Quantificação tridimensional do muco intestinal usando imagens de tecido de montagem total

Summary

Este estudo apresenta um método de imagem 3D usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton para quantificar o muco secretado, permitindo uma análise volumétrica precisa e visualização da dinâmica do muco em resposta a estímulos como o cloreto de carbamoilcolina.

Abstract

O muco desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase intestinal, facilitando a digestão, formando uma barreira contra micróbios e regulando as respostas imunológicas no intestino. Sua secreção é modulada por vários fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo infecções microbianas e inflamação. Embora os métodos tradicionais de análise de muco dependam de quantificação relativa, como medir a espessura do muco em cortes histológicos, essas abordagens fornecem informações limitadas sobre o volume real e a distribuição espacial do muco secretado no lúmen intestinal. Aqui, apresentamos uma metodologia detalhada para a quantificação absoluta e tridimensional do muco usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton. Este protocolo inclui a preparação de alças intestinais ligadas, tratamento com cloreto de carbamoilcolina como estímulo para ativação de células caliciformes, fixação tecidual e coloração para imagem. Usando microscopia multifóton, adquirimos imagens empilhadas em Z da superfície luminal. Estes são processados no software Imaris para quantificar o volume e a distribuição espacial do muco secretado. Demonstramos que o cloreto de carbamoilcolina induz de forma robusta a secreção de muco nos tecidos ileal e colônico em 30 minutos. O muco secretado aparece de maneira esporádica e descontínua em todo o lúmen, ressaltando a importância da análise volumétrica em relação às abordagens bidimensionais tradicionais. Este protocolo permite aos pesquisadores obter dados quantitativos absolutos e visualizar a distribuição do muco in situ, oferecendo uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica do muco intestinal em condições fisiológicas e patológicas.

Introduction

O ambiente mucoso do trato gastrointestinal dos mamíferos é altamente dinâmico, apoiando a colonização de uma comunidade microbiana diversificada. O epitélio intestinal consiste em várias células especializadas que colaboram para absorver nutrientes, manter a integridade da barreira e se comunicar com o sistema imunológico¹. Entre estes, as células caliciformes armazenam grânulos de mucina e secretam muco no lúmen em condições de estado estacionário. Esse muco forma uma barreira física crítica, impedindo o contato microbiano direto com a camada epitelial, modulando a inflamação tecidual e mantendo a homeostase intestinal ^2,3. A desregulação da secreção de muco compromete a função de barreira e tem sido associada à inflamação e tumorigênese 4,5,6,7.

A secreção de muco intestinal pode ser desencadeada por fatores intrínsecos, como o neurotransmissor acetilcolina, e por componentes microbianos de^comensais8,9. Dada a complexidade do ambiente intestinal, muitos fatores que influenciam a secreção de muco das células caliciformes permanecem inexplorados. Portanto, um método preciso para quantificar o muco luminal é essencial para investigar como diferentes estímulos afetam a dinâmica da secreção. As abordagens tradicionais dependem principalmente da quantificação relativa: por exemplo, medir a espessura do muco usando partículas fluorescentes ou de carvão em sistemas de explantes intestinais ex vivo ^10,11 ou avaliar a distância entre micróbios luminais e o epitélio em seções de tecido coradas^12,13. Embora esses métodos sejam convenientes para comparações relativas, eles podem não capturar a distribuição completa ou a estrutura tridimensional do muco secretado, principalmente porque o muco secretado nem sempre cobre uniformemente o epitélio.

Neste estudo, apresentamos um método para visualização tridimensional e quantificação absoluta do muco luminal usando tecidos intestinais de montagem total. Essa abordagem requer fixação de tecido fresco com um fixador apropriado para preservar a integridade estrutural e a morfologia, seguida de coloração fluorescente e imagem usando um microscópio confocal ou multifotônico. Ao administrar agentes de teste diretamente em alças intestinais ligadas de camundongos profundamente anestesiados, seguido de fixação imediata, o método preserva a arquitetura do muco nativo e permite a análise da cinética de secreção. Em comparação com os tecidos seccionados, onde a profundidade de imagem é limitada principalmente pela espessura do tecido, a profundidade de imagem de tecidos de montagem inteira (sem delipidação) atinge aproximadamente 200-300 μm, limitada por espalhamento de luz e opacidade do tecido. Usando essa técnica, mostramos que o cloreto de carbamoilcolina (CCh), um análogo da acetilcolina cujos receptores são expressos nas células caliciformes¹⁴, induz de forma robusta a secreção rápida de muco. Notavelmente, o muco secretado forma uma camada contínua ao longo do epitélio e estruturas descontínuas dentro do lúmen, características difíceis de detectar em seções de tecido convencionais. Este protocolo fornece uma plataforma robusta para quantificar a distribuição tridimensional do muco intestinal e para comparar o potencial indutor de muco de vários estímulos.

