Artigo de método

Produção de Microbolhas Estabilizáveis Monodispersas Revestidas com Fosfolipídios à Temperatura Ambiente Usando um Dispositivo de Foco de Fluxo Microfluídico

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 de outubro de 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um método para produzir microbolhas revestidas com fosfolipídios monodispersos usando um dispositivo de foco de fluxo microfluídico à temperatura ambiente, incluindo como preparar a formulação do revestimento fosfolipídico.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As microbolhas monodispersas demonstraram um potencial significativo no aumento da eficácia dos agentes de contraste de ultrassom para aplicações terapêuticas e de imagem. Essas microbolhas podem ser produzidas diretamente usando um método de foco de fluxo microfluídico, que permite um controle preciso sobre seu tamanho. No entanto, evitar a coalescência durante a produção continua sendo um desafio crítico. Embora temperaturas de produção elevadas (por exemplo, 55 °C) possam suprimir a coalescência, tais condições complicam o design do dispositivo microfluídico e podem ser incompatíveis com agentes direcionados e conjugados de medicamentos. Este protocolo descreve um método para produzir microbolhas revestidas com fosfolipídios monodispersos à temperatura ambiente, com a estabilidade e monodispersidade das microbolhas mantidas por pelo menos 7 dias. O protocolo também descreve a fabricação de chips microfluídicos PDMS reutilizáveis e a preparação da formulação de revestimento fosfolipídico contendo o surfactante Pluronic F68. Nossos achados mostram que as microbolhas produzidas usando esse método mantêm seu tamanho e estabilidade ao longo de 7 dias, apoiando sua aplicabilidade futura em ambientes clínicos onde agentes de contraste de ultrassom estáveis e controláveis são essenciais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os agentes de contraste ultrassônico (UCA) são amplamente utilizados em ecografia clínica e aplicações terapêuticas 1,2,3. Administradas por via intravenosa, essas microbolhas permanecem confinadas no sistema vascular, atuando como agentes de pool sanguíneo 4,5. Uma concha estabilizadora reveste as microbolhas e reduz a difusão do gás impulsionada pela pressão de Laplace, prolongando assim a vida útil da microbolha 3,6. Quando expostas ao ultrassom, as microbolhas começam a oscilar e produzem ecos fortes devido à compressibilidade do núcleo gasoso 7,8. A oscilação é mais pronunciada na frequência de ressonância da microbolha, que é influenciada pelo tamanho da microbolha e pelas propriedades da casca 9,10,11. A ACU clinicamente aprovada geralmente consiste em microbolhas polidispersas com uma ampla distribuição de tamanho, geralmente variando de aproximadamente 0,5 a 10 μm de diâmetro 12,13,14. Essa ampla distribuição de tamanho leva a uma ampla gama de frequências nas quais essas microbolhas são ressonantes. Dado que as sondas de ultrassom clínico normalmente operam em uma largura de banda de frequência estreita, apenas um subconjunto da população UCA ressoa efetivamente15. As microbolhas monodispersas, que têm uma distribuição de tamanho estreita (por exemplo, PDI 3 ~ 10% 16 , 17), demonstraram aumentar o diagnóstico e a terapia em comparação com as microbolhas polidispersas. Para imagens de ultrassom com contraste, a intensidade aumentou em duas a três ordens de magnitude18, enquanto a sensibilidade para detecção de pressão não invasiva por meio de sinais sub-harmônicos foi quase dobrada 19,20,21, e a eficiência de entrega de medicamentos foi aumentada em quase uma ordem de magnitude 22. Consequentemente, a produção de microbolhas monodispersas com uma distribuição de tamanho estreita e, portanto, resposta acústica é fundamental para maximizar seu potencial para imagens de ultrassom e aplicações terapêuticas, onde as oscilações controladas de microbolhas são críticas.

As microbolhas monodispersas podem ser produzidas por meio de vários métodos, como decantação23, filtração mecânica24 e centrifugação de um agente de microbolhas polidispersas25. No entanto, alcançar um controle de tamanho preciso e alta monodispersidade continua sendo um desafio com essas técnicas26. Uma abordagem alternativa e mais controlada é a produção direta de microbolhas monodispersas usando um dispositivo de foco de fluxo microfluídico. Nesse processo, um fio de gás é focado entre dois fluxos de lipossomas aquosos em um chip microfluídico, levando a um pinçamento reprodutível do fio de gás, o que permite a produção em alta velocidade de microbolhas monodispersas no tamanho desejado27. Embora os métodos de focalização de fluxo tenham sido amplamente utilizados para a produção de gotículas monodispersas28,29, sua aplicação na produção de microbolhas monodispersas é menos comum devido à dificuldade de prevenir a coalescência e manter adequadamente a estabilidade a longo prazo em termos de tamanho, monodispersidade e concentração30. A coalescência, onde várias microbolhas se fundem em outras maiores, afeta a monodispersão. Foi demonstrado que temperaturas de produção elevadas reduzem a coalescência31, mas isso complica o projeto do sistema microfluídico e pode não ser adequado para formulações envolvendo agentes direcionados ou conjugados de medicamentos. Portanto, produzir microbolhas monodispersas à temperatura ambiente seria vantajoso. Igualmente importante é o método de armazenamento dessas microbolhas monodispersas, pois as microbolhas revestidas com fosfolipídios tendem a encolher, colapsar e perder sua monodispersidade ao longo do tempo32. Garantir a estabilidade a longo prazo, durante vários dias, durante o armazenamento é fundamental para traduzir a tecnologia de microbolhas monodispersas em aplicações clínicas.

