Artigo de método

Moldes personalizados impressos em 3D para imagens de peixe-zebra e desenvolvimento cardíaco

773 vistas

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

15 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um método usando uma impressora 3D estereolitográfica barata para criar moldes para facilitar a montagem reprodutível de embriões de peixe-zebra para estudos de imagem. Usando este método, criamos moldes para imagens da morfogênese cardíaca em embriões de peixe-zebra.

Resumo

A montagem de embriões é um dos desafios técnicos que os pesquisadores encontram ao realizar um projeto de imagem. Os embriões precisam ser orientados de maneira reprodutível, de modo que o tecido de interesse seja acessível a uma objetiva microscópica durante todo o período de imagem. Para superar esse desafio, os pesquisadores podem incorporar embriões em meios viscosos ou criar pratos e moldes especializados para manter os embriões na orientação desejada durante a imagem. Aqui, descrevemos um método para usar uma impressora 3D estereolitográfica (SLA) barata para fabricar moldes reutilizáveis que criam poços de agarose nos quais os embriões podem ser montados para imagens. Esses poços de agarose fornecem um meio confiável para orientar vários embriões para geração de imagens. Este método inclui uma estrutura de design que pode ser facilmente personalizada para uma variedade de tecidos, organismos e desafios de imagem. Usando esse método, criamos moldes para imagens do desenvolvimento cardíaco em peixe-zebra para microscópios verticais e invertidos. Ao utilizar materiais e equipamentos acessíveis, esse método permite que os pesquisadores criem facilmente moldes específicos para suas necessidades de montagem.

Introdução

Visualizar a dinâmica celular dentro de um animal intacto é essencial para compreender as patologias das doenças congênitas e os processos fundamentais de desenvolvimento e homeostase. Essa visualização abrange imagens em várias escalas espaciais para identificar a dinâmica fisiológica em todo o organismo, bem como nos níveis tecidual, celular e subcelular. As modalidades de imagem usadas para visualizar a dinâmica celular variam de estudos de imunofluorescência de espécimes fixos a imagens de lapso de tempo de espécimes vivos. Essas modalidades de imagem requerem a manutenção de espécimes intactos em orientações específicas, de modo que uma região de interesse seja acessível à objetiva do microscópio.

Os embriões de peixe-zebra são um organismo modelo ideal para estudos de imagem devido à sua transparência óptica, tratabilidade genética, fertilização externa e origem vertebrada. No entanto, a montagem de embriões de peixe-zebra em uma orientação específica de maneira consistente e reprodutível tem representado um desafio contínuo. A montagem é especialmente desafiadora para a visualização do desenvolvimento cardíaco em embriões de peixe-zebra porque a morfogênese cardíaca ocorre em diferentes planos1.

Várias abordagens foram desenvolvidas para enfrentar os desafios da montagem de embriões para imagem. Um dos métodos mais simples envolve a montagem de embriões de peixe-zebra entre duas lamínulas com camadas de fita adesiva entre as lamínulas para evitar o esmagamento. Este método permite a aquisição de imagens em microscópios invertidos e verticais2. Os embriões de peixe-zebra também podem ser montados em um meio ou gel altamente viscoso, como metilcelulose ou agarose de baixa temperatura de baixo ponto de fusão de 0,1-0,8%, para manter os embriões em orientações específicas 2,3,4. Essas abordagens de baixo rendimento funcionam bem para muitos projetos de imagem; no entanto, garantir a integridade do embrião e obter orientações específicas de forma reprodutível pode ser problemático. Para aumentar o rendimento da imagem e facilitar a montagem, poços regularmente espaçados podem ser criados a partir de agarose solidificada em uma placa de imagem 5,6,7,8. Para facilitar a criação desses poços de agarose, foram criados moldes de plástico 9,10,11. Embora esses moldes possam ser aplicados a imagens ao longo dos eixos dorsal-ventral-lateral padrão 10,12, eles geralmente são feitos para desafios específicos de imagem, como para uso em placas de 96 poços13 ou para a detecção do primeiro batimento cardíaco14. Em casos especializados, foram criadas placas de imagem inteiras 5,15,16. Por exemplo, uma câmara microfluídica (chamada ZEBRA) feita de PDMS facilita a imagem e a exposição de embriões a produtos químicos17. Esses moldes geralmente são feitos de silicone ou usinados em lucite 10,18,19. No entanto, o advento de impressoras tridimensionais (3D) relativamente baratas democratizou a criação de moldes personalizados que são usados para criar poços de imagem de agarose.

