Um Método de Imagem Óptica Compatível com Microscopia Eletrônica de Varredura para Mapeamento Cerebral Mesoscópico de Todas as Células

Summary

Introduzimos uma técnica inovadora de imagem chamada Tomografia de Interferência Óptica Multicamada (OMLIT), que permite a imagem não enviesada de todas as células em amostras cerebrais na mesoescala e pode ser integrada perfeitamente ao fluxo de trabalho de imagem da microscopia eletrônica serial de varredura baseada em fita na mesma amostra.

Abstract

Compreender as relações estruturais e funcionais dentro das redes neurais complexas do cérebro requer a construção de atlas cerebrais que possuam tanto um amplo campo de visão quanto uma resolução subcelular. No entanto, os métodos atuais de imagem óptica e de microscopia eletrônica têm limitações, dificultando a imagem de todas as células dentro de um único espetáculo. Esse protocolo introduz uma técnica de imagem chamada Tomografia de Interferência Óptica Multicamada (OMLIT), que permite a obtenção indiscriminada de imagens ópticas de todas as células em amostras cerebrais feitas após preparação de amostras em microscopia eletrônica, reconstruindo assim um atlas cerebral completo de todas as células neurais. Além disso, a imagem OMLIT pode ser integrada de forma integrada ao fluxo de trabalho de imagem da microscopia eletrônica de varredura automatizada de coleta de fita (ATUM-SEM). Isso permite que pesquisadores obtenham informações estruturais em mesoescala das células antes da microscopia eletrônica, facilitando a seleção precisa das regiões de interesse e reduzindo significativamente a área e o volume de dados necessários para a imagem de microscopia eletrônica (EM) de alta resolução. Validamos a precisão e compatibilidade desse método em amostras reais do córtex cerebral adulto de camundongo, demonstrando suas amplas perspectivas de aplicação na construção de atlas cerebrais em múltiplas escalas.

Introduction

O mapeamento abrangente dos circuitos neurais em resolução celular e subcelular é essencial para revelar a estrutura e a função do cérebro. Métodos tradicionais de imagem óptica, como a microscopia de dois^{fótons 1}, a tomografia micro-óptica de secção fluorescente (fMOST^)2,3,4 e o sistema^{VISoR 5}, possibilitaram a imagem neuronal em mesoescala e a imagem funcional in vivo. No entanto, devido à dependência de rotulagem esparsa, eles não conseguem capturar toda a população celular. Por outro lado, técnicas de imagem óptica sem marcador, como a microscopia fotoacústica funcional (fPAM^)6,7, tomografia de coerência óptica (OCT⁾⁸ e microscopia de fase^{quantitativa 9}, possuem o potencial de visualizar simultaneamente todos os neurônios dentro do campo de visão. No entanto, esses métodos são tipicamente limitados por baixa resolução axial e profundidade de imagem rasa, e sua complexidade de hardware dificulta a ampla aplicação na construção de atlas cerebrais. Em contraste, as técnicas de microscopia eletrônica em seção serial (ssEM), incluindo SEB de face de bloco serial (SBF-SEM^)10,11, SEM de feixe de íons focados (FIB-SEM⁾12,13,14 e ultramicromicrotomia automatizada de coleta de fita SEM (ATUM-SEM⁾15,16,17 , pode revelar redes densas de conectividade sináptica em resolução nanométrica, fornecendo ferramentas essenciais para conectômica de alta resolução. No entanto, essas técnicas sofrem com baixo rendimento, longos tempos de aquisição, campos de visão limitados e altos custos de processamento de dados e hardware^.

