Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Ferramentas de biologia sintética, como sistemas de expressão gênica induzíveis, forneceram contribuições significativas para a pesquisa biológica. Sua capacidade de regular a expressão gênica de maneira ajustável, reversível e precisa pode melhorar o controle da produção de proteínas 1,2,3,4,5,6, morfologia celular ^{7,8,9,10,11,12}, vias metabólicas 13,14,15^,16,17,18 e outros alvos para biofabricação e aplicações terapêuticas. Os sistemas químicos induzíveis podem ter efeitos residuais^19,20 ou fora do alvo. Os aditivos químicos também podem ser muito caros e difíceis de escalar industrialmente devido a processos adicionais de purificação a jusante 21,22,23. Os sistemas de expressão gênica induzíveis por luz podem oferecer um método escalável e preciso para práticas de biofabricação 24,25,26,27.

Muitos sistemas de expressão gênica induzíveis por luz foram desenvolvidos como ferramentas úteis de biologia sintética em uma variedade de aplicações 28,29,30,31,32,33,34,35,36 e comprimentos de onda de azul 35,37,38, vermelho/vermelho distante ^12,39,⁴⁰, ou luz verde⁴¹. No caso da regulação gênica optogenética baseada em CRISPR, modificar a quantidade de RNAs-guia individuais (gRNAs) entregues pode afetar a expressão de mRNA de genes endógenos⁴² e precisará ser otimizada para diferentes linhagens celulares. Proteínas de transativação como VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴, ou fusões delas 47 também podem ser usadas, aumentando a modularidade dos sistemas optogenéticos. A fim de investigar vias biológicas complexas e entrelaçadas 12,40,48,49,50,51,52,53, diferentes combinações desses componentes conhecidos podem ser testadas. Além disso, diferentes linhagens celulares podem apresentar diferenças na indução com o mesmo sistema⁵². Diferentes níveis de indução podem levar a uma expressão gênica insuficiente ou sensibilidade no controle preciso da expressão gênica, exigindo testes rigorosos para encontrar um sistema optogenético ideal em linhagens celulares novas ou biologicamente mais relevantes. Com um ritmo crescente e uma aplicabilidade cada vez maior da regulação gênica optogenética, é imperativo caracterizar rapidamente esses diferentes sistemas.

Os métodos atuais na caracterização de ferramentas optogenéticas usam expressão estável ou transitória de genes ^12,54. Gerar linhagens celulares que expressam de forma estável e otimizar a dinâmica do sistema para expressão máxima pode ser demorado e, portanto, caro. A expressão transitória permite insights rápidos e valiosos, especialmente ao testar sistemas optogenéticos multicomponentes. Aqui, usamos o sistema efetor CRISPR-dCas9 ativado por luz azul (LACE)³⁷, composto por criptocromo 2 (CRY2) e terminal N-terminal de hélice básica de interação com criptocromo (CIBN). Tem sido usado para controlar a expressão gênica em células de mamíferos, como HEK293T (células renais embrionárias humanas) ^{37 , 38} , CHO-DG44 (células de ovário de hamster chinês) ⁵⁵ e C2C12 (células de mioblastos de camundongo) ³⁸ . Sua natureza modular é ideal para caracterizar rapidamente o desempenho do sistema por meio de métodos de expressão transitória e alto rendimento. Por exemplo, sistemas multicomponentes como o LACE podem precisar de otimização das proporções de massa para melhorar a indução, uma etapa normalmente não empregada na caracterização de sistemas optogenéticos.

Este protocolo detalha a rápida otimização e caracterização de dois sistemas de plasmídeo LACE (2pLACE)³⁸. Nesta configuração, o 2pLACE controla a expressão de um repórter fluorescente, eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), em HEK293T células. A ativação é realizada em placas de 96 poços com fundo de vidro preto usando um OptoPlate-96, uma matriz de LED impressa em 3D projetada e construída por Lukasz Bugaj e colegas 56,57,58,59. Este protocolo otimiza especificamente a expressão máxima com diferentes proporções de massa do sistema de dois plasmídeos. Ele também inclui código amigável para controlar diferentes intensidades de luz para investigar a capacidade de ajuste do sistema e toda a sua faixa dinâmica. A citometria de fluxo é usada para coleta e análise de dados. Protocolos para geração de construções de plasmídeo e materiais de impressão 3D para a matriz de LED podem ser encontrados em publicações anteriores^54,56. Esses métodos destacam um pipeline rápido e de alto rendimento para caracterizar sistemas de expressão gênica induzíveis por luz.

