Quantificação tridimensional do muco intestinal usando imagens de tecido de montagem total

Summary

Este estudo apresenta um método de imagem 3D usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton para quantificar o muco secretado, permitindo uma análise volumétrica precisa e visualização da dinâmica do muco em resposta a estímulos como o cloreto de carbamoilcolina.

Abstract

O muco desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase intestinal, facilitando a digestão, formando uma barreira contra micróbios e regulando as respostas imunológicas no intestino. Sua secreção é modulada por vários fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo infecções microbianas e inflamação. Embora os métodos tradicionais de análise de muco dependam de quantificação relativa, como medir a espessura do muco em cortes histológicos, essas abordagens fornecem informações limitadas sobre o volume real e a distribuição espacial do muco secretado no lúmen intestinal. Aqui, apresentamos uma metodologia detalhada para a quantificação absoluta e tridimensional do muco usando tecidos intestinais de montagem total e microscopia multifóton. Este protocolo inclui a preparação de alças intestinais ligadas, tratamento com cloreto de carbamoilcolina como estímulo para ativação de células caliciformes, fixação tecidual e coloração para imagem. Usando microscopia multifóton, adquirimos imagens empilhadas em Z da superfície luminal. Estes são processados no software Imaris para quantificar o volume e a distribuição espacial do muco secretado. Demonstramos que o cloreto de carbamoilcolina induz de forma robusta a secreção de muco nos tecidos ileal e colônico em 30 minutos. O muco secretado aparece de maneira esporádica e descontínua em todo o lúmen, ressaltando a importância da análise volumétrica em relação às abordagens bidimensionais tradicionais. Este protocolo permite aos pesquisadores obter dados quantitativos absolutos e visualizar a distribuição do muco in situ, oferecendo uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica do muco intestinal em condições fisiológicas e patológicas.

Introduction

O ambiente mucoso do trato gastrointestinal dos mamíferos é altamente dinâmico, apoiando a colonização de uma comunidade microbiana diversificada. O epitélio intestinal consiste em várias células especializadas que colaboram para absorver nutrientes, manter a integridade da barreira e se comunicar com o sistema imunológico¹. Entre estes, as células caliciformes armazenam grânulos de mucina e secretam muco no lúmen em condições de estado estacionário. Esse muco forma uma barreira física crítica, impedindo o contato microbiano direto com a camada epitelial, modulando a inflamação tecidual e mantendo a homeostase ....

Protocol

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Chang Gung. A instalação de animais da Universidade Chang Gung é credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Não foram observadas preocupações com a saúde animal nesses estudos.

1. Preparação da base de fixação

1. Misture o pó de agarose com ddH₂O até uma concentração de 4% (p / v) em um frasco para micro-ondas. Microondas por 2-3 min até ferver sem bolhas minúsculas.
   NOTA: O volu....

Results

Neste método, quantificamos o volume de muco intestinal a partir de imagens empilhadas de tecidos inteiros adquiridos por microscopia multifotônica. Os tecidos intestinais foram corados com faloidina fluorescente e aglutinina de gérmen de trigo (WGA) para visualização de F-actina celular e muco, respectivamente^15,16. Nos tecidos ileal e colônico tratados com PBS, o muco WGA⁺ foi detectado principalmente dentro das células caliciformes na superfície epi.......

Discussion

Aqui, apresentamos um método para quantificação tridimensional do muco intestinal usando coloração de tecido de montagem total, microscopia multifóton e análise com o software Imaris. Este procedimento permite a observação da distribuição descontínua do muco no lúmen intestinal e fornece uma medição absoluta do volume de muco.

A distribuição descontínua de muco após a estimulação também foi observada em sistemas de cultura de tecidos de explantes

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm de prato	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Cloreto de carbamoilcolina ≥ 98% (titulação), cristalino	SIGMA	SI-C4382-1G
Fio de cobre (novo)	FIO TOP TECH & INDÚSTRIA DE CABOS	IW00125	Fio de cobre sem camada isolante
Fórceps	Shineteh	ST-M110
Gaze, estéril	GMTH	Maio-40
GraphPad Prism 8	GraphPad Software
Bolsa térmica	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	INSTRUMENTOS OXFORD
Paraformaldeído	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Sondas de Marcagem de Faloidinas	Invitrogen	A12379
Tesoura	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Conjugados da Aglutinina do Germe de Trigo (WGA)	Biotium	29027
Zeiss 7MP com objetivo de imersão em água W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), laser de femtossegundo Spectra-Physics Mai Tai HP ti safira (sem módulo DeepSee) com detectores BP500 nm-550 nm e BP565 nm-610 nm, e comprimento de onda laser de 750 nm			plataforma de imagem usada para adquirir pilhas 3D com uma lente objetiva de alto NA para imagem de tecidos profundos; uma fonte de excitação para microscopia multifóton ajustada para um comprimento de onda de 750 nm