Para superar as limitações acima, desenvolvemos um método de imagem chamado Tomografia de Interferência Multicamada Óptica (OMLIT), que oferece uma solução de baixo custo e alta capacidade para imagens indiscriminadas, de alto contraste e campo amplo de todas as células em seções ultrafinas, alcançando resolução submicronática em grandes áreas tecidulares. Ao mesmo tempo, o OMLIT é inerentemente compatível com fluxos de trabalho SEM em seções seriadas: antes da microscopia eletrônica de alta resolução, o OMLIT fornece informações estruturais nas mesmas seções, permitindo navegação precisa pelo ROI e reduzindo significativamente a área e o volume de dados necessários para imagens EM subsequentes. O OMLIT oferece vantagens únicas no nível de imagem em mesoescala e serve como uma ponte crítica conectando mapas estruturais neurais em diferentes escalas espaciais. Sua natureza não destrutiva preserva o potencial para futura integração com estratégias específicas de marcação, como o uso de proteínas fluorescentes resistentes ao^{ósmio 19} para preparação e imagem de amostras. Esse método permite a imagem em mesoescala de regiões cerebrais selecionadas, possibilitando a rápida aquisição da morfologia, quantidade, distribuição e densidade neuronal nas regiões. Também facilita a caracterização quantitativa das projeções axonais e da distribuição de dendritos entre neurônios em diferentes áreas cerebrais. Para regiões específicas de interesse nos resultados de imagem, detalhes ultraestruturais in situ podem ser investigados mais a fundo usando microscopia eletrônica.

O princípio de imagem do OMLIT foi descrito no trabalho de Hao^{Fan 20}. Brevemente, durante a imagem, a seção ultrafina, camada revestida, fita coletora, fita condutora e pastilha formam uma estrutura de filme fino multicamada. Quando uma onda plana interage com essa estrutura, ondas refletidas são geradas em várias interfaces e se sobrepõem no espaço de detecção, resultando em interferência óptica devido a diferenças de refletância, índice de refração e absorção entre os materiais. Um programa de simulação baseado no MATLAB desenvolvido com base nesse princípio demonstrou concordância razoável com os resultados experimentais.

O esquema de imagem OMLIT pode ser categorizado em dois tipos com base na estratégia de processamento de fita. A primeira é a estratégia de alta refletividade, na qual metais como Cr,, Al ou Ag são usados para revestir a superfície da fita, resultando em intensidades ópticas mais altas nas regiões citoplasmáticas e lúmens vasculares preenchidos com resina em comparação com áreas ao redor. A segunda é a estratégia de baixa refletividade, que utiliza fita Kapton não revestida, fita D-50 ou fita PET revestida com CNT. Neste caso, o resultado da imagem óptica é o oposto do primeiro: regiões ricas em resina e livres de membranas (por exemplo, citoplasma e lúmens vasculares) aparecem com menor intensidade.

Resumimos e estabelecemos sistematicamente protocolos padronizados adaptados a duas estratégias distintas de imagem. Os protocolos apresentados aqui oferecem procedimentos experimentais abrangentes e detalhados. Além disso, questões comuns encontradas durante os experimentos são resumidas, juntamente com soluções propostas. Focamos em apresentar um conjunto de dados do córtex de camundongo adquirido usando a estratégia de baixa refletividade (805 × 857,5 × 11,66 μm³), ilustrando as características e vantagens distintas da abordagem de imagem OMLIT.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Ciência e Tecnologia da China e com as regulamentações nacionais relevantes. A preparação da amostra para a imagem OMLIT segue o mesmo protocolo usado na EM convencional, e o procedimento específico que empregamos foi descrito em outro^{lugar 21}. Resumidamente, após anestesia, camundongos foram perfundidos transcardialmente sequencialmente com tampão cacodilato de sódio, líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) e, finalmente, um fixador contendo glutaraldeído e paraformaldeído. O cérebro foi cuidadosamente removido e, em cerca de 1 × 1 × blocos de 1 mm³ de tecido cerebral foram seccionados. As amostras eram então fixadas quimicamente, submetidas a manchas seriadas de metais pesados, desidratadas e embutidas em resina. O fluxo de trabalho geral do protocolo é apresentado na Figura 1.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho. (A) Fitas de coleta mencionadas no protocolo (da esquerda para a direita: poliimida, D-50 e PET revestido com CNT). (B) Seccionamento serial e coleta das amostras aparadas. (C) Montagem de fitas contendo seções coletadas em uma pastilha circular de silício. (D) Microscopia óptica, barra de escala 100 μm. (E) Revestimento de carbono. (F) A imagem por microscopia eletrônica corresponde à região delineada na Figura 1D, barra de escala: 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Preparação da fita

NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados em uma sala limpa para evitar a contaminação da fita por poeira.

1. Estratégia de alta refletividade
   1. Selecione Kapton (doravante chamada de fita de poliimida, 50 μm de espessura) ou filme Panlite (doravante chamado de D-50, 50 μm de espessura) e monte-o no sistema motorizado de enrolamento. Aqui, a fita de poliimida é usada como exemplo.
      NOTA: Um dispositivo motorizado de enrolamento, projetado para ser acionado por um motor de passo controlado por uma placa Arduino, para passar a fita de um carretel ao outro através do cone de plasma de pulverização, foi usado neste estudo. Para compensar o aumento da velocidade de linha da translação da fita causado pelo acúmulo de fita no carretel de condução, aumentando o diâmetro do carretel de recolha, um programa foi escrito para sintonizar serialmente a velocidade angular do carretel após cada rotação de 360°.
   2. Deposite uma película fina uniforme de Cr (ou outros metais como Al, Ag ou) na superfície da fita usando um sistema de sputtering magnetron (sputter de cabeça dupla). Posicione a fita a uma distância de 80 mm do alvo de sputtering para deposição ideal. Conduza o processo sob energia DC e a uma pressão de 1,0 Pa regulada por gás argônio a 99,99%.
   3. Ajuste a velocidade de enrolamento da fita para 0,6 mm/s para alcançar uma espessura do revestimento metálico de 50 nm. Após a deposição, resfrie a câmara lentamente até a temperatura ambiente (RT) sob alto vácuo para minimizar o estresse do revestimento.
      NOTA: A espessura ideal do revestimento para a mesma fita pode variar dependendo do tipo de metal utilizado. Ajuste a velocidade de translação da fita para alcançar uma variedade de espessuras de revestimento, como 50, 70, 100, 150 e 200 nm.
   4. Avalie a espessura e uniformidade do revestimento usando um perfilador de agulha, microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de varredura.
   5. Limpe e torne a fita hidrofílica usando um limpador de plasma a 80 W de potência, com uma velocidade de movimento da fita de 7 mm/s. Após o tratamento, gotas de água colocadas na superfície da fita devem se espalhar rapidamente em uma película fina (Figura 2A).
2. Estratégia de baixa refletividade
   NOTA: Este protocolo permite o uso de fita D-50 ou de fita comercial de nanotubos de carbono (CNT) revestida com polietileno tereftalato (PET). Como este último pode introduzir algum ruído de fundo durante a microscopia eletrônica — embora não forte — pode afetar potencialmente a segmentação das imagens eletromagnéticas. Portanto, a descrição a seguir ainda usará a fita D-50 como exemplo.
   1. Prepare os filmes D-50 e corte a folha inteira em fitas de aproximadamente 7 mm de largura. Use um lado exposto da fita para coletar seções, enquanto proteja o outro lado com uma camada de filme fosco para evitar riscos e contaminação. Remova o filme fosco durante a próxima etapa de montagem da pastilha de silício.
   2. Para um número maior de seções, uma diferentes seções da fita D-50 entre si. Fixe as juntas entre segmentos de fita usando fita adesiva dupla face.
      NOTA: Ao aderir segmentos de fita, certifique-se de que a fita dianteira sobreponha a fita traseira de cima para baixo através da fita dupla face. Minimize a área adesiva e deixe uma margem ao longo das bordas da fita para evitar que a cola seja espremida durante o enrolamento, o que pode contaminar a fita (Figura 2B).
   3. Limpe e torne a fita hidrofílica usando um limpador de plasma, seguindo o mesmo procedimento e obtendo o mesmo efeito descrito anteriormente.
      NOTA: Exceto pelo revestimento metálico e pelas etapas de pulverização de carbono, as outras etapas em ambas as estratégias são as mesmas.