1. Revestimento HEK293T células em um formato de 96 poços

1. Em uma cabine de biossegurança, colete um recipiente de resíduos de água sanitária, pipetas sorológicas, pipeta-auxiliar, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e um frasco de cultura de células T-75 com células HEK293T confluentes. Pré-aqueça o meio a 37 °C.
2. Em um balão T-75, verifique se a confluência é cerca de 80% -100% confluente através de um microscópio invertido.
3. Na cabine de biossegurança, use uma pipeta sorológica para aspirar os meios gastos do frasco de cultura de células. Evite tocar na superfície ou no plástico do frasco. Descarte o meio usado e o aspirador no recipiente de lixo.
4. Lave suavemente as células com cerca de 10 mL de DPBS, aspirando-as para um canto do frasco e girando-as suavemente ao redor da superfície. Aspirar o DPBS do balão e eliminar a lavagem e o aspirador no recipiente de resíduos.
5. Adicione 1,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% para cobrir a superfície do frasco e incube em temperatura ambiente por 1 min. Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície.
6. Adicionar 8,5 ml de DMEM fresco no balão. Ressuspender e misturar as células com uma pipeta serológica até que todos os agregados tenham sido quebrados por aspiração para cima e para baixo.
7. Colete 9 mL de suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL.
   1. Adicionar 9 ml de DMEM fresco ao balão e colocá-lo numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂
8. Usando um hemocitômetro, misture 10 μL de células suspensas com 10 μL de corante azul de tripano na proporção de 1:1 para calcular a concentração de células. Use esse valor para preparar células suficientes para semear na placa.
9. Semeie ~ 35.000 células em 100 μL para cada poço de uma placa de fundo de vidro preto # 1,5 de 96 poços de alto desempenho e coloque em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 24 h.

2. Otimização da transfecção 2pLACE

1. Para um poço e 10% de excesso, alíquota de 11 μL de DMEM sem soro quente (SFM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Usando um CRY2-eGFP: razões de massa de plasmídeo CIBN-gRNA iguais a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, alíquota 110 ng para cada poço de DNA total para as alíquotas de SFM (Tabela 1).
3. Como controlo positivo, alíquota da mesma massa de plasmídeo CMV-eGFP para diferentes alíquotas de SFM.
4. Para cada alvéolo, alíquota de 11 μL de SFM para diluição do reagente de transfecção.
5. Prepare o reagente de transfecção em uma proporção de massa (μg) para volume (μL) de 1:3 de DNA e reagente de transfecção.
6. Adicione o reagente de transfecção diluído ao DNA diluído e incube por 12 minutos em temperatura ambiente para criar os complexos de transfecção.
7. Adicione ~ 20 μL do complexo de transfecção a cada poço. Certifique-se de que não toque nas paredes do poço.
8. Embrulhe a placa em papel alumínio e coloque-a em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h.

3. Ativação 2pLACE

1. Modifique o código de entrada do microcontrolador para iluminar os poços desejados usando estas configurações (Codificação Suplementar File 1, Linhas 147 - 158).
   1. Intensidade do LED: 9,27 mW/cm² (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 200 - 215).
   2. Comprimento do pulso: 1 s (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 280 - 290).
   3. Frequência de pulso: 0,067 Hz (a cada 15 s) (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 264 - 278).
      NOTA: As configurações de comprimento de onda são determinadas pelos tipos de LEDs instalados.
2. Pulverize a tampa impressa em 3D do OptoPlate com etanol 70% e deixe secar em um gabinete de biossegurança.
3. Ligue uma lâmpada de luz vermelha de câmara escura e coloque a placa de 96 poços em um gabinete de biossegurança e substitua a tampa pela tampa seca impressa em 3D.
   NOTA: Opcionalmente, pode-se visualizar as células CMV-eGFP usando microscopia de fluorescência para estimar a eficiência da transfecção.
4. Pegue a placa de 96 poços e coloque-a na matriz de LED para construir o aparelho da matriz de LED. Certifique-se de que a placa se encaixa no lugar.
5. Conecte o microcontrolador, o LED e as portas do ventilador a uma fonte de alimentação.
6. Pulverize cuidadosamente os fios com etanol 70% e seque.
7. Coloque o aparelho de matriz de LED em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h. Certifique-se de que os LEDs acendam conforme o esperado e que os fios não estejam esticados quando a incubadora estiver selada.

