É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

1.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

Neste artigo

Resumo

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Resumo

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia de células precursoras linfóides imaturas e uma das neoplasias malignas mais comuns na infância. Embora as taxas de cura na LLA pediátrica se aproximem de 90%, a recidiva e a resistência aos medicamentos continuam sendo desafios. Nesse contexto, o estudo da biologia do câncer in vivo é essencial, e os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) usando modelos murinos são amplamente utilizados para esse fim. No entanto, os PDXs de amostras recidivantes - ou comparados aos diagnósticos - não avaliam totalmente os mecanismos por trás do início e progressão da recaída. Este protocolo baseia-se na geração de recidivas B-ALL PDX em camundongos, permitindo a coleta de células leucêmicas durante todo o processo de aquisição de resistência aos medicamentos. Animais enxertados com células B-ALL PDX são tratados com uma combinação de quatro drogas comumente usadas na terapia de LLA, representando mecanismos de ação distintos: dexametasona, vincristina, L-asparaginase e daunorrubicina. Após uma fase de indução de remissão de 4 semanas, os animais são monitorados quanto a recaídas durante um período de repouso. O ciclo de tratamento e recaída é repetido até que o tempo de recaída diminua, servindo como um substituto para o aumento da resistência aos medicamentos in vivo. Para explorar os mecanismos subjacentes à recidiva e resistência, as células leucêmicas são coletadas antes e depois de cada ciclo de tratamento para análise fenotípica e genética. Para validar o modelo, diferentes amostras pediátricas de LLA foram testadas, incluindo respondedores bons e ruins, conforme avaliado pela presença de blastos no sangue periférico após 7 dias de corticoterapia e por doença residual mínima (MRD) nos dias 15, 33 e 78/96. Os resultados observados em camundongos foram consistentes com os dados do paciente, confirmando a precisão do modelo em imitar a resposta clínica à quimioterapia. Essa abordagem permite o estudo dinâmico da recidiva e da resistência a medicamentos na LLA-B, apoiando investigações mecanicistas e o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Introdução

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o câncer mais prevalente em crianças. Apesar das altas taxas de cura alcançadas nas últimas décadas, com sobrevida global em 5 anos chegando a 90% em países de alta renda1 e grandes esforços na busca de novas estratégias terapêuticas, em países desenvolvidos, 15% a 20% dos pacientes apresentam recidiva da doença, para os quais a taxa de sobrevida varia entre 30% e 60%, dependendo se a primeira recidiva ocorre precocemente (menos de 18 meses) ou mais tarde (36 meses) após o diagnóstico2, 3. Diante disso, a LLA refratária e recidivante continua sendo um desafio a ser superado. Em termos de diagnóstico, a LLA refratária distingue-se da recidiva pela baixa sensibilidade à quimioterapia, enquanto a LLA recidivante é caracterizada pela recorrência da doença após um período de remissão. Tal como acontece com outros tipos de câncer, a LLA é caracterizada por anormalidades genéticas, incluindo aneuploidias, rearranjos cromossômicos e várias mutações genéticas que estão associadas a diferentes respostas terapêuticas e risco de recidiva4. Como as recidivas da LLA ocorrem com mais frequência em pacientes de alto risco - que já receberam quimioterapia de intensidade máxima - é improvável que ajustes adicionais nas doses ou combinações de medicamentos sejam suficientes. Em vez disso, os esforços devem ser direcionados para identificar os mecanismos subjacentes à resistência e recaída dos medicamentos.

Diante disso, os pesquisadores tentaram entender como a pressão de seleção exercida pela quimioterapia contribui para o surgimento de células resistentes. A maioria da literatura existente atribui a recidiva à propagação de um subclone maligno resistente que já estava presente no momento do diagnóstico5. No entanto, um estudo recente sugere a existência de mecanismos alternativos, como modificações epigenéticas que regulam os programas transcricionais, que também podem contribuir para a recaída6.

Um esforço substancial tem sido dedicado à criação de modelos in vivo precisos para estudar TODAS as recaídas. Camundongos imunodeficientes têm sido usados com sucesso para enxerto de LLA, preservando as características originais da doença 7,8, levando ao desenvolvimento de xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs). Este modelo permite o enxerto e proliferação de células tumorais / leucemias originais em um microambiente compatível. Uma de suas principais vantagens é a capacidade de avaliar a resposta das células transplantadas do LLA à quimioterapia9.

Modelos PDX também foram empregados para imitar e estudar TODAS as recaídas. Por exemplo, um protocolo desenvolvido por Samuels et al.10 usou camundongos não obesos diabéticos/imunodeficientes combinados graves (NOD/SCID) transplantados com células de leucemia de pacientes para investigar mecanismos de resistência a um regime de quimioterapia semelhante à indução. Os autores descreveram o tratamento com vincristina, dexametasona, L-asparaginase e daunorrubicina (VXLD) e forneceram exemplos do número de ciclos de tratamento e do momento da recidiva. No entanto, o modelo se concentrou na análise de células imediatamente após o tratamento - aquelas que sobreviveram à terapia inicial - provavelmente representando doença residual mínima (MRD) em vez de recidiva.

Um estudo mais recente avaliou se o tratamento em curto prazo de NOD transplantado para LLA. Camundongos imunodeficientes Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma ou NSG) podem prever recidiva em pacientes correspondentes11. Amostras de LLA de risco intermediário - de pacientes recidivantes e não recidivantes - foram transplantadas para camundongos e tratadas com um regime semelhante à indução que consiste em vincristina, dexametasona e L-asparaginase (VXL). O tempo para enxerto e as recidivas pós-tratamento foram medidos e comparados. Os resultados sugeriram que esse modelo PDX poderia servir como uma ferramenta prognóstica para prever os resultados dos pacientes. Essa descoberta apóia a utilidade dos modelos de camundongos PDX no estudo da biologia das recaídas de LLA. Por exemplo, células recidivantes poderiam ter sido examinadas em diferentes momentos para descobrir os mecanismos subjacentes à recaída.

