Aqui, apresentamos um protocolo para preservar a arquitetura arterial humana por meio da infusão de gel estabilizador de tecido no lúmen do vaso antes do seccionamento para análise molecular ou histopatológica.
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Artigo de método
In vitro Infusão de gel intraluminal: uma abordagem avançada para análise microscópica de artérias de resistência humana
Neste artigo
Resumo
Resumo
As artérias de resistência, que incluem pequenas artérias e arteríolas, desempenham papéis essenciais na regulação da pressão arterial e da perfusão tecidual. A disfunção nessas artérias pode levar a várias condições cardiovasculares, como hipertensão, aterosclerose e insuficiência cardíaca, bem como condições neurovasculares. O exame das artérias de resistência humana é crucial para a compreensão dos mecanismos das doenças cardiovasculares e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas. Este estudo apresenta um método inovador para preparar artérias de resistência humanas isoladas por meio da infusão de um gel estabilizador de tecidos no lúmen, preservando sua arquitetura nativa e integridade celular. Tecidos omentais humanos foram obtidos de pacientes submetidos a cirurgias abdominais, e pequenas artérias de resistência (100-300 μm de diâmetro) foram isoladas por microdissecção cuidadosa. As artérias foram então canuladas, pressurizadas em uma câmara de miografia de cultura e fixadas com formol tamponado neutro a 10%. Um gel estabilizador tecidual foi infundido no lúmen da artéria canulada, que foi solidificado para preservar a estrutura tridimensional. Análises histológicas, imuno-histoquímicas e de expressão gênica foram realizadas para avaliar a preservação das artérias. Os cortes histológicos revelaram a integridade estrutural bem preservada e a arquitetura natural das artérias, mantendo as camadas endotelial e muscular lisa bem definidas. A coloração imuno-histoquímica mostrou localização distinta de marcadores como CD31 e actina de músculo liso α. A hibridização in situ revelou padrões específicos de expressão gênica, fornecendo informações sobre os mecanismos moleculares. Este método avançado de infusão de gel intraluminal oferece vantagens significativas, permitindo imagens avançadas e análise abrangente da estrutura arterial, remodelação e interações celulares em estados saudáveis e doentes. Este método tem o potencial de melhorar o diagnóstico clínico e as estratégias terapêuticas para doenças vasculares, fornecendo assim uma ferramenta valiosa para o avanço da pesquisa em biologia vascular.
Introdução
As artérias de resistência regulam o fluxo sanguíneo e a pressão e sofrem mudanças significativas em condições como hipertensão, diabetes e aterosclerose 1,2,3,4,5. O exame das artérias de resistência humana é essencial para a compreensão das patologias cardiovasculares e o desenvolvimento de terapias direcionadas 6,7,8,9,10. Os métodos tradicionais de investigação de vasos sanguíneos muitas vezes levam a artefatos e perda de integridade tridimensional 10,11,12,13,14,15. Para resolver essas limitações, apresentamos um método inovador para preparar artérias de resistência humanas isoladas por meio da infusão de um gel no lúmen, preservando assim sua estrutura ex vivo e/ou in vivo aproximada.
Esta técnica de infusão de gel intraluminal mantém a arquitetura natural das artérias, permitindo uma representação mais precisa do seu estado fisiológico. Ao estabilizar a estrutura do vaso, este método facilita o exame detalhado da remodelação arterial, estrutura celular, microdomínios, junções heterocelulares e expressão gênica/proteína em diferentes camadas celulares. Essa técnica é particularmente vantajosa para estudar componentes específicos do tipo de célula em estados saudáveis e doentes.
Essa técnica foi aplicada com sucesso em nosso estudo recente16, demonstrando sua eficácia na preservação da integridade estrutural e molecular das artérias de resistência humana, facilitando imagens avançadas e análises abrangentes. O sucesso deste aplicativo nos inspirou a documentar este protocolo detalhado para que outros possam usar.