A impressão 3D, também chamada de manufatura aditiva ou em camadas, envolve a produção de um objeto 3D a partir de um design digital pela adição sequencial e fusão de camadas individuais20,21. A estereolitografia (SLA) utiliza luz ultravioleta (UV) para curar uma resina líquida sensível à luz em camadas sequenciais22. As impressoras SLA são econômicas, rápidas e altamente precisas e podem ser usadas com uma variedade de resinas, incluindo aquelas que fornecem uma superfície lisa16. O processo começa com o software de design assistido por computador (CAD), onde os modelos digitais do objeto podem ser projetados de novo ou modificados a partir de designs pré-existentes. O modelo digital é então virtualmente cortado em camadas imprimíveis. Usando essas camadas digitais, uma impressora 3D constrói o objeto, camada por camada. Aqui, apresentamos um método e uma estrutura para o design personalizado e a criação de moldes de imagem usando uma impressora 3D SLA de baixo custo disponível comercialmente. Além disso, usamos essa estrutura para criar moldes para imagens de diferentes estágios do desenvolvimento cardíaco do peixe-zebra em microscópios invertidos ou verticais e para imagens de embriões de peixe-zebra ao longo de seus eixos lateral, dorsal ou ventral.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os protocolos, experimentos e descobertas descritos aqui foram conduzidos de acordo com os regulamentos e diretrizes de bem-estar animal e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Mississippi (protocolo # 24-008).

Para criar poços de agarose de diferentes formas nos quais os embriões podem ser orientados para imagens, desenvolvemos um projeto que utiliza uma base presa a pinos (Figura 1A). A forma desses pinos (veja a seta apontando para os pinos em roxo na Figura 1A) pode ser personalizada para orientar embriões de diferentes estágios de desenvolvimento e focar em diferentes tecidos. Abaixo, descrevemos um protocolo para personalizar essas estacas e para usar esse sistema para criar poços de agarose.