Neste manuscrito, apresentamos melhorias no modelo de camundongos PDX para estudar a recidiva da LLA-B. Nosso objetivo é estudar a recorrência da doença e as características das células recidivantes após sua formação por quimioterapia de indução. Um regime de quatro medicamentos, semelhante à indução - vincristina, dexametasona, L-asparaginase e daunorrubicina - foi padronizado, usando a cepa de camundongos NSG. Sabe-se que essa cepa tem limitações em suportar ciclos repetidos de quimioterapia devido à mutaçãoPrkdc scid e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico12. Portanto, o peso corporal dos animais foi monitorado como marcador de toxicidade do tratamento. O modelo de recidiva B-ALL pode ser dividido em três etapas principais: (1) transplante de células LLA em camundongos, visando um limiar de enxerto de 0,2-1% de células CD45⁺ humanas no sangue periférico; (2) 4 semanas de tratamento quimioterápico, seguidas de um período de repouso até a primeira recidiva (R1); e (3) após a detecção de R1, ciclos de tratamento repetidos do tipo indução de 1 semana. As recidivas subsequentes (R2, R3... RN) e o intervalo entre o tratamento e a recidiva (Δt) é registrado. Um encurtamento progressivo de Δt é interpretado como uma indicação de resistência adquirida a medicamentos. Como parte de investigações mais aprofundadas sobre os mecanismos de recidiva, as células B-ALL podem ser coletadas antes e depois de diferentes estágios do protocolo. É importante ressaltar que, dependendo do tempo entre a ocorrência da recidiva e a recuperação celular, os mecanismos inerentes a esse fenômeno podem não ser conservados. Em vista disso, é extremamente importante que as células de recidiva sejam coletadas rapidamente após a confirmação da recidiva. As células coletadas podem ser usadas para futuras análises fenotípicas e genéticas, incluindo avaliações da dinâmica do ciclo celular, migração celular, frequência celular iniciadora de leucemia, alterações cromossômicas e modificações epigenéticas, entre outras.

Para os fins deste artigo, vamos nos concentrar em descrever o modelo de camundongo com recaída. Serão fornecidas informações detalhadas para as três fases experimentais - transplante, tratamento até a primeira recidiva (R1) e tratamento cíclico até múltiplas recidivas (R2, R3...). Esperamos que este modelo permita aos pesquisadores gerar células B-ALL resistentes à quimioterapia a partir de diversos subtipos, permitindo uma investigação mais profunda das alterações celulares e moleculares associadas à recaída. Em última análise, isso pode contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência e facilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes e personalizadas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas e diretrizes éticas da Comissão de Ética no Uso de Animais do Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). As amostras de leucemia utilizadas neste estudo foram obtidas de frascos de biobanco de pacientes atendidos no Centro Infantil Boldrini, que permitiram o uso de suas células por meio de um termo de consentimento livre e esclarecido. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Transplante de células de leucemia e monitoramento de enxerto