Protocol

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Chang Gung. A instalação de animais da Universidade Chang Gung é credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Não foram observadas preocupações com a saúde animal nesses estudos.

1. Preparação da base de fixação

1. Misture o pó de agarose com ddH₂O até uma concentração de 4% (p / v) em um frasco para micro-ondas. Microondas por 2-3 min até ferver sem bolhas minúsculas.
   NOTA: O volume depende do número de amostras; aproximadamente 10 mL para um prato de 6 cm.
2. Deixe a solução de agarose esfriar até ~60 °C em ~3 min. Despeje a agarose em um prato de 6 cm com cuidado até que a altura do líquido atinja a metade do prato (aproximadamente 10 mL para um prato de 6 cm).
3. Coloque o prato com tampa em uma área fechada por 20-30 min, até que a agarose esteja completamente solidificada.

2. Preparação do material de fixação

1. Prepare novos fios de cobre e corte-os em comprimentos de 5 mm. Cada pedaço de tecido requer 6-8 pedaços de arame.

3. Preparação da solução CCh

1. Dissolver o CCh cristalino em tampão PBS estéril até uma concentração final de 10 μM (200 μL para uma alça intestinal).

4. Preparação de anestésicos injetáveis

1. Para preparar a solução estoque para anestesia, dissolva o 2,2,2-tribromoetanol em 2-metil-2-butanol.
2. Utilizar PBS estéril para diluir a solução-mãe, de modo a que a solução de trabalho final contenha 30 mg/ml de 2,2,2-tribromoetanol e 3% (v/v) de 2-metil-2-butanol.
3. Vortex completamente por ~ 1 min até que nenhum pellet permaneça na solução (taxa máxima: 8).
4. Conservar a solução-mãe à escura a 4 °C para evitar a degradação; Descarte o estoque 1 mês após a preparação.
5. Antes da anestesia, coloque a solução estoque em PBS estéril e misture bem para garantir uma dispersão uniforme, atingindo uma dose final de 250 mg / kg por camundongo.
   CUIDADO: O 2,2,2-tribromoetanol tem neurotoxicidade e o 2-metil-2-butanol é volátil e tem odor irritante. Equipamento de proteção adequado deve ser usado. Para o descarte, colete os resíduos em um recipiente lacrado e siga os procedimentos de descarte de resíduos químicos perigosos da instituição.

5. Inoculação intestinal via injeção de alça

1. Anestesie um camundongo de 6 a 8 semanas com injeção intraperitoneal de 200 μL de 2,2,2-tribromoetanol (250 mg / kg por camundongo) e coloque o camundongo em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.
2. Depois de esterilizar a superfície da pele com álcool, faça uma incisão na parte inferior esquerda do abdômen do camundongo usando uma tesoura cirúrgica e exponha o ceco sob anestesia.
3. Identifique o íleo ou cólon proximal, coloque a alça intestinal em uma gaze estéril e use grampos arteriais para prender ambas as extremidades, criando uma alça fechada de 3 cm de comprimento.
4. Enxágue o órgão na gaze com PBS estéril.
5. Injete PBS estéril ou reagente CCh em um volume não superior a 200 μL na alça intestinal ligada sob anestesia.

6. Colheita, fixação e coloração de tecidos

1. Após 30 min de tratamento, eutanasiar o camundongo por luxação cervical e colher a alça intestinal.
2. Use uma pinça para segurar a alça intestinal e enxágue-a suavemente em PBS estéril.
3. Corte suavemente a alça intestinal longitudinalmente e enxágue o tecido em PBS estéril.
4. Alise o tecido e use segmentos de fio de cobre para ancorá-lo na agarose em um prato de 6 cm.
5. Fixe o tecido com 10 mL de solução de paraformaldeído a 4% por 12-24 h no prato.
6. Lave o tecido com PBS pelo menos 3x para remover o paraformaldeído residual.
7. Mergulhe o tecido em 10 mL de tampão de bloqueio (PBS suplementado com 0,4% de Triton X-100 e 3% de albumina de soro bovino [BSA]) a 4 ° C por 12-24 h no prato.
8. Manchar o tecido com aglutinina de gérmen de trigo (WGA, 1:200) e faloidina (1:500) em tampão de bloqueio, agitando a 120 rpm a 4 °C durante 12-24 h na placa.
   NOTA: Para minimizar o consumo de corante, o tecido pode ser ancorado em agarose solidificada em um prato de 3 cm imerso em 2 mL de tampão de corante para coloração.
   CUIDADO: O paraformaldeído representa um risco de inalação. Equipamento de proteção adequado deve ser usado durante o manuseio, como operação em um exaustor. Para o descarte, colete os resíduos em um recipiente lacrado e siga os procedimentos de descarte de resíduos químicos perigosos da instituição.

