80% de meio 2D, 10% de FBS e 10% de DMSO, e transfira para um criotubo. Armazene as células seguindo o passo 3.5.2.

6. Validação de linhas organoides

  1. Isolando material genético de organoides
    1. A partir de uma única suspensão celular, semeie duas cúpulas com o dobro da densidade celular usual (1 × 106 células / mL). Mude de MOM no dia 3.
    2. No dia 5, remova a mídia, lave uma vez com PBS e adicione 350 μL de tampão de lise preferido diretamente nas cúpulas. Após 5 min de incubação em RT - ou até que o BMM seja dissolvido - transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL.
    3. Para uso a longo prazo, armazene o lisado a -80 °C. Caso contrário, prossiga com o protocolo de extração de DNA e/ou RNA usando a técnica de extração preferida ou um kit comercial.
  2. Coloração de imunofluorescência (IF)
    1. Para preparar as células, passe conforme descrito nas etapas 3.2.1-3.2.5. Ressuspender em uma mistura de 37,5 μL de MOM e 112,5 μL de BMM gelado (o suficiente para três cúpulas de 50 μL que atuarão como réplicas biológicas). Siga a etapa 3.2.6 e altere a mídia no dia 3 e no dia 5.
    2. No dia 7, aspire MOM e lave as células com 500 μL de PBS. Fixe cada cúpula separadamente adicionando 500 μL de solução pré-aquecida (37 °C) de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS diretamente na cúpula. Incubar a 37 °C durante 60 min até que o BMM se dissolva.
    3. Usando uma ponta de pipeta P1000 de diâmetro largo (se não estiver disponível, basta cortar uma ponta P1000 normal a cerca de 0,5 cm da extremidade fina), colete os organoides em PFA a 4% e transfira o volume para um tubo de 1,5 mL.
      NOTA: O uso de uma ponta de pipeta padrão fará com que os organoides se quebrem.
    4. Aguarde de 2 a 3 minutos para que os organoides afundem no fundo do tubo. Aspire 4% de PFA (deixando uma quantidade segura de volume para não aspirar organoides) e adicione 500 μL de PBS para lavar os organoides. Repita esta etapa mais duas vezes, para um total de 3 lavagens.
      NOTA: Esperar que os organoides afundem é preferível do que a centrifugação para preservar a forma do organoide.
    5. Para armazenamento de longo prazo (4-6 semanas), mantenha os organoides em PBS a 4 °C. Para prosseguir com a coloração, permeabilize com PBS + 1% Triton-X por 30 min em RT. Lave uma vez com PBS.
    6. Bloqueie com PBS + 0,2% de Triton-X + 4% de FBS + 1% de soro de camundongo por 60 min em RT. Lave uma vez com PBS e deixe 100 μL de volume no tubo.
    7. Prepare o tampão de trabalho para a coloração de anticorpos: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% soro de rato. Este tampão funcionará para anticorpos primários e secundários.
    8. Para preparar a coloração primária de anticorpos, calcule a diluição como sendo duas vezes mais concentrada que a diluição real necessária. Prepare solução suficiente para adicionar 100 μL de anticorpo aos 100 μL de PBS restantes em cada tubo. Por exemplo, para uma diluição original de 1:1000, preparar 100 μl de solução 1:500.
    9. Incubar durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave três vezes com 500 μL de PBS.
    10. Prepare a coloração secundária de anticorpos conforme explicado na etapa 6.2.8. Incubar por 1 h em RT.
      NOTA: A partir desta etapa, certifique-se de cobrir a área de trabalho com papel alumínio / caixa escura preferida para evitar o fotobranqueamento dos anticorpos fluorescentes.
    11. Após o término da coloração secundária, lave três vezes com 500 μL de PBS. Remova o máximo de líquido possível do tubo após a última lavagem para preparar a amostra para montagem. Use uma pipeta de 20 μL para ajudar a evitar a aspiração dos organoides.
    12. Usando uma ponta de pipeta larga ou cortada, adicione 20 μL de meio de montagem de sua escolha e homogeneize bem a solução, evitando bolhas.
    13. Coloque uma gota de organoides na solução de montagem em uma lamínula retangular. Usando uma pinça, coloque uma lamínula circular em cima da gota, evitando bolhas, e deixe secar durante a noite no escuro em RT. Repita esta etapa na mesma lâmina se mais de uma amostra por lâmina for colocada.
    14. Adicione mais 20 μL de mídia de montagem diretamente sobre a lamínula circular. Agora, crie um "sanduíche" de montagem virando a lamínula retangular 180° e colocando-a em cima da lâmina do microscópio. Deixar secar no escuro à temperatura alta durante, pelo menos, 8 h.
      NOTA: A lâmina deve estar na seguinte ordem de baixo para cima: lâmina de microscópio, lamínula circular, organoides, lâmina de cobertura retangular. Isso cria condições ideais de imagem.