  1. Preparação de amostras de leucemia para transplante em camundongos
    1. Descongele amostras previamente criopreservadas de células LLA retiradas do aspirado de medula óssea do paciente. Use um banho-maria regulado para 37°C. Descongele as amostras movendo o criotubo em movimentos circulares.
    2. Transfira a amostra descongelada para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 14 mL de PBS 1x estéril à amostra para lavar as células e remover a solução de criopreservação. Centrifugue o tubo a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante.
  2. Preparação da solução para transplante
    1. Ressuspenda as células descongeladas em PBS 1x estéril. Use 5-10 x 106 células viáveis em um volume de 100 μL de PBS para cada animal a ser transplantado. Mantenha a solução de transplante no gelo até o transplante.
      NOTA: As células foram contadas seguindo o método semiautomático13.
  3. Transplante de camundongos
    1. Selecione NOD masculino ou feminino de 2 meses. Camundongos Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) para transplante de leucemia.
      NOTA: Para manter um desenho experimental homogêneo livre de interferência sexual animal, as amostras de LLA foram transplantadas para ambos os sexos de camundongos, garantindo que todas as leucemias de resposta boa e ruim fossem igualmente representadas em ambos os sexos. Como resultado, descobrimos que os camundongos fêmeas enxertam mais cedo do que os camundongos machos. Considerando que, para evitar possíveis interferências do sexo do camundongo em análises futuras (como cinética de enxerto), sugerimos o uso de apenas um sexo do camundongo ao trabalhar com a mesma amostra de leucemia. Nenhum outro parâmetro foi usado para escolher preferencialmente um sexo em detrimento do outro.
    2. Coloque um rato de cada vez em uma ratoeira segura e aprovada para garantir a contenção adequada do animal. Certifique-se de que a cauda do animal esteja fora da armadilha e facilmente acessível para transplante.
      NOTA: As células de leucemia são transplantadas em camundongos por injeção intravenosa (i.v.). Protocolos estabelecidos utilizam as veias laterais da cauda para esse fim11.
    3. Use luz infravermelha para garantir a expansão adequada das veias. Injete 100 μL da solução de transplante usando uma agulha de injeção estéril, afiada e de uso único. Mantenha os camundongos transplantados em uma instalação específica livre de patógenos. Deixe-os descansar por 15 dias.
      1. Para usar a luz infravermelha, mantenha o animal já contido fora da gaiola e a 30 cm de distância da luz. Dependendo da potência potencial da luz, ajuste o tempo de exposição. Ao usar uma luz de média potência, um período de 5 min é suficiente para garantir a expansão da veia. Deixar a cauda exposta por um período mais longo pode causar queimaduras e estresse ao animal.
      2. Para a injeção, use uma seringa de insulina com uma agulha acoplada, com um volume de 1 mL e um tamanho de agulha de 12,7 mm x 0,33 mm. A especificação da agulha utilizada pode ser encontrada na Tabela de Materiais. Mantenha os camundongos em um regime de ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Além disso, abrigam os animais utilizados neste estudo em uma gaiola de policarbonato âmbar translúcido autoclavável com enriquecimento ambiental para criar ninhos.
  4. Coleta de sangue periférico
    1. Colete uma amostra de sangue periférico de 50 μL de cada camundongo 2 semanas após a inoculação e todas as semanas a partir de então.
    2. Prenda manualmente o animal com a mão esquerda, garantindo que sua cabeça esteja segurada com segurança. Com a mão direita, use uma lanceta estéril, afiada e descartável para perfurar a veia facial do plexo submandibular do animal.
      NOTA: Este é um procedimento potencialmente prejudicial para os ratos e deve ser feito com cuidado.
      1. Certifique-se de que o animal possa respirar facilmente durante a contenção. Fique atento a mudanças na frequência respiratória (falta de ar) e mudanças na cor da boca (não deve ficar roxa ou azul escura). Se o plexo submandibular não for puncionado corretamente, pode ocorrer sangramento no ouvido devido à punção do canal auditivo. Para orientar futuros experimentadores, a Figura Suplementar 1 está disponível para garantir a localização adequada do plexo.
        NOTA: Como alternativa, os sangramentos das veias da cauda também podem ser usados para coletar amostras de sangue.
    3. Após a coleta, não deixe o animal sem vigilância. Deve estar ativo e ileso. Se o camundongo mostrar sinais de queda (cabeça ou corpo) e inatividade, ele deve ser sacrificado. Não exceda o volume de 50 μL, pois quantidades maiores de sangue podem resultar na morte do animal.
    4. Mantenha a amostra de sangue coletada em um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 8 μL de EDTA 50 mM para evitar a coagulação da amostra.
      NOTA: Aqui, usamos uma solução de EDTA previamente preparada como anticoagulante. Se preferir, tubos EDTA de baixo volume disponíveis comercialmente para coleta de sangue também podem ser usados nesta etapa. As amostras de sangue devem ser processadas no mesmo dia.
  5. Preparação de amostras de sangue periférico para processamento
    1. Homogeneizar o sangue com EDTA. Transferir 50 μL da mistura para um tubo de citometria de fluxo.
    2. Prepare uma mistura de anticorpos a ser adicionada a cada amostra, consistindo de anticorpo anti-camundongo CD45 (mCD45), anticorpo anti-humano CD45 (hCD45), anticorpo anti-humano CD19 (hCD19) e estéril 1x PBS como diluente.
  6. Processamento de amostras de sangue
    1. Adicionar 10 μL da mistura de anticorpos a cada amostra de sangue. Homogeneizar batendo suavemente com o dedo indicador. Incubar por 30 min em temperatura ambiente, protegido da luz.
      NOTA: Selecione os anticorpos apropriados descritos acima, considerando os canais disponíveis do citômetro. Para determinar a quantidade de anticorpo usada por amostra, considere realizar uma curva de titulação para cada anticorpo. Os anticorpos utilizados em nosso estudo, os fluorocromos e o volume escolhido para as amostras estão listados na Tabela Suplementar 1. Uma descrição completa dos números de catálogo de anticorpos e nomes de clones está listada na Tabela de Materiais.
    2. Adicione 1 mL de solução comercial de lise de glóbulos vermelhos (RBC) a cada amostra. Homogeneizar vigorosamente com o dedo indicador. Incubar por 15 min em temperatura ambiente, protegido da luz.