2. Seção ultrafina serial e coleta baseada em fita

1. Usando um pequeno moedor ou ferramenta de corte similar, corte a resina de forma grosseira na lateral com a amostra, removendo a resina em branco ao redor para expor a área da amostra.
2. Coloque o bloco embutido em resina no suporte da amostra e aperte o botão do suporte para fixar firmemente o bloco.
3. Monte o suporte da amostra no braço móvel do micrótomo. Instale uma faca de vidro ou uma faca de corte diamantada (em um ângulo de 45°) no suporte da faca. Ao microscópio, corte a superfície da amostra em forma de pirâmide e alise a superfície.
   NOTA: As bordas frontal e traseira do bloco de amostra aparado devem ser o mais paralelas possível (veja a Figura 2C).
4. Aparar e alisar os quatro lados do bloco de amostra para remover qualquer excesso de resina ao redor das bordas, evitando possíveis colisões com a faca de diamante. Gire o botão para garantir que as bordas dianteira e traseira do bloco cortado estejam alinhadas na horizontal.
5. Remova a faca de aparar e substitua-a por uma faca de diamante em um ângulo de 45°. Ajuste o ângulo de inclinação da base do microtomo para 6°. Mova lentamente o suporte da faca usando o botão até que a borda frontal da faca de diamante esteja a 1-2 mm da superfície da amostra.
6. Observe a faixa brilhante entre a superfície da amostra e a lâmina da faca, e ajuste o ângulo de inclinação para que a faixa fique uniforme de cima para baixo e de um lado para o outro. Isso ajuda a garantir que a primeira seção inclua toda a superfície da amostra, não apenas um canto.
7. Injete água destilada no sulco da faca de diamante, permitindo que o nível do líquido suba e garantindo que a lâmina esteja úmida. Depois, use uma seringa para remover um pouco da água até o nível do líquido cair e o reflexo parecer prateado.
8. Defina a espessura da seção (avanço), velocidade de corte e janela de corte na unidade de controle. Ajuste a velocidade de corte para 0,6 mm/s e ajuste a espessura da seção para 60 nm (a velocidade e espessura específicas dependem da qualidade da amostra).
9. Comece a seccionar. Uma vez que o micrótomo funcione de forma estável e seções uniformes sejam produzidas, pause o processo de separação. Use um pincel fino para remover as partes cortadas e qualquer detrito.
10. Instale tanto o carretel de fita revestida quanto um carretel vazio de recolha no sistema automático de coleta de seção ultrafina. Fixe o mecanismo de travamento e realize um teste para garantir que a fita se mova suavemente em velocidade constante e seja devidamente recolhida no carretel vazio.
11. Imerga a cabeça de coleta do dispositivo de coleta de fita no banho-maria da faca de diamante. Ajuste a posição da cabeça de coleta para que fique paralela à lâmina da faca, a uma distância de 1,5 vezes o comprimento da fatia da amostra, garantindo que as seções cortadas sejam recolhidas suavemente sobre a fita. Segure o dispositivo de coleta e retome a seção enquanto executa simultaneamente o dispositivo de coleta de fita.
12. Após coletar um número suficiente de seções contínuas, pause o processo de separação. Corte a fita na área da seção onde nenhuma seção foi coletada e continue usando o dispositivo de coleta até que toda a fita restante seja recolhida no carretel.
13. Remova o carretel contendo as seções coletadas e coloque-o em um forno eletrônico de secagem. Limpe o dispositivo de coleta de fita e o micrótomo, e devolva todos os acessórios aos seus lugares corretos.

