Injeção guiada por ecocardiografia para entrega de células-tronco intramiocárdicas direcionadas e confiáveis em um modelo de infarto do miocárdio em ratos

Resumo

Este artigo detalha um protocolo otimizado para injeções intramiocárdicas guiadas por ecocardiografia em modelos de infarto do miocárdio em ratos usando uma agulha de 29 G x 88 mm. Essa técnica garante a administração robusta, precisa e reprodutível de agentes terapêuticos diretamente na zona peri-infarto.

Resumo

A injeção intramiocárdica guiada por ecocardiografia (EGI) é uma técnica minimamente invasiva para administrar terapias com células-tronco em modelos pré-clínicos de infarto do miocárdio (IM). Em comparação com as abordagens tradicionais de peito aberto, a EGI oferece melhor traduzibilidade clínica, redução da invasividade e minimização do impacto fisiológico no animal. Embora a EGI esteja bem estabelecida em modelos murinos, sua aplicação em ratos permanece limitada devido a desafios anatômicos e técnicos. Em particular, o afinamento da parede anterior do ventrículo esquerdo (VCVE) nas regiões infartadas e peri-infarto complica a administração miocárdica segura e precisa, pois a espessura da parede pode cair abaixo do tamanho do bisel da agulha das agulhas 27 G ou 28 G comumente usadas, aumentando o risco de perfuração ventricular ou falha na entrega. Para resolver essa limitação, otimizamos um protocolo para EGI em modelos de IM de ratos usando agulhas Spinocan 29 G. A agulha de menor diâmetro e mais longa permite o direcionamento preciso do tecido miocárdico fino, minimizando os danos e aumentando a precisão da injeção, independentemente da espessura da VCVE. Essa técnica é compatível com as plataformas de ecocardiografia transtorácica padrão e elimina a necessidade de toracotomia, permitindo estudos longitudinais no mesmo animal. Nosso método refinado permite a entrega robusta e reprodutível de agentes terapêuticos no miocárdio viável adjacente à zona do infarto, onde as terapias regenerativas são mais eficazes. Ao melhorar a segurança e a precisão do direcionamento, essa abordagem aumenta a relevância translacional da pesquisa cardíaca pré-clínica e apóia o desenvolvimento de protocolos padronizados em todos os laboratórios.

Introdução

As doenças cardiovasculares continuam sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, sendo o infarto do miocárdio (IM) um contribuinte significativo para condições cardíacas agudas e crônicas¹. Apesar dos avanços no manejo farmacológico e intervencionista, a capacidade regenerativa do coração humano adulto é limitada, muitas vezes resultando em remodelamento adverso e progressão para insuficiência cardíaca ^2,3. Consequentemente, as terapias baseadas em células-tronco ganharam atenção como estratégias potenciais para reparar o miocárdio danificado, preservar a função cardíaca e melhorar os resultados clínicos⁴.

Modelos pré-clínicos robustos são essenciais para avaliar a segurança, eficácia e estratégias de entrega dessas terapias. Entre os modelos de pequenos animais, os ratos oferecem várias vantagens, incluindo tamanho de coração gerenciável, técnicas de infarto bem caracterizadas e respostas de remodelação cardíaca translacionalmente relevantes⁵. Convencionalmente, a administração intramiocárdica de células-tronco em modelos de IM de ratos é realizada por toracotomia, permitindo a visualização direta do local da injeção⁶. No entanto, essa abordagem é invasiva, introduz riscos processuais significativos e impede intervenções repetidas em estudos longitudinais. Além disso, carece de alinhamento com as modalidades de administração clínica, como cateter ou injeção percutânea⁷.

A injeção intramiocárdica guiada por ecocardiografia (EGI) é uma alternativa minimamente invasiva que permite a administração direcionada de agentes terapêuticos sob orientação de imagem em tempo real. Embora bem estabelecido em modelos murinos, o uso de EGI em modelos de ratos tem sido limitado. A EGI é mais amplamente desenvolvida em camundongos do que em ratos, principalmente porque a maioria das pesquisas cardiovasculares historicamente se concentrou em camundongos como o modelo pré-clínico dominante⁸. Além disso, o tamanho menor e a anatomia do coração dos camundongos permitiram a otimização dos procedimentos guiados por ultrassom⁹. Em contraste, os ratos têm uma parede torácica mais espessa e maior movimento respiratório, dificultando imagens estáveis e de alta resolução durante os procedimentos¹⁰.

