Aqui, apresentamos um protocolo para uma técnica otimizada de coleta de sangue em indivíduos murinos por meio de punção venosa venosa da veia facial usando uma lanceta. Usamos essa técnica juntamente com a avaliação por citometria de fluxo para caracterizar fenótipos celulares de cepas transgênicas, congênitas e repórteres. Também é adequado para análise de citocinas séricas e estudos de diabetes.
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Artigo de método
Punção venosa da veia facial para coleta de sangue murino
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Resumo
Resumo
Este artigo apresenta um protocolo otimizado para coleta de sangue murino por punção venosa da veia facial usando uma lanceta, oferecendo uma alternativa rápida, minimamente invasiva e econômica a outras técnicas comuns, como amostragem da veia da cauda e retro-orbital. Essa técnica é particularmente vantajosa para estudos que exigem amostragem repetida, como fenotipagem de camundongos, análise de citocinas séricas e pesquisa de diabetes. O protocolo é eficiente, requer equipamento especializado mínimo e é adequado para análise celular de alto rendimento em camundongos. Nossa principal aplicação é a fenotipagem de camundongos transgênicos, congênicos e repórteres usando citometria de fluxo, demonstrada aqui com coloração de anticorpos e camundongos repórter tdTomato. O artigo descreve o procedimento completo, desde a preparação do animal até a análise da amostra. As principais etapas incluem coleta de sangue com lanceta de 3 mm, lise celular, coloração e perfil citométrico de fluxo. A punção venosa da veia facial aumenta a eficiência da coleta enquanto apoia práticas éticas de pesquisa. Este método prático e adaptável é adequado para uma ampla gama de protocolos experimentais envolvendo amostragem de sangue murino e análise celular.
Introdução
A coleta de sangue eficiente, reprodutível e minimamente invasiva é essencial para muitos estudos murinos, particularmente aqueles que requerem amostragem repetida. Este protocolo fornece um método simplificado para coletar pequenos volumes de sangue usando punção venosa da veia facial, seguido de lise de glóbulos vermelhos, coloração de anticorpos e análise de citometria de fluxo. Esse fluxo de trabalho é adequado para aplicações de alto rendimento, minimizando as complexidades técnicas.
Muitos métodos de coleta de sangue, como sangramento retro-orbital ou incisão da veia caudal, podem exigir procedimentos envolvendo calor, anestesia1 e tempos de manuseio prolongados, o que pode causar sofrimento significativo ao animal2. Em contraste, a punção venosa da veia facial com uma lanceta oferece uma alternativa simples e rápida que suporta um design experimental ético e reprodutível. Este método foi validado em estudos anteriores como uma alternativa humana para amostragem de sangue de pequeno volume em camundongos3.
Ilustramos esse método fenotipando células imunes de camundongos transgênicos e repórteres, incluindo camundongos repórter TdTomato e camundongos MD4-IgHEL. Este último requer coloração com anticorpos contra CD19 e IgMa, um alótipo IgM.
Embora esse protocolo seja desenvolvido para o perfil celular do sangue, ele pode ser facilmente adaptado para outros usos, incluindo análise de citocinas séricas, detecção de anticorpos específicos ou medições de glicose, omitindo a etapa de lise dos glóbulos vermelhos. No geral, essa técnica melhora a qualidade dos dados e a eficiência experimental, ao mesmo tempo em que causa sofrimento animal mínimo, tornando-a amplamente útil em diversas aplicações de pesquisa.
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Protocolo
Os camundongos foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos no Dartmouth Hitchcock Medical College, uma instituição credenciada pela AAALAC, e usados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Utilização de Animais.
1. Recolha de materiais
- Prepare 5 mL de tubos de cultura, cada um contendo 1,5 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (10X RBC Lysis diluído com água estéril). Use um tubo por mouse.
- Reúna uma caixa de lancetas de 3 mm (uma lanceta por mouse).
- Reúna uma caixa de esponjas de gaze (uma esponja de gaze por mouse).
- Reúna as pipetas de transferência e um tubo cônico de 50 mL contendo 1x HBSS com 0.5 mM EDTA (suficiente para até 20 camundongos).
NOTA: Este tampão é usado para interromper a reação de lise. Se o tampão for necessário apenas para fenotipagem e não para análise posterior a jusante, a maioria dos tampões neutros com pH 7,2-7,4 pode ser usada no lugar do HBSS. - Traga um balde de gelo, 1x tampão de lise de hemácias adicional, tubos extras de 5 mL e pipetas de transferência.
2. Rotulagem de mouse e tubo
- Rotule cada cartão de gaiola e mouse com um identificador de fenótipo que corresponda aos rótulos em cada tubo para ajudar a distinguir quais resultados se correlacionam com qual mouse. Os identificadores comumente usados incluem diferentes cores de marcadores permanentes (por exemplo, vermelho, azul, verde, preto) nas caudas dos camundongos, que correspondem às marcações no tubo.
NOTA: Sempre inclua um mouse de controle para fenotipagem. Para camundongos repórteres, certifique-se de ter um controle repórter negativo. Para camundongos transgênicos, inclua um camundongo do tipo selvagem como controle. - Disponha os tubos rotulados em um rack com um balde de gelo próximo para armazenar os tubos imediatamente após a coleta de sangue.
- Abra todas as lancetas necessárias para o procedimento.
- Abra todas as esponjas de gaze necessárias para o procedimento.
3. Manuseio de camundongos e coleta de amostras
- Use a mão dominante para segurar o mouse pela cauda e coloque-o em uma prateleira de alimentação de arame ou em qualquer superfície plana.
- Use o dedo indicador e o polegar não dominantes para desalinhar o mouse manobrando da cauda em direção à região cervical.