Figura 2: Preparativos antes da separação. (A) Gotículas de água na superfície da fita D-50 antes (superior) e depois do tratamento hidrofílico (inferior). (B) Vistas esquemáticas superiores e laterais da área de junção da fita D-50. Azul: fita D-50; laranja: adesivo dupla face; Seta Verde: Direção de movimento da fita. (C) Vista frontal da amostra após o aparamento, mostrando bordas paralelas superior e inferior. (D) Dispositivo automatizado de coleta de fita. a: Carretel de fita para alimentação da fita D-50; b: Carretel de fita para recuperação de fita; Seta vermelha: direção do movimento da fita. (E) Posição da cabeça de coleta no dispositivo automatizado de coleta de fita. A caixa amarela no canto inferior direito indica uma seção recém-cortada prestes a ser coletada pelo dispositivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Montagem em uma pastilha de silício

NOTA: Certifique-se de que o espaço de trabalho esteja limpo para evitar a contaminação da fita por poeira durante as etapas a seguir.

1. Use uma pastilha redonda de silício de 4 polegadas pré-limpa e hidrofilizada em um sistema de tratamento de plasma (com 80 W de potência, 3 min).
2. Coloque luvas limpas, coloque a pastilha de silicone em uma superfície plana e corte um pedaço de fita de carbono condutora dupla face no comprimento apropriado (com saliência de 2-3 cm em ambas as extremidades). Retire a camada branca protetora de um lado da fita condutora dupla face e aplique de cima para baixo sobre a pastilha de silício.
   NOTA: Os dois lados da fita condutora devem estar espaçados cerca de 2 mm de distância, e as bordas da fita devem ser visíveis na pastilha de silício. Para uma fita condutora dupla face de 25 mm de largura, três segmentos de fita podem ser aplicados em uma pastilha de silício de 4 polegadas.
3. Desenhe um contorno da pastilha de silício de 4 polegadas na bancada de trabalho e marque o comprimento aproximado de cada segmento de fita que será aplicado na pastilha. Corte a fita que reuniu as seções de acordo com os comprimentos previamente marcados.
   NOTA: A fita cortada não deve ultrapassar a borda da pastilha de silício e não cortar as seções.
4. Descolhe o filme protetor transparente da fita condutora de dupla face e, para a fita D-50, remova o filme protetor na parte de trás da fita neste ponto. Aplique a fita paralelamente à fita condutora dupla-face. Aplique até três segmentos de fita em cada pedaço de fita condutora dupla face.
   NOTA: Para reduzir o risco de a fita D-50 ser desalinhada ou contaminada por poeira, cubra parte da fita condutora com o filme transparente que já havia sido descascado, deixando apenas uma pequena parte da fita condutora exposta para fixar a extremidade da fita D-50. Isso facilita o ajuste da direção da fita. Depois, retire lentamente o filme transparente restante, permitindo que o restante da fita D-50 caia suavemente e adera à fita condutora.
5. Após a montagem da fita, bolhas de ar podem se formar entre a fita e a fita condutora, o que pode interferir no processo de imagem subsequente. Coloque a pastilha de silício em uma câmara de vácuo (ou outro equipamento de vácuo) e aplique um vácuo. Após o processo de vácuo ser concluído, certifique-se de que as bolhas de ar tenham desaparecido.