Os avanços na tecnologia de ultrassom de alta frequência tornaram viável a EGI em ratos, aumentando a relevância clínica de seu uso. No entanto, o afinamento da parede anterior do ventrículo esquerdo (VCVE) em regiões infartadas continua sendo um grande desafio para a EGI em roedores. Em ratos, a espessura da parede geralmente diminui para menos de 1 mm, enquanto as agulhas padrão de 27 G ou 28 G têm comprimentos de chanfro de 1,25-1,5 mm, aumentando o risco de perfuração ventricular ou entrega celular mal direcionada. Para resolver essa limitação, refinamos a técnica EGI em ratos utilizando agulhas Spinocan de 29 G x 88 mm. Essas agulhas apresentam um comprimento de chanfro de 1 mm, permitindo a entrega precisa e atraumática de células no miocárdio afinado das regiões do infarto e peri-infarto. O procedimento é realizado por meio de ecocardiografia transtorácica de alta resolução, permitindo a visualização de pontos anatômicos e trajetória da agulha em tempo real.

Este protocolo EGI refinado fornece um método minimamente invasivo e reprodutível para a administração direcionada de agentes terapêuticos no miocárdio peri-infarto em modelos de ratos de infarto agudo do miocárdio agudo e crônico, independentemente da espessura da VCVE. Facilita a injeção em zonas de fronteira viáveis - locais críticos para alcançar benefícios terapêuticos - enquanto reduz significativamente a carga cirúrgica e o tempo de recuperação em comparação com as abordagens de tórax aberto. Além disso, suporta estudos longitudinais envolvendo injeções repetidas e imagens de acompanhamento, reduzindo assim o número de animais de acordo com o princípio 3Rs (Substituição, Redução, Refinamento)¹¹. O protocolo é adaptável para a entrega de agentes farmacológicos, terapias genéticas, biomateriais e vários tipos de células-tronco. Ao padronizar a EGI em modelos de ratos e alinhar-se com as modalidades de entrega clínica, essa abordagem aumenta a reprodutibilidade entre os laboratórios e fortalece a relevância translacional da pesquisa cardíaca pré-clínica.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Local da UHasselt (Comissão de Ética para Experimentação Animal, UHasselt, Diepenbeek, Bélgica, ID202308 e ID202497) e conduzidos de acordo com a Diretiva da UE 2010/63/UE.

1. Configuração do equipamento

1. Ligue a plataforma de imagem de ultrassom, a plataforma aquecida integrada, a unidade de monitoramento de fisiologia e o aquecedor de gel.
   NOTA: Para permitir uma visualização clara e suficientemente detalhada da parede anterior do ventrículo esquerdo durante o procedimento de IGI, recomenda-se um sistema de ultrassom de alta frequência equipado com um transdutor de matriz linear de ≥ 15 MHz que forneça resolução axial de aproximadamente 75 μm.
2. Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato durante a depilação do peito.
3. Selecione o transdutor apropriado e inicialize o motor 3D para garantir a amplitude total de movimento do transdutor.
   NOTA: Além de utilizar o micromanipulador do sistema de corrimão da plataforma do animal, o motor 3D permite ajustes de transdutor altamente precisos, o que pode facilitar o alinhamento com a agulha de injeção quando necessário. Se necessário, o procedimento também pode ser realizado sem o motor 3D.
4. Garanta o alinhamento adequado do sistema antes de fazer a imagem. Coloque o micromanipulador de parafusos que controla a plataforma animal em uma posição neutra (ou seja, centralizada em toda a amplitude de movimento). Centralize a própria plataforma animal no meio do sistema de corrimão. Posicione o sistema de montagem do transdutor de forma que o transdutor fique alinhado diretamente acima do centro da plataforma animal.