      NOTA: A solução de lise usada nesta etapa é uma solução de lise de 10x RBC disponível comercialmente. Se um reagente diferente for usado, o volume de trabalho 1x para lise deve ser ajustado.
    3. Adicione 2 mL de 1x PBS estéril a cada amostra para a primeira etapa de lavagem. Centrifugue amostras a 200 x g (em rotor oscilante) por 5 min à temperatura ambiente. Descarte suavemente o sobrenadante invertendo e seque qualquer líquido restante na parte superior do tubo, enxugando suavemente com papel toalha.
      NOTA: Nas etapas de lavagem, as células leucêmicas serão peletizadas no fundo do tubo do citômetro e o fluido restante será descartado. É imperativo ter cuidado ao manusear as amostras, pois em certos casos, o pellet pode não ser discernível. Para garantir a integridade do pellet, evite agitar a amostra, pois isso pode resultar em sua perda.
    4. Repita a etapa 1.6.3. Ressuspenda as células de leucemia com 200 μL de PBS 1x estéril batendo suavemente no tubo de citometria com o dedo indicador. As amostras estão prontas para serem analisadas por citometria de fluxo. O monitoramento do enxerto deve ser realizado no mesmo dia da coleta de sangue.
  7. Monitoramento de enxerto por citometria de fluxo
    1. Empregar metodologias padrão de citometria de fluxo 9,14 para determinar a porcentagem de células CD45+ humanas no sangue periférico em relação às células CD45+ de camundongos (% hCD45+).
    2. Colete dados gerados por citometria de fluxo para análise subsequente da porcentagem de hCD45+ sobre o total de células CD45 (hCD45+ mais mCD45+) usando o software de análise de citometria de fluxo.
      NOTA: Para garantir o monitoramento adequado do enxerto, as seguintes etapas de análise devem ser realizadas no mesmo dia. Esta sequência diária é particularmente importante quando se considera o início do futuro esquema de tratamento, que sugerimos começar na segunda-feira. Na impossibilidade de iniciar na segunda-feira, o tratamento pode ser iniciado em qualquer dia da semana, dependendo da obtenção do hCD45+% (0,2%-1%) no sangue periférico.
  8. Preparação do ambiente para análise de dados de citometria de fluxo
    1. Inicie o software de análise de citometria de fluxo. Importe os dados coletados e aguarde seu reconhecimento pela ferramenta.
    2. Abra os dados da amostra inicial para criar o portão rotulado Linfócitos. Verifique as configurações do eixo: selecione FSC-A para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. No painel de criação do portão superior, selecione a ferramenta poly-liner e contorne a população de células principal.
      NOTA: Os linfócitos geralmente aparecem entre 50.000-100.000 no eixo X e 0-50.000 no eixo Y. Os valores podem variar dependendo das características de cada leucemia.
    3. Clique duas vezes na população fechada para criar um novo portão. Para excluir dublês de células, defina FSC-A no eixo X e FSC-H no eixo Y. Use a ferramenta poly-liner para isolar a população de células primárias. Desenhe o portão perto da população, excluindo eventos distantes ao longo do eixo X.
      NOTA: Esta etapa distingue eventos de células individuais.
  9. Criando o painel de citometria para distinguir populações de células
    1. Clique duas vezes na População selecionada para diferenciar as células CD45 humanas das de camundongos. Defina o eixo X para o fluoróforo mCD45 e o eixo Y para SSC-A. Usando a ferramenta de forma, desenhe um quadrado ao redor da população negativa para mCD45.
    2. Clique duas vezes na População resultante para distinguir células hCD19+ e/ou hCD45+. Defina o eixo X para o fluoróforo hCD19 e o eixo Y para hCD45. No painel de criação do portão, selecione Linhas perpendiculares para separar as populações distintas.
      NOTA: Como alternativa, o investigador pode usar a porta ou possibilidade para discriminar células hCD45 e mCD45. Essa possibilidade considera a soma dos eventos como 100%, criando uma estratégia mais precisa para a identificação das populações.
  10. Aplicando estatísticas ao painel criado
    1. Calcule a porcentagem de cada população de células isoladas em relação a todos os eventos adquiridos. Na janela principal do software, clique com o botão direito do mouse no ícone Subgraph derivado do gráfico principal de cada exemplo e selecione Create Statistics. Na janela aberta, clique em Frequência de e selecione Células Únicas. Execute esta etapa individualmente para cada subgráfico.
    2. Selecione todas as modificações feitas para aplicar a estratégia de gating e as estatísticas associadas a todas as amostras. Em seguida, usando o botão esquerdo do mouse, arraste as modificações selecionadas para a opção Todas as amostras na janela principal do software.
    3. Clique em Editor de tabelas na janela principal para gerar uma tabela com todas as frequências calculadas. Na janela pop-up, escolha o formato de arquivo .xls, designe a pasta de destino e clique em Criar tabela.
      NOTA: Todas as etapas realizadas usando o software de análise de citometria de fluxo podem ser visualizadas na Figura Suplementar 2. A tabela final gerada por esta etapa contém a porcentagem de hCD45+ necessária para gerar gráficos para analisar a progressão do enxerto ao longo do tempo.
  11. Plotagem da progressão do enxerto
    1. Inicie um software de plotagem e análise de gráficos. Selecione o formato de tabela XY. Na janela principal, escolha Inserir ou Importar Dados para uma Nova Tabela, defina X como Números e Y para Inserir valores replicados em subcolunas lado a lado.
    2. Na tabela aberta, organize os títulos das colunas: insira Dias de enxerto para a coluna X e % hCD45+ em PB para o primeiro grupo de subcolunas Y. Preencha a coluna X com os dias pós-injeção correspondentes aos dias de coleta de sangue para monitoramento do enxerto. Insira manualmente a porcentagem coletada semanalmente de dados hCD45+ para cada camundongo nas subcolunas Y.
    3. No menu do software, no subconjunto Família, selecione Dados 1. Na janela pop-up, escolha a segunda opção de gráfico chamada Pontos e Linha de Conexão com Barras de Erro e ative a plotagem de barras médias e de erro.
    4. Ajuste os eixos do gráfico para os intervalos desejados. Clique em Exportar no canto superior direito do menu para baixar o gráfico final.
      NOTA: Todos os dados coletados durante os experimentos com qualquer LLA única devem ser plotados no mesmo gráfico para facilitar as análises ao longo do tempo desde o início do experimento. Um exemplo descritivo de plotagem de gráficos pode ser encontrado na Figura Suplementar 3.

