Detecção por Sonda Fluorescente por PCR de Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de testes clínicos baseado no método de sonda fluorescente PCR para detecção simultânea de Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii.

Abstract

Este protocolo descreve um procedimento padronizado para a detecção qualitativa de Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii em amostras clínicas de escarro utilizando um kit de detecção de ácidos nucleicos fluorescentes por PCR. O procedimento envolve coleta clínica de amostras, pré-tratamento de liquefação alcalina, extração automatizada de ácidos nucleicos e detecção multiplex em tempo real por PCR. Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii são detectados usando sondas fluorescentes específicas para alvo (canais FAM, VIC e CY5, respectivamente), com controle interno (canal ROX) integrado para garantia de qualidade. A validade do ensaio e a interpretação dos resultados da amostra são baseadas em valores definidos do limiar do ciclo (Ct). Um controle positivo deve apresentar curvas de amplificação em formato de S com Ct ≤ 33,7 em todos os canais, enquanto o controle negativo não deve mostrar amplificação. Para amostras clínicas, um valor de Ct ≤ 33,7 no canal FAM indica positividade para Aspergillus spp., e um valor de Ct ≤ 36 nos canais VIC ou CY5 indica positividade para C. neoformans ou P. jirovecii, respectivamente.

Introduction

Infecções fúngicas invasivas, como as causadas por Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii, representam uma ameaça significativa para pacientes imunocomprometidos, levando a alta morbidade e mortalidade. O diagnóstico oportuno e preciso é fundamental para iniciar a terapia antifúngica adequada e melhorar os resultados^{clínicos 1}. Métodos diagnósticos convencionais, incluindo cultura, microscopia e detecção de antígenos, apresentam limitações notáveis. A cultura é demorada e apresenta baixa sensibilidade, a microscopia não identifica em nível de espécie e depe....

Protocol

O uso de amostras clínicas foi aprovado pelo comitê de ética apropriado (Aprovação nº: ZYS-GCP-2025006). Todos os participantes forneceram amplo consentimento informado para o uso de seus dados e amostras em pesquisas. Todos os reagentes e consumíveis usados neste protocolo estão listados noT de Materiais.

1. Coleta de amostras

1. Colete de 3 a 5 mL de líquido de escarro ou lavagem broncoalveolar em recipientes estéreis e envie para análise rapidamente.

2. Preparação do reagente

NOTA: Ess....

Results

Curvas de amplificação representativas obtidas usando este ensaio de PCR fluorescente multiplex são mostradas nas Figuras 1 e 2. A validade do ensaio foi determinada com base em critérios de controle pré-definidos. Em uma execução válida, o controle positivo produziu curvas de amplificação características em formato de S nos canais FAM, VIC, CY5 e ROX, com valores de limiar de ciclo (Ct) ≤ 33,7 em todos os canais de detecção (

Discussion

O protocolo multiplex de PCR em tempo real estabelecido neste estudo fornece um procedimento padronizado para a detecção simultânea e rápida de três patógenos fúngicos invasores-chave (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii) em amostras clínicas de escarro. Esse método permite a detecção direta do DNA do patógeno a partir de amostras clínicas. Em contraste com abordagens diagnósticas tradicionais como cultura, microscopia ou teste sorológico de antígeno, esse .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & mu; Pontas de pipeta estendidas estéreis com ponta de filtro L (em trasfega)	Xiaorui Biotecnologia	S20221126
1000 & mu; Ponteiras de pipeta estéreis L	Jiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd	241101
200 & mu; Ponteiras de pipeta estéreis com filtro estendido L	Xiaorui Biotecnologia	241001
Tubos de Lise	Área de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology Co	F1040
Kit de Detecção de Ácidos Nucleicos para Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii	Área de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology Co.	CT8143-48T
Reagente de Extração de Ácidos Nucleicos	Área de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology Co	CN8053-B40T
Buffer de diluição de amostras	Área de Saúde e Biociência do ZC de Pequim Technology Co	SP7065