Artigo de método

Detecção por Sonda Fluorescente por PCR de Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

8 de maio de 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo de testes clínicos baseado no método de sonda fluorescente PCR para detecção simultânea de Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii.

Resumo

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Este protocolo descreve um procedimento padronizado para a detecção qualitativa de Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii em amostras clínicas de escarro utilizando um kit de detecção de ácidos nucleicos fluorescentes por PCR. O procedimento envolve coleta clínica de amostras, pré-tratamento de liquefação alcalina, extração automatizada de ácidos nucleicos e detecção multiplex em tempo real por PCR. Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii são detectados usando sondas fluorescentes específicas para alvo (canais FAM, VIC e CY5, respectivamente), com controle interno (canal ROX) integrado para garantia de qualidade. A validade do ensaio e a interpretação dos resultados da amostra são baseadas em valores definidos do limiar do ciclo (Ct). Um controle positivo deve apresentar curvas de amplificação em formato de S com Ct ≤ 33,7 em todos os canais, enquanto o controle negativo não deve mostrar amplificação. Para amostras clínicas, um valor de Ct ≤ 33,7 no canal FAM indica positividade para Aspergillus spp., e um valor de Ct ≤ 36 nos canais VIC ou CY5 indica positividade para C. neoformans ou P. jirovecii, respectivamente.

Introdução

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Infecções fúngicas invasivas, como as causadas por Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii, representam uma ameaça significativa para pacientes imunocomprometidos, levando a alta morbidade e mortalidade. O diagnóstico oportuno e preciso é fundamental para iniciar a terapia antifúngica adequada e melhorar os resultadosclínicos 1. Métodos diagnósticos convencionais, incluindo cultura, microscopia e detecção de antígenos, apresentam limitações notáveis. A cultura é demorada e apresenta baixa sensibilidade, a microscopia não identifica em nível de espécie e depende do operador, enquanto ensaios de antígeno (por exemplo, galactomanano, β-D-glucano) podem apresentar reatividade cruzada e desempenho inconsistente. Diagnósticos moleculares, especialmente a PCR em tempo real, podem preencher algumas dessas lacunas ao oferecer tempos de resposta mais rápidos e potencial para alta sensibilidade e especificidade. Os avanços na PCR multiplex permitem ainda a detecção simultânea de múltiplos patógenos a partir de uma única amostra, melhorando a eficiência diagnóstica.

Este protocolo descreve um ensaio de PCR com sonda fluorescente multiplex para detectar qualitativamente DNA de Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii em amostras de escarro humano, direcionando regiões conservadas do gene rRNA 18S (Aspergillus spp.), do gene ITS (C. neoformans) e do gene rRNA mtLSU (P. jirovecii). Características-chave desse método incluem sensibilidade analítica definida: o limite de detecção para Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii é de 1.500 cópias/mL; Especificidade de primer/sonda: Primers e sondas específicos do alvo minimizam a reatividade cruzada com DNA humano ou outra flora comum; Controle robusto da contaminação: a incorporação de sistemas dUTP-UDG (uracil-DNA glicosilase) previne efetivamente a contaminação residual de amplicons PCR anteriores, uma característica crítica para manter a confiabilidade do ensaio em ambiente de laboratórioclínico 2; Controle integrado de processo: um controle interno endógeno direcionado ao gene RP (Proteína Ribossómica humana), marcado com fluoróforo ROX, é coamplificado para monitorar a integridade da extração de ácidos nucleicos e identificar possíveis inibições por PCR, reduzindo assim os resultados falsosnegativos 3. Essa abordagem é apoiada por diretrizes estabelecidas para garantia de qualidade em diagnóstico molecular 4,5. O protocolo é aplicável principalmente a amostras respiratórias (escarrotor/BALF) de populações de alto risco, como pacientes de hematologia-oncologia ou receptores de transplante. Possíveis limitações, incluindo falsos positivos por contaminação ambiental ou redução da sensibilidade devido à diluição excessiva da amostra, também são discutidas, juntamente com estratégias de mitigação.

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Protocolo

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O uso de amostras clínicas foi aprovado pelo comitê de ética apropriado (Aprovação nº: ZYS-GCP-2025006). Todos os participantes forneceram amplo consentimento informado para o uso de seus dados e amostras em pesquisas. Todos os reagentes e consumíveis usados neste protocolo estão listados noT de Materiais.

1. Coleta de amostras

  1. Colete de 3 a 5 mL de líquido de escarro ou lavagem broncoalveolar em recipientes estéreis e envie para análise rapidamente.

2. Preparação do reagente

NOTA: Essas etapas foram realizadas na sala de preparação do reagente.

