Artigo de método

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo descreve um método para experimentos de alto rendimento usando uma matriz de LED impressa em 3D para otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As ferramentas de expressão gênica induzível podem abrir novas aplicações em saúde humana e biotecnologia, mas as opções atuais costumam ser caras, difíceis de reverter e têm efeitos indesejáveis fora do alvo. Os sistemas optogenéticos usam proteínas responsivas à luz para controlar a atividade dos reguladores, de modo que a expressão seja controlada com o "toque de um botão". Este estudo otimiza um sistema simplificado de efetor CRISPR ativado por luz (2pLACE), que fornece controle ajustável, reversível e preciso da expressão gênica de mamíferos. O OptoPlate-96 permite a triagem de alto rendimento por meio de citometria de fluxo para análise de célula única e otimização rápida de 2pLACE. Este estudo demonstra como usar o sistema 2pLACE com o OptoPlate-96 em células HEK293T para identificar as proporções ideais de componentes para maximizar a faixa dinâmica e encontrar a curva de resposta da intensidade da luz azul. Fluxos de trabalho semelhantes podem ser desenvolvidos para outras células de mamíferos e para outros sistemas optogenéticos e comprimentos de onda de luz. Esses avanços aumentam a precisão, escalabilidade e adaptabilidade das ferramentas optogenéticas para aplicações de biofabricação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ferramentas de biologia sintética, como sistemas de expressão gênica induzíveis, forneceram contribuições significativas para a pesquisa biológica. Sua capacidade de regular a expressão gênica de maneira ajustável, reversível e precisa pode melhorar o controle da produção de proteínas 1,2,3,4,5,6, morfologia celular 7,8,9,10,11,12, vias metabólicas 13,14,15,16,17,18 e outros alvos para biofabricação e aplicações terapêuticas. Os sistemas químicos induzíveis podem ter efeitos residuais19,20 ou fora do alvo. Os aditivos químicos também podem ser muito caros e difíceis de escalar industrialmente devido a processos adicionais de purificação a jusante 21,22,23. Os sistemas de expressão gênica induzíveis por luz podem oferecer um método escalável e preciso para práticas de biofabricação 24,25,26,27.

Muitos sistemas de expressão gênica induzíveis por luz foram desenvolvidos como ferramentas úteis de biologia sintética em uma variedade de aplicações 28,29,30,31,32,33,34,35,36 e comprimentos de onda de azul 35,37,38, vermelho/vermelho distante 12,39,40, ou luz verde41. No caso da regulação gênica optogenética baseada em CRISPR, modificar a quantidade de RNAs-guia individuais (gRNAs) entregues pode afetar a expressão de mRNA de genes endógenos42 e precisará ser otimizada para diferentes linhagens celulares. Proteínas de transativação como VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544, ou fusões delas 47 também podem ser usadas, aumentando a modularidade dos sistemas optogenéticos. A fim de investigar vias biológicas complexas e entrelaçadas 12,40,48,49,50,51,52,53, diferentes combinações desses componentes conhecidos podem ser testadas. Além disso, diferentes linhagens celulares podem apresentar diferenças na indução com o mesmo sistema52. Diferentes níveis de indução podem levar a uma expressão gênica insuficiente ou sensibilidade no controle preciso da expressão gênica, exigindo testes rigorosos para encontrar um sistema optogenético ideal em linhagens celulares novas ou biologicamente mais relevantes. Com um ritmo crescente e uma aplicabilidade cada vez maior da regulação gênica optogenética, é imperativo caracterizar rapidamente esses diferentes sistemas.

Os métodos atuais na caracterização de ferramentas optogenéticas usam expressão estável ou transitória de genes 12,54. Gerar linhagens celulares que expressam de forma estável e otimizar a dinâmica do sistema para expressão máxima pode ser demorado e, portanto, caro. A expressão transitória permite insights rápidos e valiosos, especialmente ao testar sistemas optogenéticos multicomponentes. Aqui, usamos o sistema efetor CRISPR-dCas9 ativado por luz azul (LACE)37, composto por criptocromo 2 (CRY2) e terminal N-terminal de hélice básica de interação com criptocromo (CIBN). Tem sido usado para controlar a expressão gênica em células de mamíferos, como HEK293T (células renais embrionárias humanas) 37 , 38 , CHO-DG44 (células de ovário de hamster chinês) 55 e C2C12 (células de mioblastos de camundongo) 38 . Sua natureza modular é ideal para caracterizar rapidamente o desempenho do sistema por meio de métodos de expressão transitória e alto rendimento. Por exemplo, sistemas multicomponentes como o LACE podem precisar de otimização das proporções de massa para melhorar a indução, uma etapa normalmente não empregada na caracterização de sistemas optogenéticos.