Neste artigo de método, descrevemos o protocolo para preparar artérias de resistência humanas isoladas e infundi-las com um gel estabilizador de tecido biocompatível (Tissue Guard Gel). Aqui, descrevemos o método experimental e ilustramos suas aplicações para a avaliação da estrutura arterial e a investigação de padrões de expressão gênica e proteica em diferentes camadas celulares. Ao fornecer uma técnica abrangente e reprodutível para a preparação de artérias de resistência humana, pretendemos avançar na pesquisa em biologia cardiovascular, melhorar a reprodutibilidade dos resultados e contribuir para novas abordagens diagnósticas e terapêuticas para doenças cardiovasculares.
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Protocolo
Antes de realizar os experimentos a seguir, certifique-se de que o uso de tecidos humanos e os procedimentos a seguir sejam aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB). A coleta de tecido omental de pacientes submetidos a operações abdominais clinicamente indicadas no Centro Clínico do National Institutes of Health (NIH) foi realizada com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional do NIH (NCT01915225). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.
1. Materiais e equipamentos
- Consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre todos os reagentes e materiais necessários para este protocolo. Para obter detalhes adicionais, os manuais e sites associados aos respectivos fornecedores podem ser consultados conforme necessário.
2. Coleta de tecidos omentais humanos
- Colete tecidos omentais humanos da equipe cirúrgica.
- Coloque imediatamente os tecidos em um recipiente de amostra pré-resfriado contendo tampão Krebs Henseleit (KH) frio (composição: 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 e 11,1 mM de glicose) no gelo.
- Certifique-se de que os lenços estejam totalmente submersos no tampão e, em seguida, feche bem a tampa.
- Transporte os tecidos no recipiente fechado em gelo para o laboratório dentro de 30 minutos após a coleta para garantir a viabilidade do tecido.
NOTA: Certifique-se de ajustar o pH para 7,4 usando NaOH durante a preparação do tampão.
3. Microdissecção de pequenas artérias de resistência humanas
- Ao chegar ao laboratório, enxágue os tecidos omentais com tampão KH frio para remover o excesso de sangue.
- Selecione um pedaço da região mais vascularizada do tecido para dissecção em tampão frio em uma placa de Petri no gelo.
- Sob um microscópio de dissecação, identifique pequenas artérias de resistência (100-300 μm de diâmetro) com base em sua localização e padrão de ramificação.
- Isole cuidadosamente as artérias identificadas dos tecidos adiposo e conjuntivo circundantes. Usando pinças finas e microtesouras, corte e remova os tecidos circundantes sem danificar a artéria.
- Mantenha as artérias isoladas em um tampão frio durante todo o procedimento de dissecção para manter a viabilidade e evitar qualquer degradação enzimática.
NOTA: Antes da dissecação, certifique-se de que a área de dissecção esteja limpa. Verifique se a escala objetiva do microscópio e/ou o software da câmera estão calibrados corretamente para medir com precisão o diâmetro em diferentes ampliações. Normalmente, as veias são claramente visíveis e as artérias estão localizadas ao lado ou ao redor das veias. As paredes das artérias são mais espessas do que as das veias. Quando isoladas do tecido circundante, as artérias mantêm sua estrutura como tubos de vasos intactos. Em contraste, as veias têm paredes mais finas, geralmente parecem mais brilhantes devido ao sangue em seu lúmen e tendem a ser mais frágeis quando separadas do tecido.
4. Preparação da câmara do miógrafo de cultura
- Preparar uma câmara de miografia de cultura com duas cânulas de vidro para a canulação e pressurização das artérias dissecadas.
- Prepare uma seringa de 5 ml com um tubo capilar limpo e encha com tampão KH fresco. Conecte o tubo a uma extremidade da cânula e encha com o KH, sem deixar bolhas de ar.
- Encha a câmara com tampão frio e coloque-a sobre gelo para manter uma temperatura baixa.
NOTA: Um pequeno prato feito sob medida com duas cânulas, projetado para imitar a câmara do miógrafo, pode ser usado.
5. Canulação e pressurização das artérias
- Transfira cuidadosamente a artéria dissecada para a câmara do miógrafo usando uma pinça fina ou uma pipeta de transferência com um diâmetro maior que o da artéria.
- Prepare quatro nós abertos com a sutura de náilon (sutura 11/0, 7 camadas) e coloque dois deles em cada cânula antes de canular a artéria.