4. Preparação da citometria de fluxo

1. Enquanto estiver em um ambiente de luz vermelha, retire o OptoPlate e coloque a placa em um gabinete de biossegurança
   NOTA: Opcionalmente, pode-se visualizar as células por microscopia de fluorescência para confirmar visualmente a indução da luz.
2. Aspire cuidadosamente todos os meios de cada poço.
3. Retire as células usando 30 μL de tripsina-EDTA a 0,05% e incube por 1 min em temperatura ambiente.
4. Misture cada poço com 100 μL de tampão FACS frio (1% de FBS em PBS) até obter uma única célula.
5. Transfira cada amostra para uma placa de 96 poços com fundo em V.
6. Centrifugue a placa de 96 poços com fundo em V a 164 x g por 10 min em temperatura ambiente.
7. Aspirar 80 μL de sobrenadante sem perturbar o projétil.
8. Adicione 200 μL de tampão FACS frio para ressuspender o pellet.
9. Enrole a placa de 96 poços com fundo em V em papel alumínio para isolamento leve.
10. Coloque o prato em uma caixa de isopor com gelo para transporte.

5. Passagem por citometria de fluxo e coleta de dados

1. Ligue o citômetro de fluxo usando o interruptor na parte traseira e abra o respectivo software de citometria de fluxo no computador.
2. Execute o programa de inicialização do sistema e carregue 2 mL de água DI no sample carregador (Figura Suplementar 1A).
3. Execute o controle de qualidade (CQ) usando os grânulos de CQ fornecidos (Figura Suplementar 1B).
4. Certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja no modo de amostragem de placa (Figura Suplementar 1C).
5. Configure e especifique poços de amostra (Figura Suplementar 1D).
6. Crie os seguintes gráficos e tabelas de dispersão (Figura Suplementar 2A).
   1. Dispersão lateral (SSC-A) vs dispersão direta (FSC-A).
   2. SSC-H vs SSC-A.
   3. SSC-A vs FITC-A.
   4. Tabela de estatísticas FITC-A (Figura Suplementar 2B).
7. Encaixe a placa inferior em V no carregador de placas do citômetro.
8. Selecione um poço não transfectado e clique em Inicializar e, em seguida, clique em Executar.Certifique-se de que a taxa de amostragem de volume seja de 10 μL/min (Figura Suplementar 2C).
9. Ajuste as tensões SSC e FITC para centralizar a população de interesse no gráfico SSC-A vs FSC-A (Figura Suplementar 2C).
   1. Crie um polígono para bloquear a população de células saudáveis de interesse (Figura Suplementar 2D).
   2. Crie um polígono para portar a discriminação de dúplicos no gráfico SSC-H vs SSC-A.
   3. Ajuste a tensão FITC para colocar as células não transfectadas à esquerda do gráfico SSC-A vs FITC-A (Figura Suplementar 2D).
10. Repita para os poços não transfectados restantes e registre os dados médios do FITC-A.
11. Selecione um poço transfectado por CMV-eGFP e clique em Executar.
12. Ajuste a tensão FITC para capturar células autofluorescentes e fluorescentes no gráfico SSC-A vs FITC-A.
    1. Crie um polígono para bloquear as células fluorescentes contra as células não fluorescentes enquanto faz referência à porta inicial em células não transfectadas (Figura Suplementar 2E).
13. Registre automaticamente amostras a 60 μL / min até que 200 s sejam alcançados e / ou os eventos atinjam 10.000 (Figura Suplementar 2F).
14. Exporte o FITC médio como um arquivo CSV e analise os dados.
15. Limpe o citômetro de fluxo através da opção Daily Clean (Figura Suplementar 2G).

