Um fluxo de trabalho verificado para processamento de dados MiRNA-seq e análise de bioinformática usando R

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar dados de miRNA-Seq usando R. O fluxo de trabalho capacita os pesquisadores a explorar redes reguladas por miRNA e sua importância em diversas questões biológicas e clínicas. Este trabalho pretende servir como um guia prático para pesquisadores novatos e experientes no campo da bioinformática de miRNAs.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são reguladores pós-transcricionais críticos que influenciam uma ampla gama de processos fisiológicos e patológicos. Com o avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, o miRNA-Seq emergiu como uma ferramenta poderosa para traçar o perfil dos padrões de expressão de miRNA. No entanto, a interpretação confiável de tais dados requer um pipeline de análise padronizado e reprodutível. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho verificado para processamento de dados miRNA-Seq e análise de bioinformática usando R. Este protocolo abrange todas as etapas essenciais, incluindo pré-processamento de dados brutos, controle de qualidade, alinhamento, quantificação, normalização, análise de expressão diferencial, previsão de alvo, enriquecimento funcional e construção de rede regulatória. Projetado para flexibilidade e transparência, o fluxo de trabalho integra pacotes R amplamente adotados e oferece suporte a anotações específicas de espécies e personalização modular. Além disso, os usuários são orientados a realizar a interpretação biológica a jusante, aproveitando bancos de dados selecionados e ferramentas de visualização, como o Cytoscape. Este protocolo não apenas suporta análises estatísticas robustas, mas também permite insights significativos sobre as interações miRNA-mRNA e seus papéis nos mecanismos da doença. É particularmente adequado para pesquisadores novatos e experientes que conduzem a descoberta de biomarcadores de miRNA, modelagem de doenças ou estudos multiômicos integrativos.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas curtas de RNA não codificantes que influenciam significativamente a expressão gênica por atuarem no estágio pós-transcricional¹. Eles normalmente funcionam ligando-se a sequências complementares nas regiões 3 'não traduzidas (UTRs) de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), levando à degradação do mRNA ou repressão translacional¹. Nas últimas duas décadas, os miRNAs têm sido cada vez mais reconhecidos como reguladores centrais de vários processos biológicos, incluindo proliferação celular, diferenciação, apoptose, respostas imunes e desenvolvimento de órgãos². Além disso, a desregulação da expressão de miRNAs tem sido implicada na patogênese de inúmeras doenças, como câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e doenças renais³. Esses achados destacam o potencial dos miRNAs não apenas como alvos terapêuticos, mas também como biomarcadores minimamente invasivos no diagnóstico clínico.

Com o advento das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), o estudo dos miRNAs entrou em uma nova era. Ao contrário dos métodos baseados em microarray que são limitados a miRNAs conhecidos, o sequenciamento de miRNA (miRNA-Seq) permite um perfil abrangente, de alto rendimento e imparcial de miRNAs conhecidos e novos em diferentes tipos e condições de amostra⁴. O miRNA-Seq fornece sensibilidade, precisão e faixa dinâmica superiores, tornando-o um método preferido para investigar padrões de expressão de miRNA e descobrir mecanismos regulatórios em ambientes fisiológicos e patológicos⁵. No entanto, a análise de dados de miRNA-Seq apresenta desafios computacionais específicos, incluindo o manuseio de comprimentos de leitura curtos, remoção de sequências adaptadoras, distinção entre membros da família de miRNAs intimamente relacionados e gerenciamento de alta redundância em contagens de leitura⁶. Essas características exigem um fluxo de trabalho analítico cuidadosamente projetado e padronizado.

Embora vários pipelines e ferramentas de software tenham sido desenvolvidos para análise de dados de miRNA-Seq, muitos deles dependem de interfaces gráficas de usuário ou fluxos de trabalho fixos que limitam a flexibilidade e a reprodutibilidade⁷. Em contraste, o ambiente de programação R fornece uma plataforma poderosa e personalizável para análise de bioinformática⁸. O R oferece um rico ecossistema de pacotes para modelagem estatística, visualização de dados e integração com bancos de dados biológicos. Isso permite que os usuários realizem análises abrangentes e reproduzíveis de maneira transparente e baseada em script. Além disso, a natureza modular dos fluxos de trabalho R permite que os pesquisadores adaptem cada etapa de acordo com requisitos experimentais específicos, desde o pré-processamento de dados brutos até a interpretação funcional.