- Canule a extremidade proximal da artéria deslizando-a sobre uma cânula de vidro usando uma pinça fina e prenda-a com as duas suturas de náilon.
- Use o tampão KH na seringa para lavar suavemente a artéria canulada para remover qualquer sangue restante.
- Canule a extremidade distal da artéria e prenda-a da mesma forma.
- Coloque a câmara na unidade de miógrafo que está conectada ao controlador de pressão e temperatura.
- Defina a temperatura para 37 °C.
- Defina a pressão intraluminal inicial para 10 mmHg.
- Aumente a pressão intraluminal em incrementos de 10 mmHg a cada 10 min até atingir 60 mmHg. Certifique-se de que a pressão seja mantida de forma consistente usando o regulador de pressão conectado ao sistema de miógrafo de cultura.
- Use o microposicionador para endireitar longitudinalmente a artéria pressurizada conforme necessário para trazer o comprimento aproximadamente ao seu nível fisiológico.
- Execute o MyoVIEW ou outro software adequado no monitor do computador para rastrear os diâmetros arteriais interno e externo com paquímetros digitais.
- Deixe a artéria se equilibrar por 45 min para atingir um diâmetro estável, garantindo que ela mantenha suas dimensões fisiológicas e tônus.
- Teste a viabilidade da artéria usando um vasoconstritor (por exemplo, 60 mM KCl ou fenilefrina) ou vasodilatador (por exemplo, acetilcolina) e registre as alterações no diâmetro arterial.
NOTA: Aplicar pressão excessiva com uma seringa pode danificar a artéria, por isso é importante ter cuidado ao lavá-la. Use uma quantidade mínima de buffer e proceda com cuidado. Alternativamente, o sangue arterial pode ser eliminado usando o tampão de perfusão enquanto pressuriza a artéria. As artérias podem ser pressurizadas a 80 mmHg e o tempo de equilíbrio pode ser de até 1 h.
6. Fixação da artéria
- Após o equilíbrio, fixe as artérias luminal e abluminalmente durante a noite com formalina tamponada neutra a 10%. Mantenha uma pressão constante de 60 mmHg para garantir que o processo de fixação preserve a integridade estrutural da parede arterial e dos componentes celulares.
- Após a fixação, enxágue as artérias luminalmente e abluminalmente com PBS para remover qualquer fixador residual da artéria e da câmara.
NOTA: Dependendo do objetivo do estudo e da região de interesse para análise, o vaso montado pode ser fixado na presença de agentes farmacológicos, como vasodilatador ou vasoconstritor. Nesta fase, a artéria pode ser armazenada em PBS a 4 °C por até 48 h. O paraformaldeído a 4% também pode ser usado para fixar as artérias.
7. Preparação do gel estabilizador de tecidos
- Liquefazer o gel estabilizador de tecidos no seu tubo, aquecendo-o a 60 ± 5 °C antes da utilização.
- Coloque o tubo em temperatura ambiente (RT) por 3-5 min para que o gel líquido diminua a temperatura e, em seguida, coloque-o em um bloco de aquecimento a 40 °C para manter o gel líquido por 10-15 min.
- Use uma seringa estéril de 3 mL conectada a um tubo capilar de 10 a 15 polegadas de comprimento para retirar o gel líquido. Prossiga imediatamente para as etapas de infusão abaixo.
NOTA: O gel pode ser liquefeito usando diferentes métodos. É essencial seguir as instruções do fabricante.
8. Infusão e incorporação intraluminal de gel
- Manter as artérias fixas canuladas na câmara com PBS a 37 °C.
- Conecte a extremidade distal do tubo capilar preenchido com gel líquido à cânula proximal.
- Para evitar que bolhas de ar passem pelo lúmen durante a infusão do gel, retire a extremidade proximal da artéria da primeira cânula para deixar sair as bolhas de ar e permitir que o gel preencha a cânula.
- Monte a artéria de volta na cânula e infunda suavemente o gel no lúmen da artéria até que ele saia da cânula distal.
- Substitua imediatamente o PBS na câmara por um volume igual de gel líquido para encher a câmara até o nível superior.