7. Desenvolvimento de modelos tumorais em camundongos

  1. Preparando células
    1. Descongele um frasco de células 2D de sua escolha em mídia 2D. Permita que essas células cresçam e se expandam para uma placa de 150 mm. Se as células tiverem marcadores de seleção de antibióticos, selecione as células antes da injeção para garantir uma população pura das células desejadas.
    2. Para 5 injeções em camundongos, expanda as células para duas placas de 150 mm. Quando as placas estiverem 80% confluentes, colha as células seguindo as etapas 5.2.2-5.2.3. Ressuspenda as células em 1 mL de meio Opti-MEM I Reduced Serum e meça a concentração celular.
      NOTA: Cada injeção contém 4 × 106 células; no entanto, recomenda-se a preparação para uma injeção adicional para compensar o volume morto das seringas. Nesse caso, prepare 24 × 106 células em vez de 20 × 106 células.
    3. Coloque todo o volume celular para todas as injeções em um tubo de 1,5 mL. Prepare um total de 44 μL por injeção, composto por 1 parte de células em Opti-MEM I não suplementado e 1 parte de BMM gelado. Por exemplo, para 24 × 106 células (6 injeções), ressuspenda em 132 μL de Opti-MEM I e 132 μL de BMM.
    4. Misture bem as células e mantenha no gelo até realizar a injeção.
  2. Preparando-se para o procedimento
    1. Expulse bolhas de ar do volume morto da seringa (insulina U-100 28 G) com PBS frio.
    2. Usando as células no tubo de 1,5 mL, prepare cinco injeções de 40 μL carregando lentamente a seringa para evitar a lise das células devido às forças de cisalhamento dentro da agulha. Mantenha no gelo até que os ratos estejam sedados.
    3. Depois que tudo estiver preparado para as injeções, coloque as seringas ao lado da lâmpada de aquecimento para que o BMM possa aquecer e se tornar viscoso, facilitando a injeção e o enxerto. Não os coloque diretamente sob a lâmpada de aquecimento, pois o BMM supersolidificado não passará pela seringa adequadamente. Em geral, trabalhe rápido para evitar que isso aconteça.
  3. Injeção intrabursal (IBI) no ovário
    1. Anestesiar um camundongo C57BL/6J usando cetamina (100 mg/mL). Administre 0,1 mL por 10 g de peso corporal por injeção intraperitoneal.
      NOTA: Camundongos fêmeas jovens geralmente requerem apenas injeções de 0,2 mL, mas podem precisar de mais se forem mais velhos. Isso fornecerá anestesia por 20 a 40 minutos, mas não fornecerá analgesia.
    2. Coloque o mouse em uma gaiola que foi aquecida pelo aquecimento lamp.
      NOTA: Não coloque ratos diretamente sob a lâmpada de aquecimento, pois isso pode causar necrose da cauda e hipertermia, que podem ser letais.
    3. Uma vez que o primeiro camundongo esteja totalmente anestesiado, usando técnica asséptica, corte uma incisão de <1 cm ao longo do flanco de um camundongo C57BL / 6J na região do abdômen e acima da coxa. Certifique-se de passar pela epiderme e hipoderme antes de chegar à região da bursa.
    4. Puxe cuidadosamente o ovário (facilmente encontrado pela almofada de gordura presa a ele). Pegue uma das seringas preparadas e injete células lentamente através da almofada de gordura logo atrás do ovário, através do próprio ovário, no saco do oviduto.
      NOTA: Uma injeção bem-sucedida fará com que o balão do saco de oviduto seja visto com BMM. A mistura provavelmente também vazará por toda a almofada de gordura, o que é normal.
    5. Coloque cuidadosamente o ovário de volta na bursa e feche a incisão usando grampos cirúrgicos ou costurando.
    6. Coloque o mouse de volta na gaiola. Use uma lâmpada de aquecimento para manter os ratos aquecidos enquanto eles se recuperam no pós-operatório até ficarem semiconscientes (>15 min). No dia seguinte, verifique o mouse para verificar se nenhuma sepse ocorreu durante a noite.

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Resultados

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Um esquema resumindo o fluxo de trabalho para gerar e validar o câncer de ovário HGSOC é mostrado na Figura 1. Este processo começa com a extração do tecido da trompa de Falópio de um camundongo fêmea do tipo selvagem C57BL / 6J (Figura 2A). Recomenda-se começar com um pedaço generoso de tecido para garantir a coleta adequada. O uso de um microscópio de dissecação permite o isolamento preciso da trompa de Falópio distal enquanto...