2. Tratamento de camundongos

  1. Preparação de soluções para tratamento de drogas
    1. Prepare uma solução de trabalho de vincristina na concentração de 1 mg/ml. Prepare uma solução de trabalho de dexametasona a 4 mg / mL. Prepare a solução de trabalho da L-asparaginase a 2.000 UI / mL. Prepare a solução de trabalho de daunorrubicina a 2 mg / mL.
      NOTA: Os medicamentos utilizados neste protocolo são equivalentes aos empregados no tratamento clínico dos pacientes15. O veículo da solução de trabalho da dexametasona é composto de creatinina, citrato de sódio di-hidratado, hidróxido de sódio, bissulfito de sódio, metilparabeno, propilparabeno e água para injeção. O veículo de solução de trabalho de vincristina é composto de manitol, ácido sulfúrico, hidróxido de sódio e água para injeção. A L-asparaginase e a daunorrubicina estão frequentemente disponíveis na forma liofilizada. Nesses casos, o veículo recomendado para a reconstituição é a água estéril para preparações injetáveis, que deve ser utilizada para atingir a concentração correta. Para evitar a perda de atividade do medicamento devido a ciclos repetidos de descongelamento, os medicamentos devem ser divididos em alíquotas de trabalho usadas no máximo 3x.
  2. Animais com peso quando é detectada leucemia
    1. Inicie o tratamento no ponto em que a porcentagem de células hCD45 + no sangue periférico de camundongos atinge uma faixa média entre 0,2% e 1%. Ao alcançá-lo, divida os camundongos transplantados em dois grupos distintos: um para receber tratamento e outro para servir como controle.
    2. Ao atingir o limiar estabelecido, persistir no acompanhamento semanal da progressão da leucemia. Colete continuamente dados de hCD45% para monitorar a capacidade de resposta ao tratamento, a ocorrência de recaídas e a detecção de resistência a medicamentos.
    3. Pesar os animais a serem tratados. Use a média aritmética dos pesos para determinar a dose de cada medicamento a ser administrado ao grupo. Pese os animais do grupo controle para comparar o ganho/perda de peso entre os grupos.
      1. Use as seguintes doses de medicamentos: vincristina, 0,15 mg / kg; dexametasona, 5 mg/kg; L-asparaginase, 1.000 UI/kg; e daunorrubicina, 1,2 mg/kg. Pese todos os animais pelo menos 3x por semana: na segunda, quarta e sexta-feira. Use os pesos para ajustar as doses de tratamento dos medicamentos e monitorar o nível de toxicidade do tratamento.
  3. Preparação das soluções de administração de medicamentos a partir das alíquotas da solução de trabalho
    NOTA: As soluções de administração de medicamentos consistem em 1x PBS estéril como diluente e o volume correto (de acordo com o peso do animal) de soluções medicamentosas de trabalho (água estéril é usada exclusivamente para reconstituição e não para injeção) administradas todos os dias da semana. Os medicamentos administrados por via intraperitoneal podem ser unidos na mesma solução; no entanto, se algum medicamento for administrado por via intravenosa, ele deve ser colocado em uma solução individual. O volume da solução de administração do medicamento a ser administrado a cada animal é de 100 μL.
    NOTA: Uma seringa de insulina estéril com agulha acoplada (1 mL, com dimensões da agulha 12,7 mm X 0,33 mm) foi utilizada na etapa descrita acima. Uma descrição completa da seringa pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
    1. Na segunda-feira, prepare uma solução de administração de medicamentos que consiste em dexametasona, vincristina e PBS. Administre os medicamentos por via intraperitoneal.
    2. Na terça e quinta-feira, prepare uma solução de administração de medicamentos que consista em dexametasona, L-asparaginase e PBS. Administre os medicamentos por via intraperitoneal.
    3. Na quarta-feira, prepare uma solução de administração de medicamentos que consista em dexametasona e PBS e administre-a por via intraperitoneal. Prepare uma segunda solução de administração de medicamentos consistindo de daunorrubicina e PBS. Administre-o por via intravenosa.
    4. Na sexta-feira, prepare uma solução de administração de medicamentos que consiste em dexametasona e PBS. Administre o medicamento por via intraperitoneal.
    5. Deixe os animais descansarem durante os dias de fim de semana. Repita o ciclo de tratamento por 4 semanas.
      NOTA: Um esquema de tratamento abrangente pode ser encontrado na Tabela Suplementar 2. É importante esclarecer que outros protocolos já estabelecidos para o tratamento em camundongos foram testados, mas resultaram em altos níveis de toxicidade para a cepa NSG. Portanto, o esquema de tratamento proposto foi primeiramente submetido a um processo de padronização para a redução da toxicidade, que resultou nas doses e frequência de administração apresentadas neste protocolo. Espera-se que a porcentagem de hCD45+ no grupo tratado diminua em comparação com a porcentagem de hCD45+ no grupo controle devido à administração do tratamento.
  4. Administração de medicamentos e monitoramento da responsividade à leucemia
    1. Contenha manualmente o animal com a mão esquerda para administrar medicamentos por via intraperitoneal. Mantenha o animal com a porção ventral para cima. Na porção ventral, localize o quadrante inferior direito.
    2. Com a mão direita, use uma agulha de injeção estéril, afiada e de uso único e injete 100 μL da solução de administração do medicamento no quadrante inferior direito dos camundongos.
      NOTA: Tenha cuidado ao imobilizar o animal; Não deve ser um procedimento prejudicial para os ratos. Como na coleta de sangue, esteja ciente de quaisquer complicações respiratórias. No caso de injeções intraperitoneais, segure sempre a agulha perpendicularmente para evitar a perfuração do órgão.
    3. Siga as mesmas instruções usadas para transplantar células de leucemia para administrar medicamentos por via intravenosa. Deixe os camundongos descansarem após 4 semanas de administração do tratamento até o reaparecimento de TODAS as células, aqui chamadas de primeira recidiva (R1).
      NOTA: Apesar da diferença na via de administração, a injeção intravenosa usa o mesmo volume que a injeção intraperitoneal.
  5. Monitoramento da responsividade à leucemia e detecção da primeira recidiva (R1)
    1. Não interrompa o monitoramento semanal da citometria de fluxo da leucemia durante o tratamento ou as fases de repouso.
      NOTA: Considerando o tratamento de 5 dias por semana, é altamente recomendável que o monitoramento seja realizado no início da semana. Em nosso estudo, a coleta de sangue, o processamento das amostras e a análise foram realizados sempre às segundas-feiras.
    2. Realize a coleta de sangue e quaisquer procedimentos subsequentes necessários para monitoramento de acordo com as etapas 1.4 - 1.11.
      NOTA: Após o período de repouso determinado, as células R1 serão detectadas pelo aumento repentino na porcentagem de hCD45+ no sangue periférico de camundongos. O período entre o término do tratamento e a ocorrência da recidiva é variável e pode ser distinto para cada leucemia rastreada. Na detecção de R1, a terceira e última fase do modelo de recaída de camundongo proposto deve ser realizada. Para melhorar o monitoramento e as análises de resposta, sugerimos o uso de medidas de resposta objetivas, como doença progressiva, doença estável, nível de responsividade (parcial, completa ou mantida), remissão e resistência, seguindo as diretrizes descritas por Randall et al. (2024)16.