- Deixe a câmara com as artérias descansar em RT desconectando a unidade do controlador de temperatura por cerca de 10 min para permitir que o gel solidifique dentro do lúmen, bem como fora do lúmen na câmara. Isso garante que a artéria esteja totalmente incorporada ao gel, preservando sua estrutura tridimensional.
- Usando uma pinça fina, afrouxe as suturas de náilon e retire suavemente as cânulas da câmara.
- Transfira todo o gel solidificado contendo a artéria da câmara para um recipiente cheio de etanol a 70%. O etanol serve como uma solução de retenção para preservar a amostra até o processamento posterior.
NOTA: Uma válvula de três vias pode facilitar a remoção de bolhas de ar antes de infundir o gel. A solidificação do gel pode ser confirmada tocando suavemente o gel na câmara usando uma ponta de pipeta limpa.
9. Histopatologia
- Corte a artéria transversalmente ainda no gel e coloque essas amostras na máquina de processamento de tecidos para processamento de acordo com as instruções do fabricante.
- Posteriormente, incorpore o tecido para fazer um bloco de parafina. Certifique-se de que as amostras estejam incorporadas "on-end" para que as seções transversais fiquem voltadas para baixo no bloco.
- Corte seções axiais com 5 μm de espessura usando um micrótomo. Transfira as seções cortadas para lâminas adesivas.
- Asse as seções a 60 ° C por 1 h, depois desparafine com xileno, seguido de reidratação com lavagens graduadas com álcool.
- Manchar os cortes com hematoxilina e eosina (HE) para histopatologia de rotina e diferenciar em álcool ácido a 1%. Examine as seções sob microscopia de luz usando um microscópio apropriado e obtenha fotografias usando uma câmera compatível.
10. Imuno-histoquímica
- Obtenha a coloração usando um sistema automatizado com o sistema de detecção de refino de polímero de acordo com o protocolo do fabricante.
- Desparafinar as secções de tecido a 72 °C durante 30 s com uma solução desparafinante e, em seguida, reidratar as secções com lavagens graduadas com álcool e solução de lavagem.
- Realize a recuperação de epítopos induzida por calor aquecendo as seções a 100 ° C por 20 min na solução de recuperação de epítopos 1 e aplique um bloco de peróxido por 5 min para extinguir a atividade da peroxidase endógena.
- Aplique anticorpos primários (por exemplo, anti-CD31 ou actina anti-músculo liso) em concentrações apropriadas diluídas em diluente de anticorpo redutor de fundo. Incubar as seções com um polímero de peroxidase de rábano por 8 min e colorir as seções com uma solução de cromogênio por 10 min. Contra-corar as lâminas com hematoxilina por 5 min.
11. Hibridização cromogênica in situ RNAScope
- Realize a coloração usando um sistema automatizado com um kit apropriado e o kit de detecção de vermelho refinado de polímero de acordo com o protocolo do fabricante.
- Cozer as secções durante 30 min a 60 °C e, em seguida, desparafinar as secções durante 30 s numa solução de desparafinagem aquecida a 72 °C.
- Reidrate os tecidos com lavagens absolutas com etanol e solução de lavagem.
- Trate as seções com solução de recuperação de epítopo 2 por 15 min a 95 ° C e incube as seções com uma solução enzimática por 15 min a 40 ° C.
- Hibridize as amostras com as sondas RNAScope apropriadas para os genes-alvo.
- Use uma sonda genética de manutenção de expressão média (por exemplo, peptidilprolil isomerase B) para confirmar a abundância e integridade adequadas de RNA.
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Resultados
Tecidos omentais humanos foram obtidos de pacientes submetidos a cirurgias abdominais clinicamente indicadas. Pequenas artérias de resistência (100-300 μm de diâmetro) foram meticulosamente isoladas dos tecidos adiposo e conjuntivo circundantes sob um microscópio de dissecção (Figura 1A-C). As artérias isoladas foram limpas, canuladas com sucesso e montadas nas cânulas de vidro na câmara do miógrafo de cultura para pressurização (Figura ...
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Discussão
Os avanços em imagens médicas, técnicas cirúrgicas e metodologias de pesquisa melhoraram nossa compreensão da arquitetura vascular 3D, revolucionando o diagnóstico, o planejamento cirúrgico e a pesquisa 17,18,19,20. Apesar dessas inovações, preservar a estrutura 3D de artérias de resistência humanas isoladas continua sendo um desafio devido à sua natureza delic...