Este protocolo detalha a rápida otimização e caracterização de dois sistemas de plasmídeo LACE (2pLACE)38. Nesta configuração, o 2pLACE controla a expressão de um repórter fluorescente, eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), em HEK293T células. A ativação é realizada em placas de 96 poços com fundo de vidro preto usando um OptoPlate-96, uma matriz de LED impressa em 3D projetada e construída por Lukasz Bugaj e colegas 56,57,58,59. Este protocolo otimiza especificamente a expressão máxima com diferentes proporções de massa do sistema de dois plasmídeos. Ele também inclui código amigável para controlar diferentes intensidades de luz para investigar a capacidade de ajuste do sistema e toda a sua faixa dinâmica. A citometria de fluxo é usada para coleta e análise de dados. Protocolos para geração de construções de plasmídeo e materiais de impressão 3D para a matriz de LED podem ser encontrados em publicações anteriores54,56. Esses métodos destacam um pipeline rápido e de alto rendimento para caracterizar sistemas de expressão gênica induzíveis por luz.

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Protocolo

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1. Revestimento HEK293T células em um formato de 96 poços

  1. Em uma cabine de biossegurança, colete um recipiente de resíduos de água sanitária, pipetas sorológicas, pipeta-auxiliar, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e um frasco de cultura de células T-75 com células HEK293T confluentes. Pré-aqueça o meio a 37 °C.
  2. Em um balão T-75, verifique se a confluência é cerca de 80% -100% confluente através de um microscópio invertido.
  3. Na cabine de biossegurança, use uma pipeta sorológica para aspirar os meios gastos do frasco de cultura de células. Evite tocar na superfície ou no plástico do frasco. Descarte o meio usado e o aspirador no recipiente de lixo.
  4. Lave suavemente as células com cerca de 10 mL de DPBS, aspirando-as para um canto do frasco e girando-as suavemente ao redor da superfície. Aspirar o DPBS do balão e eliminar a lavagem e o aspirador no recipiente de resíduos.
  5. Adicione 1,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% para cobrir a superfície do frasco e incube em temperatura ambiente por 1 min. Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície.
  6. Adicionar 8,5 ml de DMEM fresco no balão. Ressuspender e misturar as células com uma pipeta serológica até que todos os agregados tenham sido quebrados por aspiração para cima e para baixo.
  7. Colete 9 mL de suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL.
    1. Adicionar 9 ml de DMEM fresco ao balão e colocá-lo numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2
  8. Usando um hemocitômetro, misture 10 μL de células suspensas com 10 μL de corante azul de tripano na proporção de 1:1 para calcular a concentração de células. Use esse valor para preparar células suficientes para semear na placa.
  9. Semeie ~ 35.000 células em 100 μL para cada poço de uma placa de fundo de vidro preto # 1,5 de 96 poços de alto desempenho e coloque em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h.

2. Otimização da transfecção 2pLACE

  1. Para um poço e 10% de excesso, alíquota de 11 μL de DMEM sem soro quente (SFM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Usando um CRY2-eGFP: razões de massa de plasmídeo CIBN-gRNA iguais a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, alíquota 110 ng para cada poço de DNA total para as alíquotas de SFM (Tabela 1).
  3. Como controlo positivo, alíquota da mesma massa de plasmídeo CMV-eGFP para diferentes alíquotas de SFM.
  4. Para cada alvéolo, alíquota de 11 μL de SFM para diluição do reagente de transfecção.
  5. Prepare o reagente de transfecção em uma proporção de massa (μg) para volume (μL) de 1:3 de DNA e reagente de transfecção.
  6. Adicione o reagente de transfecção diluído ao DNA diluído e incube por 12 minutos em temperatura ambiente para criar os complexos de transfecção.
  7. Adicione ~ 20 μL do complexo de transfecção a cada poço. Certifique-se de que não toque nas paredes do poço.
  8. Embrulhe a placa em papel alumínio e coloque-a em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.

3. Ativação 2pLACE

  1. Modifique o código de entrada do microcontrolador para iluminar os poços desejados usando estas configurações (Codificação Suplementar File 1, Linhas 147 - 158).
    1. Intensidade do LED: 9,27 mW/cm2 (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 200 - 215).
    2. Comprimento do pulso: 1 s (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 280 - 290).
    3. Frequência de pulso: 0,067 Hz (a cada 15 s) (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 264 - 278).
      NOTA: As configurações de comprimento de onda são determinadas pelos tipos de LEDs instalados.
  2. Pulverize a tampa impressa em 3D do OptoPlate com etanol 70% e deixe secar em um gabinete de biossegurança.
  3. Ligue uma lâmpada de luz vermelha de câmara escura e coloque a placa de 96 poços em um gabinete de biossegurança e substitua a tampa pela tampa seca impressa em 3D.
    NOTA: Opcionalmente, pode-se visualizar as células CMV-eGFP usando microscopia de fluorescência para estimar a eficiência da transfecção.
  4. Pegue a placa de 96 poços e coloque-a na matriz de LED para construir o aparelho da matriz de LED. Certifique-se de que a placa se encaixa no lugar.
  5. Conecte o microcontrolador, o LED e as portas do ventilador a uma fonte de alimentação.
  6. Pulverize cuidadosamente os fios com etanol 70% e seque.
  7. Coloque o aparelho de matriz de LED em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. Certifique-se de que os LEDs acendam conforme o esperado e que os fios não estejam esticados quando a incubadora estiver selada.