2. Preparação e anestesia do animal

1. Pese o rato e calcule o volume necessário de buprenorfina (0,04 mg / kg) para administrar para alívio da dor.
2. Coloque o rato em uma câmara de indução conectada a uma máquina de anestesia. Induzir anestesia com isoflurano a 2,5% suplementado com oxigênio a uma taxa de fluxo de 2 L/min.
3. Uma vez que a anestesia é induzida, transfira o rato para uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37 0,5 ° C. Mantenha a anestesia adequada posicionando o focinho do rato em um cone nasal conectado ao sistema de anestesia, fornecendo um fluxo constante de 1-3% de isoflurano suplementado com 1-1,5 L/min de oxigênio, ajustado conforme necessário para garantir uma sedação adequada.
4. Raspe o peito do rato e remova os pelos residuais com creme depilatório. Após a depilação, desinfete o local da injeção alternando um agente de esfoliação cirúrgica apropriado (por exemplo, iodopovidona) com etanol a 70%, repetido 3x. Aplique gel oftálmico em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
5. Administre a dose pré-calculada de buprenorfina por via intramuscular na perna traseira para minimizar o desconforto relacionado ao EGI.
6. Transfira o rato da almofada de aquecimento para a plataforma animal do sistema de imagem de ultrassom. Garanta a administração consistente da anestesia através do cone nasal integrado da plataforma, mantendo um fluxo constante de 1-3% de isoflurano em oxigênio 1-1,5 L/min. Prenda as patas do rato nos eletrodos da plataforma, aplicando uma pequena quantidade de gel de eletrodo para garantir a qualidade ideal do sinal. Insira a sonda de temperatura retal para monitoramento contínuo da temperatura corporal.
   NOTA: O monitoramento contínuo dos parâmetros fisiológicos é essencial durante os procedimentos de imagem e injeção. A frequência cardíaca (FC), a frequência respiratória (FR) e a temperatura corporal do rato devem permanecer dentro dos intervalos aceitáveis para evitar complicações relacionadas à anestesia. Como orientação geral, a FC deve estar na faixa de 250-400 bpm, enquanto a FR deve ser de pelo menos 30 respirações por minuto. Se a FC ou RR caírem abaixo desses limites, diminua imediatamente a concentração de isoflurano (por exemplo, de 2-3% para 1-2%) e verifique se o animal permanece posicionado corretamente e não fica hipotérmico. Os ajustes devem ser feitos gradualmente, com monitoramento rigoroso até que os parâmetros retornem aos níveis desejados.
7. Nesta fase, adquira todas as imagens de linha de base ou pré-injeção desejadas. Em geral, as imagens paraesternais de eixo longo (PSLAX) e de eixo curto (SAX) nos modos B e M, juntamente com imagens de quatro câmaras, são recomendadas para avaliação funcional e anatômica basal.
   NOTA: A imagem geral pode ser realizada com o sistema configurado conforme mostrado na Figura 1A. Para o procedimento de injeção, a plataforma animal precisará ser reposicionada e o transdutor ajustado de acordo. Embora a imagem PSLAX em modo B seja usada para orientação durante a injeção, essas imagens podem não ser ideais para análises funcionais post-hoc devido à necessidade de alinhamento preciso da agulha.

3. Procedimento de injeção intramiocárdica guiada por ecocardiografia

NOTA: A partir deste ponto, são necessários dois operadores para realizar a injeção com sucesso. O operador A é responsável por manipular a plataforma do animal e monitorar a imagem da ecocardiografia ao vivo, enquanto o operador B deve se posicionar atrás do suporte de injeção para alinhar com precisão a agulha e o transdutor.