Neste protocolo, descrevemos um método para a produção de microbolhas monodispersas revestidas com fosfolipídios usando uma plataforma microfluídica de foco de fluxo à temperatura ambiente. Este método é compatível com taxas de fluxo de lipídios que variam de 13-42 μL/min e é projetado para uso em temperatura ambiente, tornando-o adequado para laboratórios que não possuem controle de temperatura em seu sistema microfluídico. O protocolo utiliza uma formulação fosfolipídica composta por 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carbonil-metoxipolietilenoglicol] (DPPE-PEG5000) e Pluronic F68, o que garante estabilidade e reprodutibilidade. O protocolo fornece instruções passo a passo sobre a fabricação de chips microfluídicos PDMS reutilizáveis, preparação das soluções de revestimento fosfolipídico e incorporação do surfactante Pluronic F68 para evitar a coalescência de microbolhas durante a produção à temperatura ambiente. Ele também detalha os procedimentos para limpar o sistema microfluídico para evitar o entupimento do bico, ajustar a pressão do gás e a taxa de fluxo de líquido para controlar o tamanho das microbolhas e coletar e armazenar as microbolhas produzidas para estabilidade a longo prazo. Este método oferece uma abordagem prática para gerar microbolhas monodispersas estáveis com controle preciso de tamanho à temperatura ambiente.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fazendo filmes lipídicos

NOTA: A mistura lipídica para a produção de microbolhas monodispersas é formulada com uma mistura binária de DSPC e DPPE-PEG5000 a uma razão molar de 90:10. O DSPC foi escolhido como o principal lipídio porque demonstrou fornecer estabilidade superior contra a dissolução gasosa em microbolhas polidispersas33,34 e monodispersas31. Supõe-se que essa estabilidade aprimorada resulte de sua temperatura de transição de fase cristalina gel-líquido relativamente alta de 55 ° C35, que é maior do que a de outros lipídios comumente usados, como DPPC (~ 41 ° C) 35, levando assim a uma camada lipídica mais rígida e impermeável à temperatura ambiente36. Aqui, é demonstrado um exemplo de preparação de uma solução de revestimento fosfolipídico de 3 mL. Para atingir uma concentração final de fosfolipídios de 20 mg / mL, que é uma concentração típica para a produção de microbolhas monodispersas,são necessários 16,17, 60 mg de fosfolipídios. A quantidade desejada de cada componente fosfolipídico é dada na Tabela 1.