6. Otimização da intensidade do LED

1. Edite o script do microcontrolador para testar as intensidades de LED desejadas (Arquivo de codificação suplementar 1, linhas 200-215).
   NOTA: Intensidades de LED equivalentes em relação aos valores no script do microcontrolador são relatadas em outro lugar³⁸. A autocalibração pode ser necessária ao usar LEDs diferentes.
2. Certifique-se de que o script contenha os seguintes valores em (Arquivo de Codificação Suplementar 1, Linhas 200-215) conforme projetado na Tabela 2 e carregue o código no microcontrolador.
3. Repita as etapas 1 a 5.

Adotando elementos de fluxo de trabalho da literatura anterior 37,38,55, adicionamos iluminação simultânea de alto rendimento do OptoPlate-96 e demonstramos um pipeline para otimizar rapidamente um sistema de expressão gênica induzível por luz em células de mamíferos (Figura 1).

Para sistemas de expressão gênica induzíveis, altas faixas dinâmicas são um marcador crítico de desempenho, além da expressão absoluta de ligar e desligar (vazamento). Com imagens de fluorescência de células transfectadas, a diferença na expressão de eGFP entre as células ativadas por luz e as células mantidas no escuro pode ser observada qualitativamente (Figura 2). Uma proporção de 1:9 resulta visivelmente em menor expressão máxima de eGFP em comparação com uma proporção de 5:5. Pode-se observar também que há aumento do vazamento na proporção de 5:5. A imagem de fluorescência de células transfectadas eGFP de expressão constitutiva (CMV-eGFP) e células não transfectadas são controles positivos e negativos valiosos para contextualizar a eficiência da transfecção e a expressão induzida e vazada do sistema, respectivamente. O uso de imagens de fluorescência permite que os usuários vejam e validem rapidamente a transfecção bem-sucedida e a ativação da expressão gênica com luz azul, fornecendo um ponto de verificação valioso antes da citometria de fluxo. A citometria de fluxo pode então ser usada para quantificar a intensidade média de fluorescência (MFI) e a faixa dinâmica.

Após a ativação da luz das células, elas são preparadas com tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo. HEK293T células têm cerca de 11-15 μm, resultando em um ganho de FSC de 500 e um ganho de SSC de 125 (Figura Suplementar 2C) para centralizar as populações de células saudáveis. Voltagens mais altas resultam na análise de detritos em vez de populações de células saudáveis. Nossas corridas têm consistentemente acima de ~ 60% dos eventos no primeiro portão populacional (P1) (Figura 3A-D). Uma vez que as populações de células saudáveis compõem a maioria dos eventos no gráfico SSC-A vs FSC-A, a densidade de eventos também pode ser verificada para identificar a maioria da população (Figura Suplementar 3A). Em seguida, a discriminação dupla pode ser realizada por meio do gráfico SSC-H vs SSC-A, que é crucial para resultados confiáveis e reprodutíveis60,61. Nesse sistema, geralmente descobrimos que mais de 95% dos eventos fechados em P1 eram singlets (Figura 3A-D). No gráfico SSC-A vs FITC-A, as células não transfectadas geralmente estarão à esquerda do centro do gráfico e serão fechadas para ter uma população <0,1% (Figura 3A). Em seguida, as células positivas para eGFP preencherão a porta que estava vazia na amostra não transfectada, resultando em medições de análise de célula única de MFI (Figura 3B). Uma vez que os controles negativo e positivo são coletados para definir as portas e tensões adequadas, as amostras com 2pLACE podem ser analisadas usando as mesmas portas para excluir de forma confiável as células autofluorescentes (Figura 3C, D). Aqui, a população percentual de células positivas para eGFP foi de ~ 99% para CMV-eGFP e ~ 57% para células transfectadas com 2pLACE. Uma porta final também pode ser usada no canal PE-A para garantir que células altamente fluorescentes sejam capturadas (Figura Suplementar 3B).