1. Prepare o sistema de injeção ligando uma agulha guia de 22 G a uma seringa de 1 ml. Coloque a seringa com a agulha guia no suporte de injeção e prenda a braçadeira de injeção.
   NOTA: A agulha de 29 G x 88 mm é muito flexível para perfurar diretamente as camadas da pele e dos músculos; A agulha guia é necessária para facilitar a injeção.
2. Alinhe o transdutor com o suporte de injeção para garantir que a agulha possa ser visualizada. Ajuste a posição do transdutor usando o suporte do transdutor e a braçadeira de retenção e, se necessário, gire o suporte de injeção ao longo de seu trilho para obter o alinhamento apropriado.
3. Sem mover o rato, gire a plataforma do animal de modo que o entalhe do transdutor aponte para o ombro direito do rato (Figura 1B-D). Essa configuração permite a aquisição de uma imagem clara do modo B do PSLAX do ventrículo esquerdo. Verifique se a agulha guia permanece dentro do campo de movimento do transdutor. Se estiver desalinhado, ajuste a posição do transdutor por meio do sistema do motor 3D em vez de alterar o suporte de injeção.
4. Uma vez que o alinhamento correto da agulha-transdutor seja alcançado, ajuste a imagem usando os parafusos do micromanipulador do trilho da plataforma animal. Mantenha a posição do transdutor para preservar o alinhamento com a agulha. Rotação ou translação adicional da plataforma animal pode ser necessária para otimizar a qualidade da imagem.
5. Visualize a área infartada. Avalie a extensão do infarto, o movimento regional da parede e o afinamento da parede, usando imagens PSLAX modo B e modo M para avaliar a viabilidade do local da injeção. Aplique uma abordagem de pontuação de contratilidade da parede de 16 segmentos para identificar regiões acinéticas ou gravemente hipocinéticas, que representam o núcleo do infarto.
6. Identifique a zona peri-infarto e selecione o local alvo da injeção. Escolha uma área hipocinética adjacente ao núcleo do infarto com uma espessura de parede diastólica final superior a 1 mm, o que permite a inserção completa do bisel da agulha de 29 G em um ângulo raso.
7. Usando o sistema de trilhos, avance o suporte de injeção em direção à plataforma do animal. Alinhe a agulha com o meio exato do transdutor usando os parafusos do micromanipulador no suporte de injeção.
   NOTA: O alinhamento preciso é fundamental. Se a agulha não estiver centralizada no transdutor, ela não será visível durante a injeção.
8. Avance a agulha guia usando o parafuso do micromanipulador de injeção no suporte de injeção até que a pele seja perfurada. Confirme se a ponta da agulha está visível na imagem de ultrassom. Se a agulha não estiver visível, retraia a agulha cuidadosamente usando o parafuso do micromanipulador 'injetar' e repita a etapa 3.7 para realinhar.
9. Ative o recurso de guia da agulha no software de ultrassom para confirmar a trajetória da agulha. Avance a agulha guia em direção à região alvo pré-determinada, posicionando o chanfro da agulha a aproximadamente 1-2 mm da parede anterior do ventrículo esquerdo (VCVE) (Figura 2A).
   NOTA: Evite perfurar o miocárdio com a agulha guia para evitar sangramento excessivo ou lesão cardíaca.
10. Uma vez posicionada a agulha, faça com que o operador A estabilize firmemente a agulha-guia em sua base, garantindo a visualização constante da agulha na tela do ultrassom. Simultaneamente, peça ao operador B para soltar o clamp que prende a seringa, remova a seringa e prepare a seringa injetada. Instrua o operador A a manter a agulha guia estacionária.
11. Encaixe a agulha de 29 G x 88 mm na seringa que contém o injetado (Operador B) e prenda a seringa no suporte de injeção. Guie manualmente a agulha de 29 G x 88 mm através da agulha guia estacionária, fazendo pequenos ajustes com os parafusos do micromanipulador no plano do eixo x (esquerda ou direita da sonda), se necessário. Avance manualmente até que o bisel da agulha se torne visível na cavidade torácica no ultrassom.
    NOTA: Devido à flexibilidade da agulha de 29 G, ela pode dobrar durante a inserção na cavidade torácica. Para minimizar isso, o operador A pode estabilizar a parte externa da haste da agulha enquanto o operador B avança a agulha para dentro da cavidade torácica.
12. Assim que a agulha de 29 G x 88 mm passar pela agulha guia e se tornar visível no ultrassom, avance-a para o miocárdio da VCVE usando os parafusos do micromanipulador para maior precisão e segurança. Confirme se o bisel da agulha está localizado inteiramente dentro do miocárdio (Figura 2B).
    NOTA: Devido ao chanfro relativamente longo da agulha de 29 G em comparação com a espessura da parede do miocárdio, é fundamental garantir que todo o chanfro esteja embutido no miocárdio. Use a função 'Congelar imagem' para verificar o posicionamento, se necessário. Embora a calibração da profundidade do ultrassom possa ajudar na precisão, neste protocolo, verificamos a profundidade selecionando locais de injeção com espessura de parede diastólica final >1 mm e confirmando visualmente a ponta da agulha se aproximando - mas não rompendo - da borda endocárdica (Figura 2B).
13. Injete o injetado lentamente no miocárdio (Operador B). O sucesso da injeção intramiocárdica é confirmado visualmente por um ponto ecogênico brilhante/denso no local da injeção, que deve se mover em sincronia com a VCVE (Figura 2C). Para minimizar o refluxo do injetado, aguarde aproximadamente 10 s após completar a injeção antes de retrair a agulha.
14. Primeiro, remova a seringa com as agulhas do suporte de injeção para minimizar o risco de ferimentos por picada de agulha. Em seguida, remova cuidadosamente o rato da plataforma animal e deixe-o se recuperar em uma almofada de aquecimento. Monitore os parâmetros vitais continuamente até a recuperação total da anestesia.