  1. Retirar o fosfolipídio do congelador a -20 °C e deixar descongelar à temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Pesar o pó lipídico necessário em balões volumétricos separados de 2 ml.
  3. Preparar 100 ml de uma mistura de clorofórmio:solvente metanol a 90:10 v/v numa hotte, medindo 90 ml de clorofórmio com uma proveta graduada de vidro de 100 ml e transferindo-a para um Erlenmeyer de vidro de 250 ml. Em seguida, meça 10 mL de metanol usando o cilindro medidor de vidro de 100 mL e despeje no Erlenmeyer de vidro de 250 mL que já contém o clorofórmio. Feche o Erlenmeyer de vidro com uma rolha de vidro e misture os dois solventes girando suavemente o Erlenmeyer até que a solução fique límpida.
    CUIDADO: Clorofórmio e metanol são produtos químicos tóxicos. O clorofórmio é um potencial cancerígeno e pode causar irritação respiratória, cutânea e ocular. O metanol é altamente inflamável, tóxico se inalado, ingerido ou absorvido pela pele e pode causar cegueira se ingerido. Trabalhe sempre com misturas de clorofórmio/metanol em uma capela de exaustão bem ventilada para evitar a inalação de fumaça. Use equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas, óculos de segurança e jaleco. Certifique-se de que não haja chamas abertas ou fontes de ignição ao manusear metanol. Descarte os resíduos de solventes de acordo com os protocolos de resíduos perigosos da instituição.
  4. Para dissolver completamente os pós lipídicos pesados na Etapa 1.2, adicione mL da mistura de clorofórmio / metanol a cada frasco de vidro volumétrico de 2 mL e feche rapidamente a tampa de vidro para evitar a evaporação.
    NOTA: Certifique-se de que o pó lipídico esteja totalmente dissolvido. Se necessário, rode suavemente o balão para facilitar a dissolução.
  5. Misture as soluções lipídicas dissolvidas em um frasco de vidro de 30 mL, despejando cada solução sequencialmente.
  6. Evapore o solvente sob um fluxo constante de gás argônio, girando o frasco para garantir uma distribuição uniforme do filme lipídico na superfície do vidro.
    NOTA: Os traços finais do solvente podem ser difíceis de evaporar usando apenas gás argônio. Deixar o frasco para injetáveis na hotte durante 2 h para permitir uma secagem adicional. Se o gás argônio não estiver disponível, o gás nitrogênio37 ou um evaporador rotativo a vácuo operado a 6 °C31,38 (ou seja, acima da temperatura de transição de fase do DSPC de 55 °C35) pode ser usado para evaporar o solvente clorofórmio/metanol.
  7. Após a evaporação do solvente, sujeite a mistura lipídica ao vácuo para eliminar quaisquer resíduos de solvente orgânico restantes. Sele o frasco de vidro com uma camada de parafilme e faça vários orifícios com uma agulha para permitir o fluxo de ar durante o vácuo.
    NOTA: O objetivo do uso de parafilme é evitar que o lipídio se disperse para fora do frasco de vidro durante o processo de liofilização.
  8. Coloque os frascos em um liofilizador sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente orgânico residual.
  9. Prossiga para a próxima etapa ou armazene o filme lipídico a -20 ° C até que seja necessário.
    NOTA: Nenhuma etapa de centrifugação é usada nesta seção ou em outro lugar do protocolo.

2. Fabricação de chips microfluídicos com foco de fluxo

NOTA: As microbolhas monodispersas são produzidas usando um chip microfluídico de foco de fluxo, conforme ilustrado na Figura 1A. Um esquema da geometria do canal microfluídico, incluindo as dimensões do bico e da saída, é fornecido na Figura Suplementar S1. Um protocolo de fabricação detalhado para fotolitografia baseada em SU-8 usado para preparar esses moldes foi descrito anteriormente37 e pode ser encontrado como Informações Suplementares a este protocolo. O processo de fabricação do chip PDMS é descrito nas etapas a seguir.

  1. Misture a base de PDMS (23 g) e o agente de cura (2,3 g) em uma proporção de peso de 10:1 para obter um total de 25,5 g de PDMS.
  2. Coloque o molde mestre em uma placa de Petri e despeje a mistura PDMS sobre ele.
  3. Desgaseifique a mistura sob vácuo (2 ~ 7 mbar) por 40 min para remover as bolhas de ar presas.
    NOTA: Para volumes maiores, pode ser necessário um tempo de desgaseificação mais longo para garantir a remoção completa da bolha.
  4. Coloque o molde em uma placa quente a 75 °C por 1 h.
    NOTA: Para volumes maiores, pode ser necessário um tempo de cura mais longo.
  5. Deixe o PDMS esfriar até a temperatura ambiente. Usando um bisturi, corte cuidadosamente ao redor do PDMS curado e retire-o para liberar o chip.
  6. Corte o chip PDMS no tamanho desejado e perfure os orifícios de entrada/saída usando um punção de 1 mm.
  7. Limpe o chip PDMS com fita adesiva para remover partículas de poeira.
  8. Limpe o chip PDMS e a lâmina de vidro com isopropanol, seguido de água deionizada.
  9. Cole o PDMS à lâmina de vidro tratando-o em um limpador de plasma de ar por 1 min a 60% da potência (60 W).
  10. Coloque o cavaco colado em uma placa quente a 95 °C por 3 min para melhorar a colagem.
  11. Deixe o chip PDMS esfriar até a temperatura ambiente. O chip totalmente fabricado é mostrado na Figura 1C, e uma imagem microscópica de campo brilhante do bico é mostrada na Figura 1D.
  12. Coloque o chip colado no limpador de plasma por 5 min a 80% da potência (80 W) para restaurar a hidrofilicidade da superfície do canal microfluídico.
  13. Encha imediatamente o chip com água Milli-Q para preservar a hidrofilicidade.
  14. Armazene os chips em temperatura ambiente em água Milli-Q até o uso.