Neste protocolo, apresentamos um fluxo de trabalho de análise de miRNA-Seq verificado e completo implementado inteiramente em R, com o objetivo de fornecer uma solução reprodutível e adaptável ao usuário para pesquisadores que trabalham com dados de expressão de miRNA. O fluxo de trabalho começa com o controle de qualidade e o corte do adaptador de leituras brutas de sequenciamento, seguido pelo alinhamento a um genoma de referência ou sequências de miRNA conhecidas. As etapas subsequentes incluem quantificação de contagens de leitura, normalização, análise de expressão diferencial, previsão de genes-alvo, enriquecimento funcional e visualização de rede. O fluxo de trabalho incorpora vários pacotes R amplamente usados e bem mantidos, garantindo confiabilidade e compatibilidade com futuras atualizações e extensões.

Um dos principais pontos fortes deste protocolo reside em sua capacidade de ir além dos resultados de expressão diferencial e fornecer interpretação biológica significativa. Ao integrar bancos de dados selecionados de interações miRNA-mRNA validadas e previstas, o fluxo de trabalho permite que os usuários identifiquem genes-alvo biologicamente relevantes. Esses alvos podem então ser submetidos a análises de ontologia genética e enriquecimento de vias para descobrir processos biológicos e vias moleculares afetados. Na etapa final, as redes de interação miRNA-mRNA podem ser visualizadas usando ferramentas externas, como o Cytoscape⁹, fornecendo informações sobre o cenário regulatório e identificando os principais miRNAs centrais com potencial importância funcional.

Esse método tem sido aplicado com sucesso em contextos de pesquisa clínica, incluindo estudos sobre doença renal, onde os miRNAs circulantes servem como biomarcadores promissores para diagnóstico e prognóstico¹⁰. No entanto, o design modular e flexível do fluxo de trabalho o torna adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo modelagem de doenças, estudos de resposta a medicamentos, biologia do desenvolvimento e genômica comparativa. Os pesquisadores podem adaptar facilmente o fluxo de trabalho para acomodar anotações específicas de espécies, condições experimentais ou camadas adicionais de dados ômicos.

Ao oferecer uma solução de código aberto baseada em script, esse pipeline centrado em R aborda várias das principais limitações associadas às ferramentas de miRNA-Seq existentes, incluindo personalização limitada, dependência de interfaces gráficas não transparentes, falta de suporte para organismos não modelo, baixa reprodutibilidade devido à ausência de controle de versão e dificuldade de integração com estruturas de análise estatística e funcional downstream. Ele permite o controle total sobre os parâmetros de processamento de dados, incentiva a reprodutibilidade por meio de código controlado por versão e promove a transparência na pesquisa em bioinformática. À medida que a importância dos miRNAs continua a crescer no contexto da biologia de sistemas e da medicina translacional, ter acesso a uma estrutura de análise confiável e adaptável torna-se cada vez mais essencial.

Protocol

NOTA: Os materiais com links de software estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparar amostras de RNA e bibliotecas de sequências

NOTA: Execute a extração e o sequenciamento de RNA fora deste fluxo de trabalho computacional. Há mais de uma maneira de analisar dados de sequenciamento de miRNA. Esta seção fornece o contexto de uma prática.