  1. Retire o kit de detecção do freezer a -28 °C e descongele completamente em temperatura ambiente (25–30 °C) por 30 minutos.
  2. Calcule o número total de reações (N): N = número de amostras de teste (n) + controles positivos/negativos (2) + 1
  3. Prepare a mistura de reação em um tubo estéril de microcentrífuga. Para uma única reação: 35 μL de Mistura de Amplificação de Ácidos Nucleicos + 5 μL de Mistura Primer-Sonda, vórtice cuidadosamente e centrifuge brevemente.
  4. Aliquota de 40 μL da reação mistura em cada tubo de PCR (de acordo com o protocolo do fabricante do kit) e transfere para a janela de passagem da sala de processamento da amostras.

3. Processamento de amostras

NOTA: Essas etapas foram realizadas na Sala de Processamento de Amostras. Descarte de Resíduos: Descarte o sobrenadante da etapa 3.2.2 e outros resíduos líquidos contendo NaOH em um recipiente designado para resíduos químicos.

  1. Liquefação
    1. Adicione fluido de lavagem de escarro e broncoalveolar (BALF) a um tubo de tampa roscada de 50 mL.
    2. Adicione 1–2 volumes de solução digestiva de NaOH a 4% (em relação à viscosidade do escarro).
      ATENÇÃO: NaOH é corrosivo. Evite contato com pele e olhos.
    3. Aperte a tampa, faça o vórtice por 1 minuto e incube em um armário de biossegurança em temperatura ambiente por 15–20 minutos.
  2. Enriquecimento
    1. Centrifuge amostras liquefeitas a 3.000 rpm por 5 minutos.
    2. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta, retendo 1.000 μL de sedimento.
    3. Faça vórtice no sedimento cuidadosamente.
  3. Lise
    1. Transfira 500 μL de sedimento para um tubo de lise. Faça vórtice por 10 minutos e faça uma centrífuga breve.
  4. Extração
    NOTA: Descarte de Resíduos: Placas, ponteiras e tubos de extração usados que tenham contato com amostras biológicas devem ser descartados em um recipiente aprovado para resíduos bio-perigosos.
    1. Transfira todo o sobrenadante do lisado e 100 μL de controles negativo/positivo para a Coluna 2 da placa de extração.
    2. Realize extração de ácidos nucleicos usando um sistema automatizado de extração de ácidos nucleicos com o programadesignado 6.
  5. Carregamento de amostras
    1. Transfira 10 μL de ácido nucleico extraído (Coluna 6) e controles para tubos de PCR. Centrifuge brevemente e transfira para a janela de passagem da sala de amplificação.

4. Amplificação de ácidos nucleicos

NOTA: Esses passos foram realizados na Sala de Amplificação.

  1. Carregue os tubos de PCR no instrumento automatizado de amplificação nucleica e selecione o modelo de amplificação apropriado.
  2. Atribuir canais de detecção: Aspergillus spp.: canal FAM; C. neoformans: canal VIC; P. jirovecii: canal CY5; Controle interno: canaisROX 7, 8, 9.
  3. Defina nomes de exemplo e execute o programa.

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Resultados

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Curvas de amplificação representativas obtidas usando este ensaio de PCR fluorescente multiplex são mostradas nas Figuras 1 e 2. A validade do ensaio foi determinada com base em critérios de controle pré-definidos. Em uma execução válida, o controle positivo produziu curvas de amplificação características em formato de S nos canais FAM, VIC, CY5 e ROX, com valores de limiar de ciclo (Ct) ≤ 33,7 em todos os canais de detecção (

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Discussão

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O protocolo multiplex de PCR em tempo real estabelecido neste estudo fornece um procedimento padronizado para a detecção simultânea e rápida de três patógenos fúngicos invasores-chave (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii) em amostras clínicas de escarro. Esse método permite a detecção direta do DNA do patógeno a partir de amostras clínicas. Em contraste com abordagens diagnósticas tradicionais como cultura, microscopia ou teste sorológico de antígeno, esse ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao Departamento de Laboratório Clínico do Hospital Popular do Distrito de Shanshui, em Foshan, pelo fornecimento dos equipamentos e do suporte técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 & mu; Pontas de pipeta estendidas estéreis com ponta de filtro L (em trasfega)Xiaorui BiotecnologiaS20221126
1000 & mu; Ponteiras de pipeta estéreis LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu; Ponteiras de pipeta estéreis com filtro estendido LXiaorui Biotecnologia241001
Tubos de LiseÁrea de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology CoF1040
Kit de Detecção de Ácidos Nucleicos para Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jiroveciiÁrea de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology Co.CT8143-48T
Reagente de Extração de Ácidos NucleicosÁrea de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology CoCN8053-B40T
Buffer de diluição de amostrasÁrea de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology CoSP7065

Referências

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  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

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