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Divulgações
O NIAID GenAI foi usado para gerar um esboço inicial e rascunho do manuscrito, que foi minuciosamente escrito, revisado e editado pelos autores humanos para garantir precisão e coerência.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela Divisão de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, número do projeto AI001150 ao HCA. Agradecemos ao nosso ex-membro do laboratório, Dr. Steven Brooks, bem como aos nossos atuais membros do laboratório, Mohamed Ibrahim, Mary Jackson e Jian Wu da Seção de Genômica Funcional da Malária, por sua assistência na captura de imagens durante o processo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Álcool Ácido Focado 1% | StatLab | SL89-1 | |
| 10% NBS | Leica Biosystems | 3800598 | |
| Câmera HDMI em Microscopia 4K | Hitech Instruments, Inc. | HT-XP4K8MA | |
| Diluente de Anticorpos - Redução de Fundo | Dako | S3022 | |
| Processador Automatizado de Tecidos & nbsp; | Leica Biosystems | HistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005 | |
| Solução de Dewax de Bond | Leica Biosystems | AR9222 | |
| Solução de Recuperação de Epítopos de Ligação 1 | Leica Biosystems | AR9961 | |
| Solução de Recuperação de Epítopos de Ligação 2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| Detecção de Refinamento de Polímeros de Ligação | Leica Biosystems | DS9800 | |
| Detecção de Vermelho Refinado de Polímero de Ligação | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Solução de Lavagem de Ligação (10x) | Leica Biosystems | AR9590 | |
| Pacote de cânulas (vidro), 80 e traço; 100 & mu; m | DMT | Código do Produto: 300407 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Pratos de dissecação, grandes (vidro pyrex), 93 mm | Instrumentação de Sistemas Vivos | SKU: DD-90 | |
| Pratos de Dissecação, Pequenos | Instrumentação de Sistemas Vivos | SKU: DD-50 | |
| Microscópio de Dissecação | Hitech Instruments, Inc. | ZEISS SteREO Discovery.V8 | |
| Pinça Dumont #5 | Ferramentas Científicas Finas | Item nº 11295-10 | |
| Dumont #5SF Pinças | Ferramentas Científicas Finas | Item nº 11252-00 | |
| EcoMount | BioCare Medical | EM897L | |
| Eosina | IHC World | IW-3100B | |
| Hematoxilina | BioCare Medical | Cathe-MM | |
| Câmera de Iamging | Olyumpus | DP28 | |
| Microscópio de Imagem | Olyumpus | BX51 | |
| Buffer Krebs Henseleit (com 2 mM de Cloreto de Cálcio) | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-10625N-200mL | |
| Buffer de Krebs-Henseleit (sem cálcio) | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-9906W-200mL | |
| Mídia de Montagem | ThermoFisher Scientific | 4111 | |
| Câmara e Unidade de Miógrafo | DMT | 202/204CM | |
| PBS (soro salino tamponado com fosfato) | Thermofisher Scientific | 10010023 | |
| PPIB | ACDBio | 313908 | |
| Kit de Reagente RNAscope 2.5 LS-RED | ACDBio | 322150 | |
| Stainer | Leica | Sistema automatizado Leica Bond RX | |
| Pinos de dissecação em aço inoxidável | Instrumentação de Sistemas Vivos | SKU: PIN-0,1MM | PIN-0,2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1 | |
| Paraplastos Surgipath | Leica Biosystems | 39601006 | |
| Gel de proteção de tecido | StatLab | TissueGuard/SKU: TG12 | |
| Tesoura de mola Vannas - Corte de 2 mm | Ferramentas Científicas Finas | Item nº 15000-03 | |
| Tesoura de mola Vannas - Corte de 2,5 mm | Ferramentas Científicas Finas | Item nº 15000-08 | |
| Tesoura de mola Vannas - Borda de corte 3 mm | Ferramentas Científicas Finas | Item nº 15000-00 | |
| α-SMA | Abcam | ab5694 |
Referências
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Reimpressões e permissões