- Use os dedos restantes para prender a cauda, minimizando o movimento do mouse.
- Use a mão dominante para recuperar uma lanceta aberta de 3 mm.
- Localize o pequeno ponto sem pelos logo após a boca e trace uma linha reta em direção à orelha. Pare onde a linha se cruza com o canto externo do olho (Figura 1).
- Insira a lanceta nesta interseção para garantir um amplo suprimento de sangue.
- Use a borda lateral plana da lanceta para coletar uma única gota de sangue.
- Deposite toda a lanceta, com a amostra de sangue, no tubo marcado contendo o tampão de lise de hemácias.
- Agite suavemente o tubo para garantir que toda a amostra seja misturada ao tampão. A mistura incompleta pode causar coagulação e baixa qualidade dos dados.
- Use uma esponja de gaze para aplicar uma leve pressão no local da punção por 5 a 10 s.
- Retorne o mouse para sua gaiola.
- Mantenha uma proporção de tampão sangue/lise maior que 1:10.
- Repita as etapas nesta seção para cada mouse adicional.
4. Lise, preparação e análise da amostra
- Aguarde 7 a 10 minutos após o início da lise, adicione aproximadamente 2 mL de 1x HBSS com 0,5 mM EDTA (ou outro meio).
- Tubos de centrífuga a 400 g por 5 min. Prepare coquetéis de anticorpos durante esse período.
- Descarte o sobrenadante.
- Remova as lancetas dos tubos usando uma pinça.
- Adicione 30 μL de um coquetel de anticorpos projetado para identificar as populações celulares desejadas.
NOTA: Para fenotipar camundongos MD4 IgHEL, nosso coquetel consistiu em 1 mL de HBSS, 25 μL de IgMa PerCP cy-5.5 e 25 μL de CD19 APC. - Ressuspenda as células por vórtice por 2-3 s e incube por 25-30 min a 4 ° C.
- Ligue o citômetro de fluxo e configure os gráficos de fluxo de acordo com as necessidades do experimento.
NOTA: Não há necessidade de girar as células após a coloração se o objetivo for a fenotipagem. - Adicione 150-25 μL de HBSS ou outro meio a cada amostra usando uma pipeta de transferência. Se necessário, o DAPI pode ser adicionado a uma concentração final de 1. μg/mL (use 10 μL de meio contendo DAPI).
- Vórtice cada amostra por 2-3 s imediatamente antes da aquisição.
- Adquira dados de 8.000 a 10.000 eventos/s, visando 100.000 células se a lise for eficaz.
- Analise os dados adquiridos, ilustrados na Figura 2 e na Figura 3.
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Resultados
Usando citometria de fluxo, a Figura 2 mostra o sangue lisado de camundongos repórteres do tipo selvagem (WT) e PF4-Cre TdTomato, preparado usando o protocolo descrito acima. O primeiro conjunto de gráficos de fluxo exibe a dispersão lateral (SSC), que reflete a granularidade da célula, versus a dispersão direta (FSC), que indica o tamanho da célula. Detritos celulares e plaquetas são observados perto da origem dos eixos, enq...
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Discussão
Este protocolo otimizado de coleta de sangue das veias faciais fornece uma alternativa eficiente e simples a outros métodos comumente usados, como veia da cauda ou sangramento retro-orbital. Embora o protocolo seja simples e direto, algumas etapas críticas devem ser seguidas cuidadosamente. O passo mais importante para executar corretamente é a colocação correta do local da punção4. Direcionar o local apropriado na bochecha garante fluxo sanguíneo suficiente com o...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant: R35 HL155458 (CVJ)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-camundongo APC CD19 | Biolenda | 152410 | CD19 APC |
| Centrífuga 5810 R, sem rotor, 120 V, 50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | Centrífuga |
| Esponjas de gaze Dermacea 8 camadas 2" x 2" | Covidien | 441211 | Ganzo-de-Gangue |
| Pipetas Descartáveis de Transferência Graduada | Fisherbrand | 13-711-91am | Pipeta de transferência |
| ErgoOne Single Channel Pipette (200 & micro; L) | USA Scientific | 7100-2200 | Pipeta |
| Etilenediamina Ácido Tetraacético (Solução de 0,5 M/pH 8,0) | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| Analisador de Células FACSymphony A3 | BD em Biociências | 660937 | Citômetro de Fluxo |
| Fisherbrand Misturador de Vórtice Analógico | Fisherbrand | 02-215-414 | Vórtice |
| Goldenrod Animal Lancet 3 mm Estériles 5 bandejas de 200 | Vara de ouro | GR 3MM | Lancet 3 mm |
| Pinça Graefe | Ferramentas Científicas Finas | 11051-10 | Pinças |
| Hank' s Solução Salal Balanceada, 1X sem cálcio e magnésio | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cianano5.5 anti-camundongo IgMa Anticorpo | Biolenda | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| Buffer de Lise de RBC (10x) | Biolenda | 420301 | Buffer de Lise de Glóbulos Vermelhos |
| Tubos de ensaio de poliestireno de fundo arredondado sem tampa | Fisherbrand | FB1496110 | Tubos de cultura |
| Marcadores permanentes com marcador permanente, ponta de formão | Caneta marcador | 38254PP | Marcadores marcadores |
| Testado para USP Água Estéril | Corning | 25-055-CI | Água de Grau Celular |
| Recargas de Ponta de Pipeta TipOne (200 & micro; L Biselado natural) | USA Scientific | 1111-1730 | Pontas de pipeta |
Referências
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
- Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
- Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
- Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
- Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
- Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
- Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
- Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).
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Reimpressões e permissões