Outra proporção que optou por testar foi de 3:7. Como etapa de validação, imagens de microscopia de fluorescência foram obtidas antes da citometria de fluxo e observaram transfecção bem-sucedida para a indução da expressão de eGFP com 2pLACE, esperadamente menor que CMV-eGFP (Figura 4A). Após a coleta de dados de citometria de fluxo de 2pLACE, a expressão gênica ativada por luz azul pode ser comparada com a expressão gênica com vazamento (Figura 4B). Usando as configurações listadas na Etapa 3.1, pudemos observar um aumento de ~ 3 vezes na expressão após a ativação da luz azul, combinando com o aumento do sinal de fluorescência visto qualitativamente pela microscopia. Além disso, as eficiências de transfecção podem ser vistas indiretamente medindo a população % eGFP-positiva, ou porcentagem parental, em ~ 60% de células individuais saudáveis (Figura 4C).

A implementação deste protocolo em sua totalidade pode identificar proporções de massa ideais (Figura 5A) e intensidades de luz (Figura 5B) para faixa dinâmica máxima e expressão ajustável. Razões de massa inferiores a 6:4 exibiram maior faixa dinâmica (3,5-4,5), enquanto razões de massa além de 6:4 mostraram diminuição da faixa dinâmica devido ao aumento do fundo e diminuição da expressão máxima de eGFP. Tanto para expressão máxima quanto para alta faixa dinâmica, é preferível uma proporção de 3:7. Razões abaixo de 3:7 mostraram induções de dobra semelhantes, mas tiveram menor expressão máxima geral. Usando nossos valores de intensidade de luz previamente calibrados38 (Tabela 2), pode-se caracterizar o nível de expressão gênica em relação a diferentes intensidades de luz. As intensidades de luz também controlaram os níveis de expressão de eGFP, onde o MFI satura a ~ 3 mW / cm2. Intensidades de luz além disso podem ter valores MFI variados, provavelmente devido ao fotobranqueamento em algumas amostras, como visto em ~ 9 e 11 mW / cm2.