3. Ciclos repetidos de tratamento até o surgimento de células resistentes

  1. Detecção da primeira recidiva
    1. Administre uma semana inteira de tratamento do tipo indução a qualquer camundongo com recidiva de leucemia (denominado R1), ou seja, quando o limite de 0,2% de hCD45 + no sangue periférico for atingido. Por 1 semana, de segunda a sexta-feira, siga o cronograma de administração do medicamento usado para o tratamento do tipo indução de 4 semanas.
      NOTA: A administração de apenas 1 semana de tratamento neste momento visa testar in vivo se as células leucêmicas ganharam resistência à quimioterapia e, eventualmente, impulsionaram a progressão da leucemia para recaídas sucessivas ao longo do tempo, sob pressão da quimioterapia. Optamos por não administrar um segundo esquema de 4 semanas como forma de evitar toxicidade excessiva e perda de animais.
    2. Deixe os ratos descansarem no final da semana inteira de administração do medicamento. Continue o monitoramento semanal da resposta da leucemia por citometria de fluxo seguindo as etapas 1.4 - 1.11.
      NOTA: Neste ponto, espera-se que as células de leucemia permaneçam responsivas ao tratamento. Consequentemente, ao monitorar a leucemia, a porcentagem de hCD45+ nos camundongos deve diminuir e permanecer negativa por um determinado período.
  2. Monitoramento da aparência R2
    1. Aguarde o aparecimento da recidiva R2 (células hCD45+ ≥ 0,2%). Quando aparecer, conte o tempo decorrido entre o término do tratamento e o aparecimento de R2. Chame esse período de Δt1.
    2. Prossiga para uma segunda semana completa de administração de tratamento do tipo indução. Siga as mesmas diretrizes da primeira administração deste cronograma.
    3. Deixe os ratos descansarem no final do tratamento. Continue o monitoramento da leucemia.
  3. Monitoramento da aparência R3
    1. Aguarde até que a recaída R3 apareça. Conte o tempo da mesma forma que na etapa 3.2.1. Chame-o de Δt2.
    2. Compare Δt1 e Δt2. Repita as etapas acima N vezes para obter múltiplas recidivas de leucemia (R1, R2 ... RN) se o período Δt permanecer o mesmo. Pare os ciclos de tratamento assim que o período Δt diminuir.
      NOTA: Uma diminuição no Δt para recidiva é uma indicação da resistência aos medicamentos adquirida pelas células leucêmicas. Este resultado reforça a capacidade do modelo de recidiva de camundongos de gerar células LLA resistentes à quimioterapia.
    3. Recupere as células de leucemia conforme descrito na etapa 4 abaixo. Armazená-los vivos por criopreservação ou por qualquer conservante compatível com as análises subsequentes pretendidas.
      NOTA: O evento recomendado para a recuperação de células leucêmicas é de até 25% de hCD45+ no sangue periférico, conforme descrito pela literatura recente16.