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Discussão

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Apesar dos avanços significativos na pesquisa oncológica, o HGSOC continua sendo o tipo mais agressivo de malignidade ginecológica e a principal causa de mortalidade entre todos os cânceres de ovário23,24. À medida que a pesquisa em oncologia ginecológica evoluiu, os modelos usados nela também devem evoluir. De fato, muitas linhagens celulares modelo de câncer de ovário histórico foram descobertas como subótimas para estudar esta...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health sob o número de prêmio R01 (CA257507). Os esquemas das figuras foram criados usando BioRender. Queremos agradecer ao Dr. Benjamin Neel por seu apoio ao longo deste projeto, ao Dr. Shuang Zhang pelo desenvolvimento do protocolo original e ao Dr. Kiyomi Araki por sua ajuda na otimização do mesmo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% de tripsina, 0,1% de EDTA em HBSS sem cálcio, magnésio e bicarbonato de sódioCorning25053CI
A83-01Tocris Biociências2939
DMEM/F12 AvançadoGibco12-634-028
Idade C57BL/6J (feminino)O Laboratório Jackson000664
AllPrep DNA/RNA Mini KitQIAGEN80204Para extração de DNA/RNA
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Tecnologias Integradas de DNA10008100
Anticorpo anti-Ki67Abcamab15580
Sistema AutoClipFerramentas Científicas Finas12020-00Para fechamento de ferida pós-IBI
Suplemento de B-27 (50x), sem soroGibco17-504-001
Blasticidina HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenANT-BL-05
Albumina Sérica BovinaSigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393Lisar células antes da extração de DNA/RNA
Solução de Recuperação CelularCorning354253
Colagenase/HialuronidaseTecnologias STEMCELL07912
CoraLite 594-Faloidina (vermelho)ProteintechPF00003
Vidro de cobertura 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Vidro de cobertura 24 mm e agudo; 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
CTS (Sistemas de Terapia Celular) Suplemento N-2GibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Desoxirribonuclease I (DNAse I) do pâncreas bovinoSigma AldrichD5025
Leite Desnatado DifcoBecton Dickinson232100
DispaseTecnologias STEMCELL07913
DMEM com L-Glutamina, 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódioCorning10013CV
DNase I recombinante, livre de RNaseRoche04716728001
Solução Tamponada com Fosfato de DulbeccoSigma AldrichD8537
Dumont #5 - Pinça Revestida de CerâmicaFerramentas Científicas Finas11252-50Para dissecção das trompas de Falópio
Soro Fetal BovinoCorning35-010-CVInativar o calor a 56 °C; C por 60 min.
Tesoura Fina - ToughCutFerramentas Científicas Finas14058-09Para coleta da trompa de Falópio e incisão da IBI
Antibiótico Seletivo de Geneticina (G418 Sulfato) (50 mg/mL)Gibco10131027
Suplemento GlutaMAX (100x)Gibco35-050-061
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, cianano3InvitrogenA10520
Pinça GraefeFerramentas Científicas Finas11053-10Para manuseio de tecidos
Buffer HEPESCorning25060CI
Proteína recombinante humana R-Spondina 1PeproTech120-38
Seringa de insulina, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")BDBD329461
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matriz de membrana basal GFR MatrigelCorning356231BMM
Proteína Recombinante EGF do camundongoPeproTech315-09
Proteína recombinante FGF-básica de camundongoPeproTech450-33
Proteína recombinante de noggin de camundongoPeproTech250-38
Proteína Recombinante Wnt-3A do MousePeproTech315-20
Suplemento N2Gibco17502048
Amida de N-acetilcisteínaSigma AldrichA0737
Sistema de Eletroporação Neon NxTInvitrogenNEON1SPara eletroporação CRISPR-Cas9
Sistema de Eletroporação Neon NxT 10-μ Kit L com válvulas de 1 canalInvitrogenN1025Consumíveis para eletroporação, incluindo buffer de edição genômica
NicotinamidaSigma AldrichN3376
Soro Normal de CamundongosInvitrogen10410
Soro Normal para RatoTecnologias STEMCELL13551
Opti-MEM I Médio Sérico ReduzidoGibco31985070
Anticorpo policlonal PAX8Proteintech10336-1-AP
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromicinaSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm & agudo; 75 mm e agudo; 1,0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Biorreagentes FisherBP151
TrypLE Express Enzima (1x), sem fenol vermelhoGibco12-604-013
Tesoura de mola Vannas - 4 mm de corteFerramentas Científicas Finas15019-10Para dissecção das trompas de Falópio
Y27632Tecnologias STEMCELL72304Inibidor de Rho-quinase (ROCK) & nbsp;

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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