4. Pós-coloração

1. Prepare 4% de acetato de uranila e 3% de citrato de chumbo, e pré-aqueça a 50°C usando um banho-maria.
   ATENÇÃO: Acetato de uranila é radioativo e tem toxicidade significativa para o fígado e rins. O citrato de chumbo pode causar intoxicação por chumbo, afetando o sistema nervoso, rins e sistema hematopoiético. O trabalho com esses reagentes deve ser realizado em uma coifa exausteira, e equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas de nitrila, máscara e óculos de segurança, devem ser usados. Em caso de contato visual ou de pele, lave-se imediatamente com grandes quantidades de água, informe a equipe de segurança do laboratório e procure atendimento médico.
2. Coloque a pastilha de silício, que foi aspirada e está livre de bolhas, em um sistema de hidrofilização de plasma para hidrofilização e limpeza.
3. Usando uma seringa de 10 mL com a agulha removida, conecte um filtro de seringa de 0,22 μm e filtre o acetato de uranila a 4%. Coloque a solução sobre a seção até que toda a superfície da seção da pastilha de silício esteja coberta, e então espere por 3 minutos.
4. Lave com água destilada por 3 minutos, repetindo 3 vezes, e depois seque a superfície da amostra com nitrogênio.
5. Usando uma seringa de 10 mL com a agulha removida, conecte um filtro de seringa de 0,22 μm e filtre o citrato de chumbo a 3%. Coloque a solução sobre a seção até que toda a superfície da seção da pastilha de silício esteja coberta, e então espere por 5 minutos.
6. Lave com água destilada por 3 minutos, repetindo 3 vezes, e depois seque a superfície da amostra com nitrogênio.

5. Aquisição de dados

1. Microscopia óptica
   NOTA: Nesta seção, um Scanner de Lâminas de Pesquisa (VS200, Olympus) é usado como exemplo para microscopia óptica. Outros microscópios, como o Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Alemanha), também são adequados para a imagem óptica descrita aqui. Os passos para outros microscópios ópticos são geralmente os mesmos.
   1. Coloque a pastilha de silício no palco do microscópio óptico e prenda-a com fita adesiva anti-resíduos.
   2. Use uma lente objetiva 5x para obter uma imagem geral da pastilha de silício, da fita e da amostra.
   3. Na imagem de visão geral, faça o contorno de cada seção e ordene-as, depois adicione pontos de foco e pontos de exposição para realizar imagens automáticas com ampliação de 20x ou 50x em toda a pastilha de silício com todas as seções.
   4. Após a imagem concluída, salve as imagens e depois verifique a qualidade da imagem. Se houver imagens fora de foco ou de baixa qualidade, reenfoque e reimageie.
2. Microscopia eletrônica
   NOTA: Vários tipos de microscópios eletrônicos podem realizar imagens contínuas de seções ultrafinas colocadas em pastilhas de silício. Aqui, o Multibeam 505 (Zeiss) é usado como exemplo.
   1. Realize revestimento de carbono na superfície da amostra usando um revestimento por pulverização de alto vácuo, com espessura de carbono de 5,7 nm.
      NOTA: Esta etapa pode ser pulada para fitas que foram revestidas com metal em uma estratégia de alta refletividade ou revestidas com nanotubos de carbono (CNT) em uma estratégia de baixa refletividade.
   2. Use um microscópio óptico (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) para capturar o mapa óptico de navegação da pastilha de silício.
   3. Coloque a pastilha de silício na câmara de amostra do SEM. Associe o mapa óptico de navegação à imagem do microscópio eletrônico identificando sequencialmente os dois marcadores aninhados em forma de L no palco da amostra.
   4. Use o módulo SAT no software de microscopia (v3.2, 64 bits) para identificar semi-automaticamente as posições das seções e áreas de imagem a partir do mapa óptico de navegação.
   5. Defina o tamanho do pixel da imagem para 4 nm, o tempo de permanência para 0,8 μs, pontos e posições de foco, e locais de armazenamento.
   6. Inicie a imagem contínua.

6. Processamento de dados

NOTA: A costura 2D das imagens OMLIT é realizada automaticamente pelo software. Para registro e segmentação 3D em grande escala de imagens OMLIT, outros algoritmos de IA mais poderosos estão disponíveis. Aqui, para a conveniência da maioria dos laboratórios verificar o processo, a costura, registro e segmentação usando Fiji (v1.54p, 64 bits) e VAST (v1.5.0, 64 bits) são demonstrados.