1. Criando um molde de imagem personalizado

  1. Crie um esboço preliminar do espécime ou embrião posicionado na orientação desejada. Considere a orientação desejada do embrião e se o microscópio a ser usado contém objetivas verticais ou invertidas. Considere também o tamanho do prato, o número de embriões a serem montados e o espaçamento entre eles.
  2. Meça as dimensões do embrião (por exemplo, comprimento, largura e altura) usando um microscópio combinado com uma ferramenta de software como o FIJI23. Use essas dimensões para garantir que os embriões se encaixem nos poços criados pelas estacas.
  3. Identifique uma forma que corresponda à geometria do embrião. Usando as medidas da etapa 1.2 em combinação com um software de desenho assistido por computador (CAD), crie um pino que se aproxime da forma e do tamanho da amostra.
    NOTA: Esta forma pode ser criada em um programa de software CAD básico, combinando e sobrepondo diferentes formas predefinidas, ou a forma pode ser criada de novo usando um programa de software CAD avançado. Além disso, pode-se modificar um de nossos pinos pré-projetados (consulte o Arquivo Suplementar 1). Afunilar o pino, como na Figura 1A, pode ajudar a orientar os embriões para garantir que o tecido de interesse esteja mais próximo do objetivo.
  4. Combine o design do pino com o design da base:
    1. Em um programa de software CAD, adicione um pino personalizado a uma das bases predefinidas (Arquivo Suplementar 1). Em seguida, duplique e coloque uniformemente os pinos em toda a base para obter imagens de alto rendimento usando as ferramentas em um programa CAD avançado. Verifique novamente para garantir que todos os pinos atinjam a mesma altura longe da base.
  5. Prepare o design para impressão 3D:
    1. Transfira o projeto de molde personalizado ou um dos moldes pré-projetados (Arquivo Suplementar 2) para um software de fatiador, que converte o projeto em comandos para a impressora 3D.
    2. No software de fatiamento, certifique-se de girar o design para que os componentes críticos, como os pinos, sejam posicionados longe do estágio da impressora. Para o suporte de lamínula, que é impresso em uma impressora FDM (modelagem de deposição fundida), posicione a impressão horizontalmente.
      NOTA: A rotação do design evitará empenamento, o que pode acontecer quando peças delicadas são posicionadas perto do estágio de impressão.
    3. Adicione suportes dentro do software do fatiador para garantir que os aspectos delicados do molde não se quebrem durante a impressão. O recurso de colocação automática de suporte médio no software, juntamente com a curadoria manual, garante uma boa distribuição de suportes sem grandes lacunas. Uma estratégia de 100% de preenchimento é usada para criar um molde sólido.
    4. Imprima várias peças simultaneamente usando um único arquivo STL contendo todos os moldes ou organizando arquivos STL individuais juntos usando o software de fatiamento.
  6. Impressão
    NOTA: As impressoras SLA são nosso tipo de impressora 3D preferido para os moldes de imagem devido à sua viabilidade, precisão e criação de superfícies lisas. Uma impressora FDM é usada para fazer o porta-lamínulas porque cria impressões leves e mais rígidas do que as impressoras SLA.
    1. Comece com as seguintes configurações de impressão e otimize a partir daí: 0,05 mm de altura da camada; 5 contagem de camadas inferiores; 2,5 s de tempo de exposição; Tempo de exposição inferior de 35 s; 5 mm de elevação do fundo e distância de elevação; Velocidade de elevação inferior de 60 mm/min; Velocidade de elevação de 80 mm/min; e velocidade de retração de 210 mm/min.
      NOTA: As configurações de impressão provavelmente precisarão ser otimizadas pelo usuário, pois dependem do tipo de resina, temperatura ambiente e modelo da impressora.