3. Preparação da solução de revestimento fosfolipídico

  1. Retire a película lipídica preparada do congelador a -20 °C e descongele à temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Adicione 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida (55 ° C) ao filme lipídico (60 mg) para atingir uma concentração lipídica final de 20 mg / mL. Coloque os frascos em banho-maria a 55 °C por 40 min, agitando a cada 15 min em velocidade média (nível 3 de 5 no misturador de vórtice).
    NOTA: Esta etapa serve para pré-dissolver e dispersar uniformemente os componentes lipídicos em PBS antes da sonicação na etapa 3.5. Esta temperatura é a temperatura de transição de fase do DSPC39, promovendo solubilização parcial e reduzindo a agregação lipídica. Embora a sonicação na etapa 3.6 seja necessária para atingir a clareza óptica total, a incubação térmica preliminar facilita uma sonicação mais eficiente e reprodutível, minimizando a formação de grandes agregados lipídicos e aumentando a homogeneidade da dispersão.
  3. Adicione 0,43 mL de solução de Pluronic F68 à mistura lipídica para atingir uma concentração molar de 10%, ou seja, DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Depois, a amostra deve se parecer visualmente com a Figura 2A, que é uma solução turva.
    NOTA: O Pluronic F68 é um surfactante usado para evitar a coalescência durante a produção de microbolhas monodispersas16,40. Na ausência de Pluronic F68, microbolhas monodispersas não podem ser formadas usando o dispositivo microfluídico Horizon37e a formulação lipídica descrita neste protocolo16. Nenhum propilenoglicol foi usado na formulação lipídica, pois foi relatado que este composto compromete tanto a monodispersidade quanto a estabilidade da suspensão de microbolhas monodispersas resultante38.
  4. Para a preparação de microbolhas monodispersas marcadas com fluorescência, incorpore um corante lipídico, como um corante de carbocianina lipofílico , na mistura nesta fase.
  5. Sonicar a mistura lipídica em banho-maria a 100% da potência por 20 min, mantendo a temperatura da água a 55 °C. A solução lipídica deve se assemelhar à Figura 2B após 20 min, que é uma solução menos turva do que na etapa 3.4. Continue a sonicação em intervalos de 10 minutos até que a solução esteja límpida, conforme mostrado na Figura 2C.
    NOTA: Para a solução na Figura 2C, foram necessários 30 minutos de sonicação para obter uma solução clara. A caracterização da solução lipídica pode ser realizada medindo o tamanho do lipossomo usando, por exemplo, um espalhador de luz dinâmico.
  6. Deixe a solução lipídica esfriar até a temperatura ambiente antes de continuar o processamento.

4. Preparação do frasco de coleta de microbolhas

NOTA: Para garantir o armazenamento a longo prazo de microbolhas monodispersas, é necessário um frasco médico à prova de gás como frasco de coleta.

  1. Feche um frasco para injetáveis de vidro de 5 ml com uma rolha de borracha e encha o frasco para injetáveis com gás C4F10 . Em seguida, prenda uma tampa de alumínio ao redor do frasco para garantir a estanqueidade ao gás. O frasco de coleta está pronto para uso.

5. Preparação da plataforma microfluídica

NOTA: Conforme ilustrado na Figura 3A, o sistema compreende a plataforma microfluídica Horizon37 (doravante denominada 'plataforma microfluídica'), um computador para controle, uma câmera de alta velocidade para monitorar o processo de produção, uma fonte de luz externa de diodo emissor de luz (LED) para iluminação durante imagens de alta velocidade e um gerador de forma de onda de função para acionar imagens de alta velocidade em intervalos específicos durante a produção. Antes de iniciar a produção de microbolhas, o dispositivo deve ser limpo para reduzir a probabilidade de entupimento do bico. O procedimento de limpeza envolve tanto a tubulação quanto o chip microfluídico.