Resultados

Validação da precisão da injeção por imagem de bioluminescência in e ex vivo (BLI)
Para avaliar o sucesso e a eficiência do EGI, as células-tronco foram primeiro transduzidas para expressar a luciferase do vaga-lume (Fluc) por meio de um vetor lentiviral, permitindo o rastreamento in vivo por imagem de bioluminescência (BLI). O BLI confirmou a entrega intramiocárdica precisa...

Discussão

À medida que avançam as pesquisas pré-clínicas com foco em terapias regenerativas para restaurar o coração após infartos do miocárdio, permanecem os obstáculos em relação à administração ideal de agentes terapêuticos¹². As técnicas minimamente invasivas de EGI são cada vez mais favorecidas em relação às abordagens de tórax aberto porque imitam melhor o parto clínico percutâneo, melhoram o bem-estar animal e permitem administrações repetidas em estudos longitudinai...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
21? Transdutor MX250 MHz	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Transdutor de ultrassom de alta frequência compatível com o sistema Vevo 3100
Fita Cirúrgica Transpore 3M	3M	1527	Para prender as patas do animal à plataforma do animal
Aquasônico  100 Gel de Transmissão de Ultrassom	Parker Laboratories BV	01-08	Garante o acoplamento acústico adequado entre o transdutor e a pele do animal para uma qualidade de imagem ideal
Bupaq 0,3 mg/ml solução injetável para cães e gatos	Richter Pharma AG	57446/4008	Analgésico opioide (buprenorfina) administrado para o controle da dor
ISOFLUTEK  1000	Alivira	/	Anestésico inalatório à base de isoflurano
Aquecedor de gel multifrasco 230 V	Parker Laboratories BV	83-03-20 CE (LCD)	Aquece o gel de ultrassom à temperatura corporal para evitar hipotermia ou desconforto animal
Gel de eletrodo Signagel	Parker Laboratories BV	15-25	Aplicado a eletrodos de ECG para melhorar a condução do sinal para monitoramento fisiológico
SPINOCAN 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	Agulha de calibre fino para injeção intramiocárdica precisa
Seringa Terumo de 3 partes com agulha hipodérmica pré-conectada	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	Usado para montar e prender a agulha guia de 22 G e a agulha de injeção de 29 G para entrega controlada no miocárdio.
Unidade de Monitoramento Fisiológico THM150	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Monitora sinais vitais como frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura corporal do animal durante o procedimento
Veet Minima Puro	Reckitt Benckiser	/	Creme depilatório
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Sistema de ultrassom de alta resolução
Carbomerum vidísico 980 2mg/g gel oftálmico	Bausch + Lomb	/	Aplicado nos olhos do animal anestesiado para evitar o ressecamento da córnea