  7. Após a impressão, lave os moldes em água, remova os suportes e coloque os moldes sob luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos para garantir a solidificação da resina.
    NOTA: Lavar e curar bem os moldes é importante para evitar que a resina descasque e para evitar que o molde fique deformado.
    Luvas e jaleco devem ser usados ao manusear resina não curada e limpar os moldes, pois a resina não curada pode ser irritante para a pele. As impressoras SLA usam luz ultravioleta para curar a resina, que pode ser prejudicial aos olhos e à pele. Certifique-se de que a câmara de impressão esteja bem fechada e evite olhar diretamente para a fonte de luz UV.

2. Um procedimento para usar moldes impressos em 3D para criar poços de agarose

  1. Fazendo poços de agarose
    1. Faça poços de agarose dissolvendo 2% (g / mL) de agarose em meio E3 (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2 * 2H2O, 0,161 mM MgSO4 * 7H2O). Coloque um molde no centro de um prato de fundo de lamínula com a seta apontando para baixo em direção ao poço (consulte a Figura 2A, B). Pipete 750 μL de agarose fundida a 2% / E3 ao longo da metade do perímetro do molde de imagem (consulte a Figura 2C).
      NOTA: A agarose derretida deve ser não viscosa, mas fria o suficiente para pipetar sem criar bolhas. Usamos pratos de 60 mm com fundo de lamínula de 30 mm, enquanto para moldes projetados para microscópios verticais, um prato padrão de 60 mm pode ser usado. Um protocolo ligeiramente diferente é usado para o molde de peneiramento (veja abaixo).
    2. Pipete mais 750 μL de agarose derretida a 2% / E3 ao longo da outra metade do perímetro do molde de imagem (consulte a Figura 2D).
    3. Aguarde 5-7 min para que a agarose solidifique, observando a transição de um líquido transparente para um gel azul opaco (ver Figura 2E).
    4. Adicione uma fina camada de agarose derretida ao redor do perímetro da agarose central solidificada.
      NOTA: Embora não seja estritamente necessário, esta etapa ajuda a ancorar a agarose solidificada ao prato e evitar o descolamento induzido pelo meio.
    5. Coloque o anel externo (Figura Suplementar S1B) sobre o conjunto do molde de agarose com a seta apontada para a agarose (consulte a Figura 2F).
    6. Enquanto segura suavemente o anel externo, puxe cuidadosamente o molde interno para cima para soltá-lo da agarose (consulte a Figura 2G).
      NOTA: Para evitar quebrar ou danificar os poços de agarose, não empurre com muita força o anel externo e não torça ou desloque o molde interno ao puxar para cima.
    7. Remova o anel externo, revelando os poços de agarose no prato inferior da lamínula (Figura 2H).
    8. Inspecione os poços de agarose sob um microscópio para confirmar o dimensionamento e a produção corretos.
      NOTA: Para imagens em um microscópio invertido, uma fina película de agarose geralmente precisa ser levantada do fundo do poço. Isso pode ser feito com fórceps.
  2. Protocolo modificado para uso do molde de peneiramento
    1. Despeje agarose a 2% derretida / E3 na placa de Petri até que esteja aproximadamente na metade.
    2. Segure o molde com os pinos voltados para cima e pipete agarose a 2% derretida / E3 nos pinos, até que estejam cobertos (~ 3 mL).
      NOTA: Certifique-se de que as bolhas não sejam introduzidas liberando apenas 90% da agarose derretida que foi puxada para a pipeta.
    3. Usando um movimento de inclinação, coloque uma extremidade e, em seguida, todo o molde com as estacas voltadas para baixo na placa de Petri contendo agarose derretida (Figura Suplementar S2).
    4. Deixe a agarose solidificar por 5-7 min.
    5. Remova cuidadosamente o molde usando a alça para erguer uma extremidade e depois a outra extremidade.