4. Preparação da citometria de fluxo

  1. Enquanto estiver em um ambiente de luz vermelha, retire o OptoPlate e coloque a placa em um gabinete de biossegurança
    NOTA: Opcionalmente, pode-se visualizar as células por microscopia de fluorescência para confirmar visualmente a indução da luz.
  2. Aspire cuidadosamente todos os meios de cada poço.
  3. Retire as células usando 30 μL de tripsina-EDTA a 0,05% e incube por 1 min em temperatura ambiente.
  4. Misture cada poço com 100 μL de tampão FACS frio (1% de FBS em PBS) até obter uma única célula.
  5. Transfira cada amostra para uma placa de 96 poços com fundo em V.
  6. Centrifugue a placa de 96 poços com fundo em V a 164 x g por 10 min em temperatura ambiente.
  7. Aspirar 80 μL de sobrenadante sem perturbar o projétil.
  8. Adicione 200 μL de tampão FACS frio para ressuspender o pellet.
  9. Enrole a placa de 96 poços com fundo em V em papel alumínio para isolamento leve.
  10. Coloque o prato em uma caixa de isopor com gelo para transporte.

5. Passagem por citometria de fluxo e coleta de dados

  1. Ligue o citômetro de fluxo usando o interruptor na parte traseira e abra o respectivo software de citometria de fluxo no computador.
  2. Execute o programa de inicialização do sistema e carregue 2 mL de água DI no sample carregador (Figura Suplementar 1A).
  3. Execute o controle de qualidade (CQ) usando os grânulos de CQ fornecidos (Figura Suplementar 1B).
  4. Certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja no modo de amostragem de placa (Figura Suplementar 1C).
  5. Configure e especifique poços de amostra (Figura Suplementar 1D).
  6. Crie os seguintes gráficos e tabelas de dispersão (Figura Suplementar 2A).
    1. Dispersão lateral (SSC-A) vs dispersão direta (FSC-A).
    2. SSC-H vs SSC-A.
    3. SSC-A vs FITC-A.
    4. Tabela de estatísticas FITC-A (Figura Suplementar 2B).
  7. Encaixe a placa inferior em V no carregador de placas do citômetro.
  8. Selecione um poço não transfectado e clique em Inicializar e, em seguida, clique em Executar.Certifique-se de que a taxa de amostragem de volume seja de 10 μL/min (Figura Suplementar 2C).
  9. Ajuste as tensões SSC e FITC para centralizar a população de interesse no gráfico SSC-A vs FSC-A (Figura Suplementar 2C).
    1. Crie um polígono para bloquear a população de células saudáveis de interesse (Figura Suplementar 2D).
    2. Crie um polígono para portar a discriminação de dúplicos no gráfico SSC-H vs SSC-A.
    3. Ajuste a tensão FITC para colocar as células não transfectadas à esquerda do gráfico SSC-A vs FITC-A (Figura Suplementar 2D).
  10. Repita para os poços não transfectados restantes e registre os dados médios do FITC-A.
  11. Selecione um poço transfectado por CMV-eGFP e clique em Executar.
  12. Ajuste a tensão FITC para capturar células autofluorescentes e fluorescentes no gráfico SSC-A vs FITC-A.
    1. Crie um polígono para bloquear as células fluorescentes contra as células não fluorescentes enquanto faz referência à porta inicial em células não transfectadas (Figura Suplementar 2E).
  13. Registre automaticamente amostras a 60 μL / min até que 200 s sejam alcançados e / ou os eventos atinjam 10.000 (Figura Suplementar 2F).
  14. Exporte o FITC médio como um arquivo CSV e analise os dados.
  15. Limpe o citômetro de fluxo através da opção Daily Clean (Figura Suplementar 2G).

6. Otimização da intensidade do LED

  1. Edite o script do microcontrolador para testar as intensidades de LED desejadas (Arquivo de codificação suplementar 1, linhas 200-215).
    NOTA: Intensidades de LED equivalentes em relação aos valores no script do microcontrolador são relatadas em outro lugar38. A autocalibração pode ser necessária ao usar LEDs diferentes.
  2. Certifique-se de que o script contenha os seguintes valores em (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 200-215) conforme projetado na Tabela 2 e carregue o código no microcontrolador.
  3. Repita as etapas 1 a 5.