  1. Procedimento de limpeza da tubulação
    1. Ligue o interruptor de alimentação da plataforma microfluídica, que está localizada no lado direito (Figura 3A).
      NOTA: O "interruptor de alimentação" refere-se à unidade de controle de energia principal da plataforma Horizon, que ativa o microcontrolador interno, as bombas e os sensores do sistema.
    2. Coloque um frasco de vidro de 4 mL cheio de etanol a 70% no lado esquerdo da câmara da bomba P da plataforma microfluídica (Figura 3). Inicie o fluxo de líquido a 100 μL / min para que a tubulação de entrada de líquido seja lavada com o etanol a 70% do frasco. Pare a lavagem interrompendo o fluxo de líquido após 5 min.
      NOTA: A bomba P refere-se à unidade de fornecimento de gás controlada por pressão integrada ao sistema microfluídico. Esta etapa destina-se apenas à limpeza da tubulação; A tubulação não deve ser conectada ao chip microfluídico neste estágio. Este processo remove poeira solúvel em etanol e contaminantes do sistema fluídico.
    3. Substitua o frasco cheio de etanol por um frasco cheio de água Milli-Q.
    4. Lave a tubulação com água Milli-Q a 100 μL/min por 5 min para remover qualquer etanol residual do sistema.
  2. Procedimento de limpeza de cavacos
    1. Ligue o interruptor de luz LED interno da plataforma microfluídica.
    2. Insira o chip PDMS no suporte.
    3. Posicione o coletor sobre o chip e prenda-o usando a roda ajustável.
    4. Conecte a tubulação de gás, líquido e saída ao chip PDMS usando uma pinça. A configuração da conexão é mostrada na Figura 3B. Certifique-se de que a tubulação de saída leva a um frasco para coletar a solução residual do processo de limpeza.
    5. Ajuste a plataforma para posicionar o bico do chip dentro do campo de visão da objetiva.
    6. Limpe o cavaco com água Milli-Q por 5 min usando uma pressão de gás de 1000 mbar e uma vazão de líquido de 100 μL/min. Primeiro inicie o fluxo de gás e, em seguida, siga com o fluxo de líquido.
      NOTA: Esta etapa é para limpar o chip microfluídico a montante do bico.
    7. Pare o fluxo de líquido, seguido pelo fluxo de gás.
    8. Reconecte a tubulação de gás e saída conforme mostrado na (Figura 3C).
    9. Repita o procedimento de lavagem com água Milli-Q por mais 5 min, usando uma pressão de gás de 1000 mbar e uma vazão de líquido de 50 μL/min. Primeiro inicie o fluxo de gás e, em seguida, siga com o fluxo de líquido.
      NOTA: Esta configuração limpa o chip microfluídico a jusante do bico.
    10. Pare o fluxo de líquido, seguido pelo fluxo de gás. O chip PDMS agora está pronto para a produção de microbolhas.

6. Configuração de imagens de alta velocidade

NOTA: Para monitorar e controlar a produção de microbolhas monodispersas, recomenda-se integrar uma câmera de alta velocidade com a plataforma microfluídica, pois a microbolha será produzida a uma taxa de produção superior a 105 microbolhas/s. A câmera de alta velocidade permite a medição do tamanho e da taxa de produção das microbolhas no chip, bem como o monitoramento da coalescência das microbolhas no chip.

  1. Monte uma fonte de luz LED acima da plataforma de montagem (Figura 3A) para iluminar o chip microfluídico durante a geração de imagens de alta velocidade.
  2. Acople a câmera de alta velocidade à porta de imagem lateral da plataforma microfluídica.
  3. Utilize um gerador de forma de onda de função externa para acionar gravações de alta velocidade em intervalos de 10 s durante toda a duração da produção de microbolhas. Conecte a saída de disparo TTL do gerador de forma de onda à entrada de disparo externa da câmera de alta velocidade usando um cabo BNC padrão para garantir a aquisição sincronizada. Esse monitoramento é necessário para avaliar a forma do fio de gás e a estabilidade do tamanho das microbolhas durante a produção.
    NOTA: O monitoramento contínuo é importante, pois pode ocorrer entupimento durante a produção. Além disso, as sequências de imagens de alta velocidade são usadas para extrair distribuições de tamanho de microbolhas no chip resolvidas no tempo. Este intervalo de 10 s pode ser ajustado dependendo dos requisitos do usuário.