4. Recuperação de células leucêmicas por meio da extração de órgãos

  1. Eutanásia de camundongos com overdose de anestésicos químicos
    1. Eutanásia de camundongos por overdose de anestésicos químicos, seguida de luxação cervical para confirmação da eutanásia, conforme descrito abaixo.
    2. Prepare uma mistura contendo três anestésicos diluídos em PBS 1x estéril para anestesia profunda. Use 150 μL de maleato de acepromazina comercial, 50 μL de xilazina comercial, 80 μL de cetamina comercial e 220 μL de PBS para cada animal a ser sacrificado.
    3. Administrar 500 μL da mistura preparada por injeção intraperitoneal. Siga as mesmas diretrizes de contenção e injeção descritas na etapa 2.4.
    4. Sob o efeito de uma overdose de anestésicos químicos, os camundongos se deitam no fundo da gaiola. Após alguns minutos, observe se os camundongos têm parada respiratória. Nesse caso, espere que o esforço respiratório cesse. Para verificar se o procedimento de eutanásia foi eficaz, verifique a presença de um reflexo involuntário aplicando pressão em uma das patas traseiras do animal. Para confirmar a eutanásia, prossiga para a luxação cervical.
  2. Luxação cervical
    1. Segure o animal com a parte traseira do corpo contra a grade de alimentação da gaiola. Use os dedos indicador e polegar da mão esquerda para formar a forma de uma pinça. Coloque os dedos em forma de pinça diretamente sob a cabeça do animal. Pressione firmemente contra a porção cervical da coluna.
    2. Segure a cauda do animal com a mão direita. Puxe-o para trás com um movimento firme e constante até que a cabeça do animal esteja separada do resto do corpo.
      NOTA: A luxação cervical é um dos métodos aceitos para confirmar a eutanásia 17,18,19. Outros métodos, como a exposição contínua ao CO2 por pelo menos 15 minutos após a parada respiratória, podem ser usados como alternativa.
  3. Preparação animal para a colheita de órgãos
    1. Higienize os ratos aplicando álcool 70% em todo o corpo. Coloque o corpo do animal sobre uma plataforma cirúrgica para roedores com a porção ventral para cima. Depile a parte abdominal do corpo.
      NOTA: Uma descrição completa da plataforma cirúrgica para roedores pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
  4. Colheita do baço
    1. Faça uma pequena incisão com tesoura cirúrgica estéril e pinça na pele abdominal. Retire-o da região abdominal, expondo o peritônio.
    2. Faça uma pequena incisão no peritônio. Corte-o até que o acesso completo aos órgãos localizados no abdômen seja obtido.
    3. Localize o baço, logo abaixo do estômago do animal. Remova o baço. Coloque-o em um recipiente contendo 1x PBS estéril para processamento posterior.
  5. Colheita de fêmur
    1. Prossiga com a abertura da cavidade peritoneal para ter acesso às patas traseiras do animal.
    2. Localize o fêmur. Remova-o cortando as articulações que o unem ao osso da pelve e à tíbia e fíbula. Faça este processo para ambos os ossos do fêmur.
    3. Limpe os ossos removendo qualquer músculo, pele ou tecido restante. Coloque-os em um recipiente contendo 1x PBS estéril para processamento posterior. Descarte a carcaça do animal de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal.
      NOTA: Dependendo dos objetivos do estudo, as células LLA também podem ser coletadas do fígado, sistema nervoso central, timo, linfonodos, etc. Neste manuscrito, como exemplo, descrevemos a coleção de TODAS as células do baço e da medula óssea.
  6. Preparação para processamento de órgãos
    1. Reúna um tubo de centrífuga estéril de 50 mL, duas seringas estéreis de 1 mL, uma agulha hipodérmica estéril de 25 mm x 0,6 mm e dois filtros de células estéreis de 70 μm.
  7. Processamento do baço
    1. Coloque um filtro de célula no topo de um tubo de centrífuga aberto de 50 mL. Coloque o baço na superfície do filtro de células. Macerar o órgão com a parte plana do êmbolo da seringa até que não haja grandes porções visíveis.
    2. Adicione 1x PBS estéril ao baço macerado. Execute movimentos circulares com a parte plana do êmbolo da seringa para garantir a filtragem celular.
      NOTA: O derramamento do PBS pode ser feito gradualmente; no entanto, o volume final utilizado não pode exceder 6 mL. Após a conclusão do processamento do baço, o filtro celular deve estar limpo e desprovido de qualquer tecido residual. No caso de saturação do filtro celular, é possível empregar um filtro celular alternativo. O conteúdo do filtro inicial pode ser transferido para o segundo filtro e o processamento pode ser continuado. Para acessar a carga tumoral dentro desse órgão, uma parte do baço pode ser separada para avaliação histopatológica.
  8. Processamento da medula óssea
    1. Incorpore um novo filtro de células para processamento da medula óssea no tubo de centrífuga já usado. Corte as bordas do osso do fêmur até que as aberturas da medula óssea estejam acessíveis. Insira a agulha hipodérmica em uma nova seringa. Adicione 1 mL de PBS estéril 1x à seringa.
      NOTA: Dependendo dos objetivos do estudo, TODAS as células obtidas do baço e da medula óssea devem ser coletadas separadamente. Nesse caso, um tubo de centrífuga separado deve ser usado para cada tecido. Uma porção do fêmur pode ser separada para avaliação histopatológica para avaliar a carga tumoral dentro desse órgão.
    2. Execute a descarga da medula óssea sobre o filtro da célula. Insira a ponta da agulha em um lado da abertura da medula óssea. Empurre o êmbolo da seringa com um movimento firme e constante. Repita o procedimento com o outro osso do fêmur.
    3. Desacople a agulha. Utilize a parte plana da seringa para macerar a medula óssea lavada. Adicione 1x PBS estéril à medula óssea macerada. Execute movimentos circulares com a parte plana do êmbolo da seringa para garantir a filtragem celular. Após a conclusão do procedimento de processamento, o tubo de centrífuga de 50 mL conterá um volume total de 10 mL, compreendendo uma mistura de células esplênicas e da medula óssea que foram diluídas em PBS.
      NOTA: O processo de vazamento do PBS pode ser executado gradualmente; no entanto, é imprescindível garantir que o volume final utilizado não exceda 2 mL.

5. Isolamento de células leucêmicas por centrifugação por gradiente

  1. Preparação para isolamento de células leucêmicas
    1. Reúna um tubo de centrífuga de 15 mL, pipetas Pasteur descartáveis estéreis, o tubo de centrífuga de 50 mL contendo os órgãos que foram processados e o meio de gradiente de densidade para isolamento de linfócitos.
      NOTA: O meio facilita o isolamento de células mononucleares criando um gradiente de densidade por centrifugação. As células mononucleares (linfócitos, monócitos e células LLA) formam uma camada na interface entre o meio e o plasma.
  2. Isolamento de células leucêmicas
    1. Adicione 5 mL do meio de gradiente de densidade para isolamento de linfócitos ao tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta Pasteur descartável. Adicione gradualmente os 10 mL da mistura de células esplênicas e da medula óssea sobre a camada média. Segure o tubo em um ângulo raso, cerca de 30 ° ou menos, e adicione lentamente a mistura de células ao longo da parede do tubo para que a camada média de densidade não seja perturbada.
      NOTA: Tenha cuidado durante este processo para garantir que as células não se misturem com o meio de densidade. A perturbação durante este processo pode levar à falha na formação do gradiente de densidade durante a centrifugação.
    2. Centrifugue o tubo de 15 mL a 420 x g em um rotor de caçamba oscilante, por 30 min, sem aceleração e sem interrupção, para evitar perturbar as fases formadas.
      NOTA: As células leucêmicas formarão uma camada entre o meio de densidade e as fases aquosas.
    3. Remova e descarte a fase aquosa superior usando uma pipeta Pasteur descartável estéril. Colete a camada de células leucêmicas formada com uma pipeta Pasteur descartável estéril. Transfira-o para um novo tubo de centrífuga de 15 mL.
      NOTA: Não se preocupe se parte da camada média de baixa densidade for pipetada junto com as células de leucemia.
  3. Lavagem de células leucêmicas
    1. Adicione 1x PBS estéril ao tubo que contém as células coletadas até atingir o limite de 15 mL.
    2. Centrifugue as células a 300 x gpor 5 min. Restaure a aceleração e a frenagem máximas. Remova e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em novo frio estéril 1x PBS.5.3.3.Prossiga para a verificação da célula e da viabilidade celular. Siga as diretrizes padrão do procedimento de contagem de células13. As células lavadas podem ser coradas com anticorpo anti-camundongo CD45 (mCD45), anticorpo anti-humano CD45 (hCD45) e anticorpo anti-humano CD19 (hCD19), seguido de etapas de lavagem e aquisição de dados.
      NOTA: No caso de processamento das células do baço e da medula óssea em diferentes tubos de centrifugação, uma parte dessas amostras pode ser usada para acessar a carga tumoral dentro desses órgãos por meio de citometria de fluxo.
  4. Criopreservação de células leucêmicas
    1. Pulverize as células por centrifugação a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Mantenha as células no gelo.
    2. Preparar um meio de congelação constituído por 90% de soro fetal bovino frio estéril (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Use 1 mL desta solução para cada frasco de criopreservação.
    3. No gelo, ressuspenda as células na solução preparada a uma concentração de 2 x 107 células / mL. Alíquota das células nos tubos de criopreservação. Criopreservar células seguindo as diretrizes padrão de criopreservaçãode cultura celular 20.
      NOTA: Essas células podem ser usadas para análises adicionais. Em vez de congelar células viáveis, pode-se também alíquota e preservar células em diferentes conservantes para análises subsequentes de DNA, RNA, proteínas e metabólitos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