1. Extrair RNA total: Extraia o RNA total das amostras biológicas usando um kit otimizado para isolamento de RNA pequeno (por exemplo, kit de isolamento de miRNA). Siga o protocolo do fabricante cuidadosamente. Certifique-se de usar consumíveis sem RNase e mantenha as amostras no gelo para minimizar a degradação.
2. Avalie a integridade e a quantidade de RNA: Execute 1-2 μL do RNA extraído em um Bioanalyzer ou dispositivo equivalente. Verifique o número de integridade do RNA (RIN) e certifique-se de que esteja ≥ 7.0 para um sequenciamento confiável. Registar a concentração utilizando um espectrofotómetro ou fluorómetro.
3. Construa pequenas bibliotecas de RNA: Prepare bibliotecas de sequenciamento a partir de 1 μg de RNA total usando um kit comercial de preparação de biblioteca de RNA-seq pequeno. Siga o protocolo do kit para ligar adaptadores, transcrever reversamente e amplificar o cDNA. Purifique os produtos de PCR com seleção de tamanho (por exemplo, inserção de 18-30 nt) para enriquecer os fragmentos de miRNA.
4. Bibliotecas de sequência: carregue as bibliotecas em uma plataforma de sequenciamento de alta taxa de transferência. Defina a configuração de execução para sequenciamento de extremidade única com um comprimento de leitura de ~50 bp. Certifique-se de que cada amostra gere aproximadamente 10 milhões de leituras brutas para atingir profundidade suficiente.
5. Exportar saída de sequenciamento: Após o sequenciamento, exporte os dados brutos como arquivos FASTQ usando o software de saída de dados do instrumento. Verifique se o diretório de saída contém as leituras de sequência e os arquivos de pontuação de qualidade associados. Armazene os arquivos FASTQ em um diretório estruturado para análise downstream.

2. Pré-processe leituras brutas e execute o controle de qualidade

1. Sequências do adaptador de corte
   1. Instale e configure o Cutadapt ou fastp.
   2. Execute o corte do adaptador em cada arquivo FASTQ usando o seguinte comando:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      NOTA: A sequência do adaptador seguida após '-a' deve ser aplicada com o kit de preparação da biblioteca de sRNA específico. '-o' define o nome do arquivo de saída com o arquivo de entrada seguido.
2. Avalie a qualidade de leitura
   1. Use o FastQC para gerar relatórios de controle de qualidade:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Revise as pontuações de qualidade por base, a distribuição do comprimento de leitura e a contaminação do adaptador: Abra o relatório HTML do FastQC gerado para cada arquivo FASTQ em um navegador da Web. Examine os seguintes módulos passo a passo:
      1. Qualidade da sequência por base: certifique-se de que a maioria das bases esteja dentro da zona verde (pontuação Phred ≥30). Procure por qualquer queda na qualidade na extremidade 3 ′ que possa indicar erros de sequenciamento.
      2. Distribuição do comprimento de leitura: Confirme se a distribuição corresponde ao tamanho esperado da inserção (por exemplo, 18-30 nt para miRNAs). Verifique se não há picos inesperados.
      3. Conteúdo do adaptador: verifique se as sequências do adaptador foram efetivamente cortadas. Confirme se a porcentagem de contaminação do adaptador está próxima de zero após o corte.
   3. Salve o relatório de resumo do FastQC e sinalize todas as amostras com métricas de baixa qualidade para recorte ou exclusão de análises posteriores.