7. Produção e caracterização de microbolhas monodispersas

  1. Antes de iniciar a produção, configure o frasco coletor conforme mostrado na Figura 4A. Passe uma agulha pela rolha de borracha para servir como agulha de coleta e outra agulha pela rolha como agulha de ventilação, com a ponta da agulha posicionada perto do fundo do frasco. Mantenha o frasco coletor invertido usando um clamp durante a produção.
    NOTA: A agulha de ventilação garante pressão constante dentro do frasco durante a coleta. Como C4F10 é mais pesado que o ar, ele não sai espontaneamente do frasco.
  2. Carregue a solução fosfolipídica preparada na bomba P da plataforma microfluídica.
  3. Mova a parte do bico do chip para o campo de view da objetiva.
    NOTA: A plataforma microfluídica inclui um módulo óptico interno com zoom e foco ajustáveis e um acoplador externo de montagem F para conectar uma câmera de alta velocidade.
  4. Para iniciar a produção de microbolhas, defina a pressão do gás para 800 mbar e a vazão do líquido para 40 μL/min.
    NOTA: A plataforma microfluídica integra dois canais de líquido controlados por fluxo, 1-5 μL/min à esquerda e 1-100 μL/min à direita, e um canal de gás controlado por pressão. Neste protocolo, foram utilizados o canal de líquido de 1-100 μL/min e o canal de gás controlado por pressão.
  5. Uma vez que o líquido atinge o bico, o fio de gás se solta e libera microbolhas monodispersas pela saída (Figura 4A).
  6. Defina a gravação de alta velocidade para uma taxa de quadros de ≥ 200.000 fps e use gravações de alta velocidade para medir o tamanho das microbolhas produzidas por meio da função imfindcircles no MATLAB.
  7. Ajuste a pressão do gás e a vazão do líquido para controlar o tamanho da microbolha.
    NOTA: Depois de ajustar a taxa de fluxo e/ou a pressão do gás, use o script MATLAB para traçar a distribuição do tamanho no chip a partir da gravação de alta velocidade. Ajustando a distribuição de tamanho com uma distribuição gaussiana, a μ média e o desvio padrão σ podem ser derivados. O μ representa o tamanho no chip das microbolhas monodispersas produzidas. A coalescência de microbolhas pode ocorrer no estágio inicial de produção devido à água residual de Milli-Q na tubulação, que dilui a concentração de lipídios. Esse problema geralmente é resolvido quando a solução lipídica não diluída atinge o bico. A Tabela 2 resume os diâmetros de microbolhas resultantes para várias taxas de fluxo aplicadas a uma pressão de gás constante de 800 mbar; Várias combinações de pressão de gás e vazão de líquido podem produzir tamanhos de microbolhas semelhantes, embora diferentes combinações de parâmetros também influenciem a taxa de produção. A uma taxa de fluxo de gás constante, sabe-se que a taxa de produção está positivamente correlacionada com as taxas de fluxo de líquido41. A taxa de produção de microbolhas neste protocolo é da ordem de ~ 105 microbolhas por segundo, com base em uma análise quadro a quadro das gravações de alta velocidade, o que é consistente com valores relatados anteriormente para geometrias de foco de fluxo semelhantes37.
  8. Uma vez alcançado o tamanho desejado das microbolhas, colete as microbolhas produzidas conectando o tubo de saída ao frasco coletor.
  9. Durante a coleta, defina a gravação de alta velocidade para disparar a cada 10 s para monitorar o processo de produção.
    NOTA: O intervalo entre as gravações pode ser ajustado com base em requisitos específicos.
  10. Após a coleta de suspensão de microbolhas suficiente, remova a agulha de ventilação e a agulha coletora do frasco coletor.
  11. Pare o fluxo de líquido, seguido pelo fluxo de gás.
  12. Armazene as microbolhas coletadas na vertical em temperatura ambiente, garantindo que o frasco fique minimamente agitado mecanicamente.
    NOTA: A solução de microbolhas terá três camadas, conforme mostrado na Figura 5A: uma camada de espuma, uma camada de microbolhas monodispersas e um subnadante. É melhor deixar a camada de espuma no frasco, pois estudos anteriores relataram que as bolhas associadas à espuma podem encolher gradualmente para um tamanho monodisperso16,38. As microbolhas produzidas usando este protocolo não foram submetidas a avaliação de segurança regulatória. No entanto, os lipídios constituintes (DSPC, DPPE-PEG5000) e surfactante (Pluronic F68) são comumente usados em formulações injetáveis aprovadas pela FDA e são considerados biocompatíveis42,43. É necessária uma avaliação pré-clínica adicional para estabelecer a segurança para uso médico.
  13. 2 h após a produção (ou seja, 2 h após a produção das microbolhas monodispersas), caracterize o tamanho final e a concentração das microbolhas usando uma máquina de caracterização de partículas.
    NOTA: As microbolhas monodispersas produzidas pelo método de focalização de fluxo requerem aproximadamente 90 min para se estabilizar em seu tamanho final44. Portanto, recomenda-se permitir pelo menos 2 h de estabilização antes de usar as microbolhas.
  14. Encaixe uma agulha de 19 G numa seringa de ml
  15. Insira uma agulha separada de 19 G no frasco para injetáveis de microbolhas como uma agulha de ventilação. Certifique-se de que a ponta da agulha permaneça perto do topo do frasco para permitir a entrada de ar e manter a pressão interna durante a extração de microbolhas.
  16. Agite suavemente o frasco para homogeneizar a suspensão. A suspensão se separará em três camadas: uma camada superior de espuma, uma camada intermediária contendo microbolhas monodispersas e uma camada aquosa inferior.
  17. Insira rapidamente a seringa de extração e posicione cuidadosamente a ponta da agulha no meio da camada de microbolhas monodispersas, evitando a espuma e a camada inferior do sobrenadante aquoso. Retire o volume desejado de suspensão de microbolhas e remova a seringa de extração do frasco. Quando a extração de microbolhas estiver concluída, remova a agulha de ventilação.