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Resultados

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Adotando elementos de fluxo de trabalho da literatura anterior 37,38,55, adicionamos iluminação simultânea de alto rendimento do OptoPlate-96 e demonstramos um pipeline para otimizar rapidamente um sistema de expressão gênica induzível por luz em células de mamíferos (Figura 1).

Para sistemas de expressão gênica induzíveis, altas faixas d...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstra o controle optogenético de uma expressão gênica transitória multicomponente em células de mamíferos, permitindo que outros pesquisadores caracterizem rápida e simultaneamente sistemas optogenéticos modulares com um repórter fluorescente.

Neste caso, um sistema induzível por luz de dois plasmídeos foi otimizado para a expressão de eGFP em HEK293T células. Para uma co-transfecção bem-sucedida, é essencial otimizar as densidades de semead...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado pelo Translational Research Institute por meio do Acordo de Cooperação da NASA NNX16AO69A e pelo Good Foods Institute. Este projeto foi apoiado pelo Laboratório de Recursos Compartilhados de Citometria de Fluxo da UC Davis com assistência técnica de Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke e Ashley Karajeh, com financiamento do NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) e S10OD018223 (citômetro Beckman Coulter "Cytoflex").

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos microcentrífugas de 1,5 mLVWR10025-724
Reservatórios de Reagentes de 10 mLVWR77395-252
Pipetas sorológicas de 10 mLVWR75816-100
1000 & mu; Ponteiras do filtro LVWR76322-154
15 mL  Tubos de centrífuga de alto desempenho, tampa planaVWR89039-664
Medidor de Potência Óptica 1931-CNewport1931-C
Pipetas sorológicas de 2 mLVWR75816-104
20 & mu; Ponteiras do filtro LVWR76322-134
200 & mu; Ponteiras do filtro LVWR76322-150
Tubos de centrífuga de alto desempenho de 50 mL, tampa planaVWR89039-656
Placas de fundo em V de 96 poçosBRANDplates781661
A21, lâmpada LED vermelhaLâmpadas BluexN/AFonte de luz vermelha
Arduino IDE SoftwareArduinoN/A
Armário de Biossegurança, Classe IINuAireN/A
Hemocitometro de Linha BrilhanteHausser Scientific3110
Slides de contagem de célulasBioRad1450016
Placa de Cultura Celular 96-poços, placa inferior de vidro #1,5HCellvisP96-1.5H-N
CytExpert SoftwareBeckman CoulterN/A
CytoFLEX Pronto para Uso Diário de Fluorosferas de QualidadeBeckman CoulterC657194 & deg; C
Citômetro de Fluxo CytoFLEX-S (4 canais violetas, 2 azuis, 4 amarelas verdes, 3 vermelhas)Beckman CoulterC09766
Pó de soro salino tamponado com fosfato da Dulbecco, sem cálico, sem magnésioFisher Scientific21600069Temperatura ambiente
Centrífuga Eppendorf 5804Eppendorf  022622501Etapa da centrífuga com placa inferior em V
Centrífuga Eppendorf 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research Plus, 8 canais, volume variável, 30 - 300 e mu; LEppendorf3125000052
Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 100 - 1000 & mu; LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 2 - 20 e mu; LEppendorf3123000039
Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 20 - 200 e mu; LEppendorf3123000055
Fita de Rotulagem de Laboratório de Uso GeralVWR89097-920
DMEM gibco, pó, glicose altaFisher Scientific121000614 & deg; C
Gibco Trypan Blue Solução, 0,4%Fisher Scientific15-250-061Temperatura ambiente
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 & deg; C
Gibco, Tripsina-EDTA (0,05%), com EDTA, Origem Animal, 1X, Fenol Vermelho, 500 mLGibco25300062-20 & deg; C
HEK293T CélulasATCCCRL-11268-80 ° C, Nitrogênio Líquido
Marcadores de laboratório, MicronovaVWR89205-944
Abajur de Mesa de MetalDesigns SimplesN/ALâmpada para luz vermelha
OptoPlate-96LABmakerN/A
XP de auxílio de pipetaDrummond4-000-101
Plasmídeo: CIBN-gRNAN/AN/A-20 & deg; C
Plasmídeo: CMV-eGFPN/AN/A-20 & deg; C
Plasmídeo: CRY2-eGFPN/AN/A-20 & deg; C
Reagente de Transfecção In Vitro de DNA PolyJetFisher ScientificNC15361174 & deg; C
Frasco de Cultura Celular T-75VWR10062-860
Incubadora de CO com Camisa de ÁguaVWR10810-884

Referências

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