3. Mapeie leituras e gere matrizes de contagem

1. Alinhar leituras à referência
   1. Baixe o arquivo FASTA do genoma de referência ou sequências de miRNA maduras (por exemplo, do miRBase)¹¹. Exemplo:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Indexe o genoma de referência usando Bowtie.
      1. Abra um terminal e execute o seguinte comando para criar o índice:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. Substitua reference.fa pelo nome real do arquivo FASTA.
      3. Substitua reference_index pelo prefixo desejado para o índice.
      4. Certifique-se de que o Bowtie gere vários arquivos de índice (por exemplo, .ebwt). Verifique se esses arquivos estão presentes no diretório de trabalho, pois são necessários para o alinhamento.
   3. Alinhe as leituras usando o Bowtie com parâmetros adequados para leituras curtas. Exemplo:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      NOTA: O arquivo de entrada é trimmed_reads.fastq e o arquivo de saída é aligned_reads.sam. '-v 0' significa que não permitimos nenhum erro em toda a leitura. '-a -best -strata' significa que jogamos fora qualquer alinhamento que tenha mais incompatibilidades do que o melhor.
2. Quantificar a expressão de miRNA
   1. Converta arquivos SAM para o formato BAM usando SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      NOTA: O arquivo de entrada aligned_reads.sam é o resultado do último comando. O arquivo de saída aligned_reads.bam é preparado para análise subseqüente.
      1. Use o SAMtools para compactar e classificar o arquivo de alinhamento:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. Certifique-se de que o primeiro comando converta o arquivo SAM no formato BAM.
      3. Certifique-se de que o segundo comando classifique o arquivo BAM por coordenadas genômicas.
      4. Certifique-se de que o terceiro comando gere um arquivo de índice (.bai), que é necessário para análises downstream.
      5. Confirme se o arquivo BAM classificado e seu índice foram criados com êxito antes de prosseguir para a quantificação.
   2. Use featureCounts ou HTSeq-count para gerar uma matriz de contagem usando a anotação de miRNA GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      NOTA: featureCounts quantifica as leituras no arquivo de entrada aligned_reads.bam com base em miRNA.gtf e gera counts.txt.

4. Execute a análise de expressão diferencial em R

1. Dados de contagem de carga
   1. Importe a matriz de contagem e os metadados de exemplo para o R:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      NOTA: Os dados de contagem (counts.csv) e o grupo de amostras (metadata.csv) precisam ser fornecidos ao DESeq2. 'condição' aqui esclarece o grupo de amostras fornecidas. Para requisitos individuais, consulte o Manual do DESeq2¹².
2. Normalize e transforme dados
   1. Normalize os dados de contagem usando o método padrão do DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Execute a transformação estabilizadora de variação:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. Visualize o agrupamento de amostras usando o PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Identificar miRNAs diferencialmente expressos
   1. Extraia e classifique os resultados da expressão diferencial:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      NOTA: Reordenamos o arquivo de resultados 'res' com base no valor de pvalue.
      summary(res)
   2. Filtre para miRNAs significativamente expressos diferencialmente (valor de p < 0,05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      NOTA: Existem vários limites para filtrar miRNAs significativamente alterados. Os requisitos 'valor de p < 0,05, |log2FC| > 1' são amplamente aplicados. Os limites podem ser ajustados para dados individuais.
4. Visualizar alterações de expressão
   1. Instale e carregue o pacote EnhancedVolcano.
   2. Crie o gráfico do vulcão:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. Prever genes-alvo de miRNAs

1. Bancos de dados de consulta
   1. Use recursos online como TargetScan, miRDB e miRTarBase para pesquisar microRNA específicos e recuperar genes-alvo.
   2. Concentre-se em alvos validados experimentalmente para maior confiança.
2. Automatizar a previsão em R
   1. Carregue o pacote multiMiR e consulte destinos validados:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      NOTA: Aqui pegamos "has-miR-21-5p", por exemplo, e obtemos alvos validados.
   2. Extraia símbolos exclusivos do gene alvo para análise de enriquecimento:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. Realize análises de enriquecimento funcional

1. Realizar o enriquecimento GO
   1. Ferramentas de enriquecimento de carga:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      NOTA: Aqui, carregamos um banco de dados contendo anotações do genoma humano, que são úteis para converter identificadores de genes comuns.
   2. Execute a análise de enriquecimento GO para processos biológicos:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      NOTA: Para o uso do enrichGO, fornecemos uma lista de genes e esclarecemos que eles são nomeados como 'SÍMBOLO' aqui. Foi realizado o enriquecimento biológico do processo, que corresponde ao parâmetro 'ont ="BP" '. Realizamos várias correções de teste, por isso designamos pAdjustMethod = "BH". Para um limite significativo, escolhemos pvalueCutoff = 0.05.dotplot apresenta um resultado visualizado. Para mais opções individuais, consulte o Manual do clusterProfiler¹³.
2. Realize o enriquecimento da via KEGG
   1. Execute o enriquecimento KEGG:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      NOTA: Para o uso de enriquecerKEGG, fornecemos uma lista de genes e esclarecemos o organismo como humano ("tem"). O dotplot apresenta um resultado visualizado. Para mais opções individuais, consulte o Manual do clusterProfiler¹³.