8. Procedimento de limpeza e desligamento

NOTA: Após a produção de microbolhas, a plataforma microfluídica e o chip devem ser completamente limpos para garantir o funcionamento adequado e permitir a reutilização do chip. As etapas a seguir descrevem o processo de limpeza.

  1. Para o chip, proceda da seguinte forma:
    1. Substitua o frasco para injetáveis lipídicos por um frasco para injetáveis de água Milli-Q.
    2. Lave o chip microfluídico usando uma pressão de gás de 800 mbar e uma taxa de fluxo de líquido de 40 μL/min por 5 min.
    3. Pare o fluxo de líquido primeiro, seguido pela interrupção do fluxo de gás.
    4. Desconecte apenas a tubulação de entrada de gás do chip microfluídico.
    5. Encha o chip microfluídico com água Milli-Q para manter a hidrofilicidade das superfícies internas.
    6. Pare o fluxo de líquido e desconecte toda a tubulação restante do cavaco.
    7. Armazene o chip em água Milli-Q até que seja necessário para uso futuro.
  2. Para o sistema microfluídico, proceda da seguinte forma:
    1. Substitua o frasco de água Milli-Q por um frasco de etanol a 70% na plataforma microfluídica.
    2. Lave a tubulação de entrada de líquido com etanol a 70% a uma taxa de fluxo de 100 μL/min por 5 min para remover quaisquer resíduos lipídicos.
    3. Substitua o frasco de etanol por um frasco de água Milli-Q na P-Pump1.
    4. Lave a tubulação com água Milli-Q a 100 μL/min por 5 min para remover qualquer etanol residual do sistema. O sistema agora está limpo.
    5. Desligue a plataforma microfluídica e o sistema de câmeras de alta velocidade.