7. Captura de imagem por microscopia multifotônica

1. Lave o tampão de coloração restante pelo menos 3x com PBS.
2. Ancorar o tecido em agarose com fios de cobre em uma placa de 6 cm em 10 mL de PBS.
3. Adquira 100 seções ópticas (cobrindo 99 μm de profundidade) de tecido intestinal e muco secretado associado usando um microscópio multifotônico equipado com uma lente objetiva de alta abertura numérica para imagens de tecidos profundos. Use uma fonte de excitação para microscopia multifotônica ajustada para um comprimento de onda de 750 nm. Colete sinais de emissão usando filtros passa-banda BP500-550 nm e BP565-610 nm. Defina a velocidade de digitalização para 8.
   NOTA: Para microscopia multifotônica, a velocidade máxima de varredura é 9, com valores mais altos indicando aquisição mais rápida. A configuração da velocidade depende da capacidade do microscópio. Ao usar a plataforma de imagem usada para adquirir pilhas 3D, recomendamos uma velocidade de varredura de 8 para equilibrar o tempo de aquisição e a qualidade da imagem.

8. Análise de imagem e quantificação de muco (Figura 1)

1. Para medir o volume de cada partícula de muco (no canal WGA), abra a pilha de imagens no Imaris arrastando e soltando o arquivo na página Arena. Clique no ícone Superfície para iniciar o fluxo de trabalho de criação de superfície. Siga as etapas padrão para segmentar e quantificar os volumes de partículas dentro da pilha z. Parâmetros específicos e etapas de processamento são detalhados na Figura 1.
2. Exclua partículas de muco menores que 1.000 μm³, que são principalmente células caliciformes ( Figura 2A , B ).
3. Some o volume de muco secretado para cada grupo.

9. Análise estatística

1. Analise e compare o volume total de cada grupo. Insira o valor do volume de muco em Coluna e analise usando um teste não paramétrico de Mann-Whitney.

Results

Neste método, quantificamos o volume de muco intestinal a partir de imagens empilhadas de tecidos inteiros adquiridos por microscopia multifotônica. Os tecidos intestinais foram corados com faloidina fluorescente e aglutinina de gérmen de trigo (WGA) para visualização de F-actina celular e muco, respectivamente^15,16. Nos tecidos ileal e colônico tratados com PBS, o muco WGA⁺ foi detectado principalmente dentro das células caliciformes na superfície epi...

Discussion

Aqui, apresentamos um método para quantificação tridimensional do muco intestinal usando coloração de tecido de montagem total, microscopia multifóton e análise com o software Imaris. Este procedimento permite a observação da distribuição descontínua do muco no lúmen intestinal e fornece uma medição absoluta do volume de muco.

A distribuição descontínua de muco após a estimulação também foi observada em sistemas de cultura de tecidos de explantes

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm de prato	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Cloreto de carbamoilcolina ≥ 98% (titulação), cristalino	SIGMA	SI-C4382-1G
Fio de cobre (novo)	FIO TOP TECH & INDÚSTRIA DE CABOS	IW00125	Fio de cobre sem camada isolante
Fórceps	Shineteh	ST-M110
Gaze, estéril	GMTH	Maio-40
GraphPad Prism 8	GraphPad Software
Bolsa térmica	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	INSTRUMENTOS OXFORD
Paraformaldeído	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Sondas de Marcagem de Faloidinas	Invitrogen	A12379
Tesoura	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Conjugados da Aglutinina do Germe de Trigo (WGA)	Biotium	29027
Zeiss 7MP com objetivo de imersão em água W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), laser de femtossegundo Spectra-Physics Mai Tai HP ti safira (sem módulo DeepSee) com detectores BP500 nm-550 nm e BP565 nm-610 nm, e comprimento de onda laser de 750 nm			plataforma de imagem usada para adquirir pilhas 3D com uma lente objetiva de alto NA para imagem de tecidos profundos; uma fonte de excitação para microscopia multifóton ajustada para um comprimento de onda de 750 nm