No contexto de nossos estudos, amostras de LLA de células B precursoras foram selecionadas de dois grupos de pacientes: um que exibiu uma resposta favorável, conforme determinado pela ausência de células leucêmicas no sangue periférico do dia 8 e ausência de células leucêmicas residuais na medula óssea nos dias 15, 33 e 78/96. O outro grupo foi formado por LLAs que correspondiam aos subgrupos moleculares dos anteriores, obtidos de pacientes que tiveram um...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Compreender os mecanismos biológicos subjacentes às doenças neoplásicas é essencial para o desenvolvimento de terapias mais eficazes e para melhorar os resultados dos pacientes. Em condições como a leucemia linfoblástica aguda pediátrica, essas abordagens investigativas não são apenas relevantes para aumentar as taxas de cura, mas também têm um valor particular para pacientes nos quais os tratamentos padrão atingiram os limites de intensidade terapêutica e tolerabilidade. No cenário de r...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro Infantil Boldrini e a todos os pacientes que doaram suas amostras para o estudo. Manuella M. Hoff recebeu bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes recebeu bolsa de produtividade do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 308399/2021-8). Este trabalho foi apoiado pelo financiamento de pesquisa do Ministério da Saúde do Brasil pelo programa PRONON (NUP 25000.211174/2019-45).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL  seringaBD #309628Colheita de órgãos
10 mL de água estéril para injeçãoHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Reconstituição de drogas
Solução de Lise de 10X para glóbulos vermelhosBioLegend#420302Processamento de amostras de sangue de camundongos
Analisador de células de 5 canaisBD em Biociências658226R1Citômetro de Fluxo  
Filtro de Célula de 70 uMFalcom#352350Colheita de órgãos
Maleado acepromazina Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Anestesia de camundongos
APC anti-humano CD45 - isotipo de camundongo IgG1 - clone do HI30BioLegend#304037Coloração linfócita
Asparaginase 10000 UAginase/medac#88660100Tratamento com camundongos
Brilliant-Violet 605 anti-mouse CD45 - isotipo de camundongo IgG2 - clone 30-F11BioLegend#103139Coloração linfócita
DaunorubicinaFarmarin#116880025Tratamento com camundongos
DexametasonaAché#00000066Tratamento com camundongos
Dimetil sulfóxidoSigma-Aldrich#589569Criopreservação de linfócitos
Agulha descartável - 0,60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Colheita de órgãos
Lanceta descartável estéril  Yancheng Huida Medical Instruments & nbsp;https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Coleta de sangue de camundongos
Ácido etilenediaminatetracetanteTecnologias de vida#15576-O28Solução EDTA
Soro Fetal BovinoCultilab#F083Criopreservação de linfócitos
Análise de Software de Citometria de Fluxo - Versão 10.10.0BD em Biociênciashttps://www.flowjo.com/Análise de citometria de fluxo
Análise de Software de Gráficos e Plotamento - Versão 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresPlotagem e análise de gráficos
Seringa de insulina com agulha acoplada 1mL FX 12,7 mm X 0,33 mmDescarpacke0342101Transplante de camundongos e administração de medicamentos
Cetamina InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Anestesia de camundongos
Plataforma Cirúrgica Multifuncional para roedoresKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Procedimentos cirúrgicos de camundongos
PE anti-humano CD19 - isotipo de camundongo IgG1 - clone de HIB19BioLegend#302208Coloração linfócita
Cloreto de potássioSigma-AldrichP3911-1KGSolução PBS
Dibásico fosfato de potássioSigma-AldrichP0662-1KGSolução PBS
Reagente para isolamento de linfócitosCytiva#17-1440-02, pacote de 6 e horas; 100  MlIsolamento de linfócitos de órgãos colhidos
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888-1kgSolução PBS
Dibásico de fosfato de sódio  Sigma-AldrichS9763-1KGSolução PBS
Pinça de Dissecação Anatômica Estéril - 12 cm ABC 0170Lab Lí Der120Procedimentos cirúrgicos em camundongos
Tesoura Estéril 12 cm - ABC 0321Lab Lí Der136Procedimentos cirúrgicos em camundongos
VincristineLibbs#7896094208483Tratamento com camundongos
Xylazine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Anestesia de camundongos

Referências

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Xenotransplante Derivado de PacienteResist ncia a DrogasCitometria de FluxoBlastos de Sangue Perif ricoDoen a Residual M nimaIsolamento de C lulas Leuc micas
Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.