Figura 1: Pipeline geral de experimentos de alto rendimento testando sistemas optogenéticos. As células são semeadas em uma placa preta de 96 poços por 24 h. Em seguida, as células são transfectadas com um período de incubação de 12 minutos de DNA e reagente de transfecção. 24 h após a transfecção, a placa é colocada no OptoPlate-96 para ativação da luz azul. Após a duração desejada da ativação da luz azul, as células são preparadas em um ambiente de luz vermelha para citometria de fluxo. Os dados de citometria de fluxo são representados como gráficos de intensidade de fluorescência média de células positivas para eGFP no escuro ou tratadas com luz azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de microscopia de fluorescência de 2pLACE no estado ligado e desligado em células HEK293T. Diferentes proporções de massa de CRY2-eGFP: CIBN-gRNA foram testadas para níveis de expressão de eGFP. As células foram expostas à luz azul (ON) ou mantidas no escuro (OFF) por 24 h. A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Gráficos de dispersão de citometria de fluxo representativos de células HEK293T não transfectadas (UT), CMV-eGFP e 2pLACE. A citometria de fluxo foi realizada usando a função de carregador de placas. (A) HEK293T células foram fechadas com base no espalhamento direto (FSC-A) e espalhamento lateral (SSC-A). A concentração de eventos nos gráficos SSC-A vs. FSC-A pode ser visualizada usando um gráfico de contorno (Figura Suplementar 3A) para auxiliar no bloqueio de populações saudáveis. A discriminação dupla foi realizada em uma parcela SSC-H vs. SSC-A usando uma porta linear. O gráfico final fechou as células fluorescentes referenciando a amostra não transfectada. (B) As células foram fechadas como em (A), mostrando a população fluorescente e a intensidade de fluorescência na tabela de estatísticas (Figura Suplementar 2B). (C,D) As células transfectadas com 2pLACE foram fechadas separadamente através da porta P3. A população magenta representa todas as células positivas para eGFP (Figura Suplementar 3B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise qualitativa e quantitativa da expressão de eGFP induzida por luz em células HEK293T. (A) Imagens de microscopia de fluorescência de células HEK293T transfectadas com plasmídeos 2pLACE ou CMV-eGFP. (B) Quantificação da intensidade média de fluorescência (MFI) de eGFP em células mantidas sob luz azul ou condições de escuridão. (C) Porcentagem de células positivas para eGFP medidas por meio de análise de cogating por citometria de fluxo. O gating resultou em <0,1% de células não transfectadas dentro do limite positivo para eGFP. Os dados de citometria de fluxo representam valores médios e as barras de erro indicam desvios padrão de quatro réplicas técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Citometria de fluxo de proporções de massa representativas de 2pLACE e intensidades de luz azul. (A) Várias proporções de massa de CRY2-eGFP: CIBN-gRNA foram transfectadas em células HEK293T, que foram então expostas à luz azul ou mantidas no escuro usando as mesmas configurações relatadas na etapa 3 do protocolo. Cada condição é a média de 3 réplicas biológicas. (B) Tendência representativa da expressão gênica em função da intensidade da luz azul. Cada condição é a média de 6 réplicas técnicas. As intensidades médias de fluorescência são quantificadas por meio do citômetro de fluxo de células que expressam eGFP. Todas as barras de erro representam o desvio padrão. Para as razões de plasmídeos, a significância estatística do MFI foi calculada usando um teste t unidirecional comparando o claro e o escuro de uma razão de plasmídeo. Para intensidades de luz, a significância estatística foi calculada com ANOVA de uma via e teste post-hoc T2 de Tamhane em comparação com o estado escuro (OFF). *p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 e ns não é significativo. Essa figura foi adaptada de Garimella et al.38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Quantidade de plasmídeos CRY2-eGFP e CIBN-gRNA por poço usando concentrações de exemplo. As quantidades de volume são por poço e podem ser modificadas com base no número de amostras ou réplicas em um experimento. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores recomendados para intensidades de luz azul. O código é encontrado no Arquivo de Codificação Suplementar 1 (Linhas 215-228). Os valores de intensidade equivalente são calculados usando dados de calibração relatados anteriormente usando um medidor de potência óptica. Cada nível de intensidade tem 6 réplicas técnicas. As linhas G e H destinam-se a CMV-eGFP e poços de controle não transfectados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Etapas 5.1-5.5 do protocolo. (A) Executando o programa de inicialização do sistema. (B) Padronização do controle de qualidade usando grânulos de fluoróforo. (C) Mudança do tubo sampling para o modo carregador de placas. (D) Seleção de poços para rotular como poços de amostra; 35 poços foram selecionados para este exemplo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Etapas 5.6-5.14 do protocolo. (A) Configuração de gráficos de espalhamento de luz: FSC-A vs. SSC-A para gating de população de células saudáveis, SSC-A vs. SSC-H para discriminação de dupletos e SSC-A vs. FITC-A para gating de células autofluorescentes e eGFP-positivas. (B) Configurar a tabela de estatísticas para adquirir dados FITC-A para medir a intensidade média de fluorescência. (C) Realçar regras de parada na guia Eventos a serem exibidos. Garanta uma taxa de fluxo de amostra lenta, ejete e carregue a placa, inicialize a sonda do citômetro de fluxo e ajuste as tensões de aquisição. (D) Criação de polígonos para portar cada população, conforme mostrado. (E) Adicionando o número apropriado de poços. (F) Clicar em Gravar automaticamente assim que as configurações e os portões estiverem concluídos. (G) Clicar em Limpeza Diária depois que todas as amostras forem coletadas e as estatísticas forem exportadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Validação de todas as células dentro da porta capturada, visualizada por eventos verdes em P4 (magenta). (A) Gráfico de contorno da população saudável dentro do portão da população positiva para eGFP (P3). As células estão concentradas principalmente nas zonas vermelhas, diminuindo externamente. (B) Gráfico SSC-A vs. PE-A para gating P4, fornecendo uma verificação adicional para garantir que todos os eventos fluorescentes sejam contabilizados no gráfico FITC-A. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: Exemplo de código Arduino implementando todas as propriedades descritas no protocolo acima. Este arquivo ativa todas as posições de LED usando os valores de intensidade de LED recomendados na Tabela 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.