3. Montagem de embriões em poços de agarose com e sem agarose de baixa temperatura de fusão

  1. Descorione e anestesiar os embriões em uma solução de tricaína de 200 μg/mL antes da montagem.
    NOTA: Uma solução de tricaína de ~ 400 μg / mL é necessária para impedir que o coração bata.
    1. Sem usar agarose de baixa temperatura de fusão: Encha a placa de imagem com 1x E3 e tricaína (200 μg / mL), adicione embriões anestesiados descorionados à placa de imagem, use uma pinça para colocar e orientar os embriões nos poços de agarose e, em seguida, faça a imagem (ver Figura 2I, J).
      NOTA: Como a pinça pode danificar facilmente um embrião, pode-se usar um atiçador de embriões no qual uma linha de pesca de 0,41 mm de diâmetro é inserida em um tubo capilar ou ponta de pipeta e presa com supercola24.
    2. Usando agarose de baixa temperatura de fusão:
      NOTA: Embora os moldes sejam projetados para colocar embriões em orientações específicas, o uso de agarose de baixa temperatura de fusão para manter os embriões no lugar pode garantir que os embriões não se desviem durante a imagem ou durante o transporte da placa de imagem com os embriões montados para o microscópio. As etapas abaixo são derivadas do nosso protocolo anterior6.
      1. Crie tubos de agarose de baixa temperatura de fusão dissolvendo 0,1-0,8% de agarose de baixa temperatura de fusão em 5 mL de meio E3 e aquecendo a 65-70 °C em banho-maria. Ocasionalmente, inverta o tubo até que a agarose de baixa temperatura de fusão se dissolva. Alíquota da solução de agarose de baixa temperatura de fusão em tubos de microcentrífugas e colocá-los num bloco de calor regulado para 42 °C. Deixar a solução equilibrar a 42 °C durante pelo menos 1 h.
        NOTA: Geralmente, é aconselhável usar uma solução de agarose de baixa temperatura de fusão recém-feita.
      2. Usando uma pipeta Pasteur de vidro de diâmetro largo, transfira um único embrião para um tubo contendo a solução de agarose de baixa temperatura de fusão Para evitar a adição de excesso de líquido à solução de agarose de baixa temperatura de fusão, transfira apenas o embrião e o líquido imediatamente ao seu redor. Transfira imediatamente o embrião, que agora está em agarose de baixo ponto de fusão, para um dos poços de agarose. Retorne a solução de agarose de baixa temperatura de fusão ao bloco de calor para reutilização.
      3. Usando uma pinça ou um atiçador de embriões (consulte a etapa 3.1.1), posicione o embrião no poço para obter imagens.
      4. Repita as etapas 3.1.2.2-3.1.2.3 para os outros poços. Se os poços anteriores começarem a secar, use uma pipeta p200 para adicionar uma pequena quantidade de E3 (~ 50-100 μL) no topo do poço.
  2. Uma vez que os embriões tenham sido montados em todos os poços e a agarose de baixa temperatura de fusão tenha solidificado, usando uma pipeta, adicione lentamente a solução de tricaína/E3 à placa de imagem.
  3. Após a imagem, extraia os embriões cuidadosamente dos poços usando uma pinça e permita que eles se desenvolvam ainda mais para garantir que a imagem não cause defeitos de desenvolvimento.
    NOTA: Os poços de agarose podem ser removidos da placa de imagem, que pode ser enxaguada e reutilizada. Enxaguar com limpador de vidros disponível comercialmente e, em seguida, várias vezes com ddH2O ajuda a remover depósitos de sal nas lamínulas. Embora não tenhamos experimentado toxicidade devido a vestígios residuais de limpador de vidros, o pesquisador é aconselhado a confirmar esses resultados usando suas próprias condições de laboratório.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O protocolo acima foi usado para projetar moldes para imagens de diferentes estágios do desenvolvimento cardíaco em peixe-zebra, incluindo fusão cardíaca, formação de tubo cardíaco, loop cardíaco e formação de câmara. Como o desenvolvimento cardíaco não ocorre ao longo dos principais eixos anatômicos do embrião, a forma dos pinos foi personalizada para diferentes estágios de desenvolvimento, a fim de posicionar adequadamente os embriões. Por exemplo, a colocação interna anterior do coração do peixe-zebra 48 horas após a ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para projetar moldes impressos em 3D que criam poços de agarose que podem facilitar a montagem de embriões ou tecidos para estudos de imagem. Esses moldes podem ser feitos para imagens com microscópios verticais ou invertidos e os poços de agarose feitos usando esses moldes personalizados podem ser usados para aplicações de imagem que variam de estudos de imunofluorescência de embriões fixos a imagens de timelapse de embriões vivos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Bloomekatz, especialmente Sasmitha Singh e Allison Holmes, bem como ao núcleo de imagens GlyCORE (apoiado pela P20GM130460), ao laboratório IDEA da Universidade do Mississippi, ao Dr. Yiwei Han e ao laboratório Han e aos membros das comunidades de Glicociência e Biologia do Desenvolvimento da Universidade do Mississippi. Este trabalho é apoiado por financiamento do NIH (R15HD108782, P20GM130460).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Impressora 3D SLAElegooMARS 2 PRO
Agarose Biopesquisa Apex; Genesee Scientific 20-102QDQualquer marca pode ser substituída por
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ Software de design de auxílio de computador (CAD) - mais avançado
Microscópio vertical Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Software Slicer
Prato de fundo de lamínula (prato de 60 mm com fundo de 30 mm)CellvisD60-30-1.5N
F59 Cadeia pesada de miosina (todas as isoformas rápidas)DHSBF59Filamentos FDM de diluição 1:50
BambuPLA filamentos
impressora FDMBambuBambu X1 Carbon FDM0.4mm bico extrusor
FórcepsFisher16-100-121Outras marcas provavelmente serão adequadas
Cabra anti-mouse Alexa 488ThermoFisher#A28175diluição 1:300
ImarisAndor10.2Software
Microscópio Confocal InvertidoLeicaLeica SP8 X
Agarose de baixa temperatura de fusãoGold BiotechnologyNº de catálogo: A-204-25Outras marcas provavelmente serão adequadas
Bomba de pipetaBel-ArtF37898
Resina para impressora SLAElegooElegoo P05BB028Fotopolímero lavável com água Resina V2.0
Ricinus communis aglutinina (RCA-120)Laboratórios vetoriais#RLK-2200 (kit de lectina)Diluição 1:300
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/Software de design de auxílio de computador (CAD) -
básico Tricaine S Western Chemical, Inc. ANADA #200-226
Aglutinina de gérmen de trigo (WGA)Laboratórios vetoriais#RLK-2200 (kit de lectina)Diluição 1:300
Pipeta Pasteur de vidro de diâmetro largo Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT

Referências

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Moldes Impressos em 3DMontagem de Embri esPo os de AgaroseImpress o Estereolitogr ficaMicrosc pios VerticaisMicrosc pios InvertidosOrienta o de TecidosMoldes Reutiliz veis
Vídeo em breve

Artigos relacionados