9. Etapas de solução de problemas

  1. Bloqueio do bico
    NOTA: Dado o pequeno tamanho do bico (5 μm), podem ocorrer bloqueios durante o processo de produção. Para limpar o bloqueio, siga as etapas abaixo.
    1. Pare imediatamente o fluxo de líquido, seguido pelo fluxo de gás.
    2. Reconecte a tubulação de acordo com a configuração mostrada na Figura 3B.
    3. Substitua o frasco cheio de fosfolipídios por um frasco cheio de água Milli-Q em P-Pump1.
    4. Aplique uma pressão de gás de 1000 mbar e ajuste a vazão do líquido para 100 μL/min por 5 min para lavar o bico.
      NOTA: Na maioria dos casos, os bloqueios são eliminados após um enxágue de 5 minutos. No entanto, se o bloqueio persistir, pode ser necessário substituir o chip PDMS por um novo.
    5. Assim que o bloqueio for eliminado, reconecte a tubulação conforme indicado na Figura 3C.
    6. Lave o cavaco novamente com água Milli-Q por 5 min, usando uma pressão de gás de 1000 mbar e uma vazão de líquido de 50 μL/min para garantir a folga completa.
    7. Substitua o frasco cheio de água Milli-Q pelo frasco cheio de fosfolipídios na P-Pump1 e retome a produção de microbolhas.
      NOTA: Se os bloqueios persistirem durante a produção, isso pode indicar limpeza insuficiente da tubulação ou chip microfluídico. Nesse caso, desconecte a tubulação do chip e siga o procedimento de limpeza descrito na etapa 5. Se os bloqueios continuarem a ocorrer após a limpeza completa de todo o sistema, isso pode sugerir uma falha do filtro interno na plataforma microfluídica. Substituir o filtro por um novo pode resolver o problema.
  2. Reutilize o chip microfluídico, se desejar.
    NOTA: Se o chip não for armazenado corretamente, ele pode perder hidrofilicidade. Se isso ocorrer, o aperto do fio de gás pode se assemelhar ao padrão mostrado na Figura 5E. Nesses casos, é recomendável mudar para um novo chip hidrofílico para garantir uma produção consistente e confiável de microbolhas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, apresentamos um método para produzir microbolhas estáveis e monodispersas à temperatura ambiente usando um chip microfluídico de foco de fluxo. O chip PDMS é fabricado por fundição a partir de um molde mestre, conforme mostrado na Figura 1. Para unir o chip PDMS a uma lâmina de vidro, o tratamento com plasma é empregado. O tratamento com plasma é crucial, pois altera a superfície do PDMS de hidrofóbica para hidrofílica. Essa hidrofilicidade é essencial para manter a forma e ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve em detalhes como produzir e armazenar microbolhas monodispersas estáveis à temperatura ambiente usando um chip de foco de fluxo microfluídico. A microbolha monodispersa pode ser usada para imagens de ultrassom com contraste18, detecção de pressão não invasiva19 e administração de medicamentos mediada por microbolhas22, tanto in vitro quanto in vivo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado em parte pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia (Grant Agreement 805308) e em parte pelo Applied and Engineering Sciences TTW (VIDI-project 17543), parte da NWO, ambos concedidos a K.K. A Plataforma Microfluídica Horizon foi desenvolvida com financiamento de doações do EPSRC (Grant Nos. EP/I000623 e EP/K023845). Os autores agradecem ao Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) da Universidade de Leeds pelas discussões úteis, bem como a Stuart Weston e Andrew Price por sua ajuda na conceituação do instrumento e na produção de peças para a Horizon Microfluidic Platform. O molde mestre para a fabricação dos chips PDMS foi gentilmente cedido pela Universidade de Leeds. Os autores agradecem a Robert Beurskens, do Departamento de Engenharia Biomédica, Departamento de Cardiologia, e Geert Springeling, do Departamento de Instrumentação Médica Experimental, ambos do Erasmus MC, Holanda, pela assistência técnica durante os experimentos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
punção de biópsia de 1 mm Kai Médico143831
1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina (DiD)Thermo Fisher ScienticD307um corante de carbocianina lipofílico
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carbonil-metoxipolietilenoglicol] (DPPE-PEG5000)LipoideNº CAS. 384835-61-4
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)LipoideNº CAS. 816-94-4
Cilindro medidor de vidro de 100 mLBLAUBRAND
Balões de vidro volumétricos de 2 mLBLAUBRAND
Erlenmeyer de vidro de 250 mLBLAUBRAND
Frasco de vidro de 30 mL DWK Ciências da VidaSCERC40752700D0C2
70% de etanol
75 ° Placa de aquecimento C 
Fita adesiva
Tampa de alumínio Sigma-aldrich27016
Gás argônio  Linde Gas Benelux
C4F10 gásF2 Produtos Químicos
ClorofórmioMerck KGaA67-66-3
Clinicamente disponível  agente de contraste ultrassônico (ou seja, microbolhas)Bracco,
Plan-LesOuates, Suíça		SonoVueFigura 6A.
Agulha 19G de coleta e ventilação100 Sterican4657799
Contador de relha Multisizer 3Beckman CoulterMáquina de caracterização de partículas
Agente de contraste de ultrassom feito sob medida (ou seja, microbolhas monodispersas)NAF1-10PFFigura 6A. Produzido conforme descrito por: Wang, Y. et al. Influência do Pluronic F68 na estabilidade do tamanho e no comportamento acústico de microbolhas revestidas com fosfolipídios monodispersos produzidas à temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Agente de contraste de ultrassom feito sob medida (ou seja, microbolhas monodispersas)NAF2-10 PFFigura 6A. Produzido conforme descrito por: Wang, Y. et al. Influência do Pluronic F68 na estabilidade do tamanho e no comportamento acústico de microbolhas revestidas com fosfolipídios monodispersos produzidas à temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Água Demi
Luz LED externaGSVITECGS02370
LiofilizadorMertin Christ GmbHAlfa 1– 2 LD mais
Gerador de forma de onda de funçãoAgilent33220UMA
Frasco de vidro à prova de gásSigma-aldrichZ113964-288EA
Corrediça de vidroVWR631-1552
Câmera de alta velocidadePhotronNova S16
Plataforma microfluídica HorizonUniversidade de Leeds, InglaterraA plataforma está disponível comercialmente e descrita em detalhes em: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Plataforma microfluídica para a produção de microbolhas e nanobolhas terapêuticas. Revisão de Instrumentos Científicos. 92 (7), 074105 (2021).
Laboratório de MatemáticaA MathWorksR2023a
MetanolMerck KGaA67-56-1
Água Milli-Q
Gel PDMSSILGARDSYLGARD®   184
Solução salina tamponada com fosfato (PBS 1x) Gibco10010023
Limpador de plasmaHenniker CientíficoHPT-100
Plurônico F68Thermo Fisher Científico24040032
Rolha de borrachaSigmaZ166065-100EA
TubulaçãoMasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16" OD; 25 pés
Pinça
Vórtice Sigma-aldrichZ654779
Sonicador em banho-mariaEMAGEMMI 30HC

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Microbolhas MonodispersasRevestimento de Fosfolip diosAgentes de Contraste por UltrassomProdu o em Temperatura AmbienteEstabilidade de MicrobolhasChips Microflu dicos de PDMSControle do Tamanho de MicrobolhasSurfactante Pluronic F68Aplica es Terap uticas de Microbolhas
Vídeo em breve

Artigos relacionados