1. Abra o conjunto de imagens em Fiji arrastando a pasta contendo todos os arquivos de imagem para a interface Fiji e selecione Virtual Stack quando solicitado.
2. Use a Ferramenta Retangular para selecionar a região de interesse (ROI), depois corte o conjunto de dados via Imagem > Recortar.
3. Alinhe a pilha de imagens usando o plugin Register Virtual Stack Slices (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
4. Salve o conjunto de dados alinhado no formato TIFF (Arquivo > Salvar como > Tiff).
5. Importe a pilha de imagens TIFF para o VAST²² usando Importar > Importar volume de imagem de imagens para . Arquivo VSV.
   NOTA: Para um tutorial mais detalhado, consulte o site: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. Ao conectar um tablet externo, use a ferramenta pincel no Modo Desenhar Segmento para iniciar a segmentação manual e o traçado (use as teclas de atalho A e Z para navegar rapidamente entre fatias de imagem).
7. Visualize a estrutura segmentada em 3D usando o Window > 3D Viewer > Visualizar > Atualizar.
8. Salve os resultados da segmentação via Arquivo > Salvar Segmentação.

Results

O fluxo de trabalho geral do protocolo (Figura 1) começa com a preparação de diferentes fitas de coleta. A Figura 1 mostra os três tipos de fitas mencionadas no protocolo (da esquerda para a direita: Kapton, D-50 e PET revestido com CNT), que exibem propriedades ópticas distintas quando colocadas sobre o mesmo substrato de fundo. Após a preparação da amostra e o corte do bloco, algumas seções devem ser coletadas primeiro para mi...

Discussion

Aqui, desenvolvemos uma abordagem de imagem óptica, chamada OMLIT, que permite imagens mesoscópicas e é compatível com fluxos de trabalho de microscopia eletrônica de varredura serial baseadas em fita. Utilizando o método OMLIT, a microscopia óptica pode ser empregada para capturar características estruturais mesoscópicas de amostras cerebrais, incluindo vasos sanguíneos, corpos celulares, núcleos, principais ramos dendríticos e alguns grandes axônios mielinizados. Além disso, o OMLIT po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fita adesiva	3M	B5005094008	Adesivo dupla face
Microscópio de Força Atômica	Bruker	Ícone de Dimensão
Sistema automático de coleta de seção ultrafina	Lehua	AutoCUTS II
Fita adesiva condutora	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Faca de diamante para seccionamento	Diatomácea	DUJ3530	Faca Jumbo de Diatomeias
Faca de diamante para aparar	Diatomácea	DTB90	Faca de vidro
Microscópio eletrônico	Zeiss	MultiSEM505	Alternativa: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit)	Código aberto	https://fiji.sc
Faca de aparar vidro	Selfmade
Citrato de Chumbo	Leica	T534/2
Microscópio óptico	Olympus	VS200	Alternativa: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscópio óptico	Zeiss	Axio Imager.A2 Vario
Purificador de plasma	Yidon Technologies	Hydro-S4	Alternativas: Ted Pella Pelco ou outro limpador de plasma para bancada
Fita polimérica	Melton	Kapton	O site da empresa não está mais acessível. Recomendamos que os pesquisadores experimentem fitas KAPTON disponíveis localmente.
Fita polimérica	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Fita polimérica	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Pastilha de silício	Saichi	912303	A pastilha é polida de um lado.
Revestimento por Spal	Leica	ACE600	Alternativa: Sputter de cabeça dupla, Yujie
Ultramicrônomo	Leica	UC7	Alternativa: RMC PT-PC
Uranilacetato	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64 bits)	Instituto Médico Howard Hughes	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite é uma ferramenta gratuita para anotação manual e segmentação de grandes conjuntos de dados de microscopia 3D.
Software ZEN (v3.2, 64 bits)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html