7. Construir e visualizar a rede de interação miRNA - mRNA

1. Exportar dados para visualização de rede
2. Crie um quadro de dados de pares de genes alvo de miRNA com base nos alvos gerados a partir de TargetScan, miRDB ou miRTarBase.
3. Grave a tabela de rede em CSV:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Importar para o Cytoscape
   1. Abra o Cytoscape e importe a tabela de rede.
   2. Visualize a rede usando layout direcionado à força ou circular.
   3. Analise as propriedades topológicas (por exemplo, centralidade de grau) para identificar miRNAs hub.

Results

Baixamos a matriz de expressão de microRNA do GSE133530 e conduzimos a análise de expressão diferencial diretamente. Fornecemos um exemplo de script R analítico para o conjunto de dados no Arquivo Suplementar 1. O conjunto de dados realizou o perfil global de miRNA em 16 cistos renais de diferentes tamanhos (cistos mínimos: menos de 1-5 mL, n = 10; cistos médios: entre 10-25 mL, n = 4; cistos grandes: maiores que 50 mL, n = 4) e tecido minimamente cístico (MCT, n = 7, inc...

Discussion

A análise de dados de miRNA-Seq apresenta desafios distintos devido ao pequeno tamanho e redundância das leituras, tornando crítico o rigoroso controle de qualidade e o pré-processamento. Uma das etapas mais importantes no fluxo de trabalho é o corte do adaptador. Como os miRNAs têm aproximadamente 22 nucleotídeos, as sequências adaptadoras podem facilmente dominar as leituras se não forem removidas adequadamente. A falha em executar um corte preciso pode resultar em desalinhamento e inf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray humano do miRNA de Agilent-021827	Agilent	/	Uma matriz comercial para traçar o perfil de microRNAs de amostras humanas
Gravata de laço	Universidade Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Uma ferramenta de software para alinhar leituras de sequenciamento a sequências de referência longas
clusterProfiler (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Um pacote R projetado para análise de enriquecimento funcional e visualização de dados biológicos de alto rendimento.
Cutadapt	Código aberto	https://cutadapt.readthedocs.io	Uma ferramenta de linha de comando que remove sequências de adaptadores, primers, caudas poli-A e outros fragmentos indesejados de leituras de sequenciamento de alta taxa de transferência.
Cytoscape	Consórcio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Uma plataforma de software de código aberto projetada para a visualização e análise de redes biológicas complexas.
DESeq2 (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Um pacote R projetado para análise de expressão gênica diferencial de dados de contagem
EnhancedVolcano (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Um pacote R projetado para criar gráficos de vulcões com qualidade de publicação.
FastQC	Babraham Bioinformática	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Uma ferramenta de controle de qualidade de código aberto para dados de sequenciamento de alto rendimento.
contagens de recursos	Subread / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Um programa usado para contar leituras mapeadas para características genômicas
Contagem HTSeq	Pacote Python	https://htseq.readthedocs.io	Uma ferramenta de linha de comando que conta quantas leituras de sequenciamento de alto rendimento alinhadas se sobrepõem a recursos genômicos, como genes ou éxons. Eu
Illumina Human v2 MicroRNA expressão beadchip	Illumina	/	Uma matriz comercial para traçar o perfil de microRNAs de amostras humanas
multiMiR (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Um pacote R que fornece a maior coleção integrada de microRNA previstos e validados experimentalmente– interações de alvo juntamente com suas associações a doenças e drogas.
Org. Hs.eg.db (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Um pacote de anotações projetado para pesquisa genômica humana (Homo sapiens).
R Software	Projeto R	https://www.r-project.org/	Um projeto de código aberto para computação estatística
Estúdio	Positar PBC	/	Um ambiente de desenvolvimento integrado ajuda a ser mais produtivo com R e Python
Ferramentas SAM	Código aberto	http://www.htslib.org/	Um pacote de software para manipular dados de sequenciamento de próxima geração (NGS).