Um fluxo de trabalho verificado para processamento de dados MiRNA-seq e análise de bioinformática usando R

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar dados de miRNA-Seq usando R. O fluxo de trabalho capacita os pesquisadores a explorar redes reguladas por miRNA e sua importância em diversas questões biológicas e clínicas. Este trabalho pretende servir como um guia prático para pesquisadores novatos e experientes no campo da bioinformática de miRNAs.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são reguladores pós-transcricionais críticos que influenciam uma ampla gama de processos fisiológicos e patológicos. Com o avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, o miRNA-Seq emergiu como uma ferramenta poderosa para traçar o perfil dos padrões de expressão de miRNA. No entanto, a interpretação confiável de tais dados requer um pipeline de análise padronizado e reprodutível. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho verificado para processamento de dados miRNA-Seq e análise de bioinformática usando R. Este protocolo abrange todas as etapas essenciais, incluindo pré-processamento de dados brutos, controle de qualidade, alinhamento, quantificação, normalização, análise de expressão diferencial, previsão de alvo, enriquecimento funcional e construção de rede regulatória. Projetado para flexibilidade e transparência, o fluxo de trabalho integra pacotes R amplamente adotados e oferece suporte a anotações específicas de espécies e personalização modular. Além disso, os usuários são orientados a realizar a interpretação biológica a jusante, aproveitando bancos de dados selecionados e ferramentas de visualização, como o Cytoscape. Este protocolo não apenas suporta análises estatísticas robustas, mas também permite insights significativos sobre as interações miRNA-mRNA e seus papéis nos mecanismos da doença. É particularmente adequado para pesquisadores novatos e experientes que conduzem a descoberta de biomarcadores de miRNA, modelagem de doenças ou estudos multiômicos integrativos.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas curtas de RNA não codificantes que influenciam significativamente a expressão gênica por atuarem no estágio pós-transcricional¹. Eles normalmente funcionam ligando-se a sequências complementares nas regiões 3 'não traduzidas (UTRs) de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), levando à degradação do mRNA ou repressão translacional¹. Nas últimas duas décadas, os miRNAs têm sido cada vez mais reconhecidos como reguladores centrais de vários processos biológicos, incluindo proliferação celular, diferenciação, apoptose, respostas imunes e desenvolvimento de órgãos

Protocol

NOTA: Os materiais com links de software estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparar amostras de RNA e bibliotecas de sequências

NOTA: Execute a extração e o sequenciamento de RNA fora deste fluxo de trabalho computacional. Há mais de uma maneira de analisar dados de sequenciamento de miRNA. Esta seção fornece o contexto de uma prática.

1. Extrair RNA total: Extraia o RNA total das amostras biológicas usando um kit otimizado para isolamento de RNA pequeno (por exemplo, kit de isolamento de miRNA). Siga o protocolo do fabricante cu....

Results

Baixamos a matriz de expressão de microRNA do GSE133530 e conduzimos a análise de expressão diferencial diretamente. Fornecemos um exemplo de script R analítico para o conjunto de dados no Arquivo Suplementar 1. O conjunto de dados realizou o perfil global de miRNA em 16 cistos renais de diferentes tamanhos (cistos mínimos: menos de 1-5 mL, n = 10; cistos médios: entre 10-25 mL, n = 4; cistos grandes: maiores que 50 mL, n = 4) e tecido minimamente cístico (MCT, n = 7, inc.......

Discussion

A análise de dados de miRNA-Seq apresenta desafios distintos devido ao pequeno tamanho e redundância das leituras, tornando crítico o rigoroso controle de qualidade e o pré-processamento. Uma das etapas mais importantes no fluxo de trabalho é o corte do adaptador. Como os miRNAs têm aproximadamente 22 nucleotídeos, as sequências adaptadoras podem facilmente dominar as leituras se não forem removidas adequadamente. A falha em executar um corte preciso pode resultar em desalinhamento e inf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray humano do miRNA de Agilent-021827	Agilent	/	Uma matriz comercial para traçar o perfil de microRNAs de amostras humanas
Gravata de laço	Universidade Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Uma ferramenta de software para alinhar leituras de sequenciamento a sequências de referência longas
clusterProfiler (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Um pacote R projetado para análise de enriquecimento funcional e visualização de dados biológicos de alto rendimento.
Cutadapt	Código aberto	https://cutadapt.readthedocs.io	Uma ferramenta de linha de comando que remove sequências de adaptadores, primers, caudas poli-A e outros fragmentos indesejados de leituras de sequenciamento de alta taxa de transferência.
Cytoscape	Consórcio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Uma plataforma de software de código aberto projetada para a visualização e análise de redes biológicas complexas.
DESeq2 (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Um pacote R projetado para análise de expressão gênica diferencial de dados de contagem
EnhancedVolcano (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Um pacote R projetado para criar gráficos de vulcões com qualidade de publicação.
FastQC	Babraham Bioinformática	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Uma ferramenta de controle de qualidade de código aberto para dados de sequenciamento de alto rendimento.
contagens de recursos	Subread / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Um programa usado para contar leituras mapeadas para características genômicas
Contagem HTSeq	Pacote Python	https://htseq.readthedocs.io	Uma ferramenta de linha de comando que conta quantas leituras de sequenciamento de alto rendimento alinhadas se sobrepõem a recursos genômicos, como genes ou éxons. Eu
Illumina Human v2 MicroRNA expressão beadchip	Illumina	/	Uma matriz comercial para traçar o perfil de microRNAs de amostras humanas
multiMiR (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Um pacote R que fornece a maior coleção integrada de microRNA previstos e validados experimentalmente– interações de alvo juntamente com suas associações a doenças e drogas.
Org. Hs.eg.db (pacote R)	Biocondutor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Um pacote de anotações projetado para pesquisa genômica humana (Homo sapiens).
R Software	Projeto R	https://www.r-project.org/	Um projeto de código aberto para computação estatística
Estúdio	Positar PBC	/	Um ambiente de desenvolvimento integrado ajuda a ser mais produtivo com R e Python
Ferramentas SAM	Código aberto	http://www.htslib.org/	Um pacote de software para manipular dados de sequenciamento de próxima geração (NGS).