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Artigo de método

Preparação de olhos suínos para microscopia de refletância confocal para visualizar a rede de fibras de colágeno vítreo

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DOI:

10.3791/68823

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17 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

Neste artigo

Resumo

Este método visualiza a estrutura nativa das fibras colágenas no corpo vítreo usando microscopia de reflectância confocal.

Resumo

O vítreo é um gel transparente que preenche o espaço entre o cristalino e a retina. Sua estrutura é sustentada por uma rede de fibras colágenas, o que provavelmente influencia as propriedades viscoelásticas e contribui para doenças da retina. No entanto, a organização dessa rede de colágeno permanece pouco caracterizada, pois a imagem do vítreo em seu estado nativo é desafiadora. Muitas técnicas de imagem aplicadas ao vítreo causam desidratação e distorção, e os métodos à base de corantes podem introduzir artefatos ou marcação inespecífica, dificultando o estudo da rede de colágeno. Neste protocolo, descrevemos: 1) um método para dissecar olhos suínos para imagem; 2) uma estratégia para montar os olhos em um microscópio invertido; 3) diretrizes para imagens da rede de colágeno vítreo em seu estado nativo usando microscopia de reflectância confocal; e 4) instruções para análise quantitativa de imagens de recursos de rede. Destacamos armadilhas comuns e enfatizamos os principais pontos técnicos. Relatamos a aplicação de microscopia de reflectância confocal no vítreo. Em comparação com as estratégias anteriores de imagem vítrea, essa abordagem preserva a estrutura, orientação e distribuição nativas das fibras colágenas vítreas sem corantes exógenos ou artefatos de desidratação. A microscopia de refletância confocal pode sondar a base estrutural da rigidez do gel vítreo na saúde e na doença.

Introdução

O vítreo é a matriz extracelular entre o cristalino e a retina do olho. A tração do vítreo na retina desempenha um papel importante na perda da visão em doenças como descolamento de retina, buraco macular e tração vitreomacular 1,2,3,4. A capacidade do vítreo de transmitir forças tracionais para a retina é determinada por sua rigidez em gel, que por sua vez depende das propriedades de seus principais componentes, colágeno e ácido hialurônico5. A rigidez do gel do vítreo é provavelmente influenciada por características da rede de fibras colágenas, uma vez que a rigidez dos géis artificiais de colágeno é impulsionada por características da rede, como densidade, alinhamento e largura da fibra6.

A rede de fibras colágenas vítreas é difícil de ser visualizada devido ao alto teor de água e baixa concentração de colágeno7, o que leva à distorção artificial durante o processamento para microscopia ou microscopia eletrônica de transmissão. A histologia tradicional e a microscopia eletrônica de transmissão requerem processamento para endurecer o vítreo para seccionamento fino. A desidratação necessária para a inclusão histológica faz com que as fibras vítreas se agreguem em uma configuração de favo de mel8, e a formação de cristais de gelo durante o congelamento aumenta o tamanho dos poros na matriz extracelular9. A incorporação de plástico8 e o congelamento rápido10 foram aplicados ao vítreo para minimizar o artefato, embora algum artefato residual provavelmente permaneça. A microscopia de contraste de fase é um método que não requer secção e tem sido aplicado no vítreo, mas requer a remoção de um pequeno pedaço de vítreo do olho, perdendo assim a posição e orientação originais da rede11. Mais recentemente, a microscopia quantitativa de luz polarizada tem sido usada para mapear a orientação média das fibras em um olho suíno grosseiramente seccionado, mas as fibras individuais não puderam ser resolvidas12. Além disso, as abordagens de rotulagem à base de corantes (por exemplo, azul de tripano, vermelho de picrosirius, 5-(4,6-Diclorotriazinil) Aminofluoresceína) podem introduzir artefatos ou rotulagem inespecífica e, portanto, foram evitadas para preservar a rede de colágeno nativo.

Adotamos o método de preparação de amostras usado por Filas et al. para estudo de microscopia de luz polarizada, ou seja, dissecção macroscópica em um bloco de agarose12, e imageamos o espécime usando microscopia de reflectância confocal, que não foi aplicada anteriormente ao vítreo. Usando este método, adquirimos imagens da rede de fibras colágenas vítreas em um estado hidratado e quase fisiológico. Isso oferece várias vantagens em relação aos métodos anteriores, incluindo artefatos reduzidos em comparação com abordagens baseadas em fratura por congelamento ou desidratação10,13. Este protocolo requer um microscópio confocal invertido com uma objetiva de imersão de pelo menos 30x de ampliação, uma abertura numérica maior que 0,9 e uma distância de trabalho maior que 200 μm. Incluímos orientações importantes para a preparação de amostras e aquisição de imagens para facilitar a resolução clara das fibras. Ao manter um estado quase nativo da matriz de colágeno vítreo, essa abordagem permite que os pesquisadores analisem quantitativamente a orientação, densidade e distribuição espacial da fibra - parâmetros que provavelmente são cruciais para entender a rigidez vítrea e suas alterações patológicas. Esta técnica é particularmente adequada para pesquisadores interessados na rede de colágeno vítreo, sua estrutura e a patogênese das doenças vítreo-retinianas.

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Protocolo

1. Preparação e dissecção de tecidos

NOTA: Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais. Em nossa instituição, não foi necessária a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais para realizar experimentos em olhos suínos ex vivo .

  1. Obtenha olhos suínos ex vivo de uma fábrica de processamento de carne. Use os olhos dentro de 48 h após a morte.
    NOTA: Embora a aparência vítrea não mude com o tempo pós-morte mais longo, a retina e a coroide se degradam, levando à dispersão de detritos celulares e pigmentados durante a dissecção. Esses detritos podem interferir na imagem e análise de fibras.
  2. Remova qualquer excesso de músculo e tecido conjuntivo do globo.
  3. Coloque o pedestal de três pinos na base de um molde de cubo, como um molde de cubo de gelo de silicone extragrande (Figura 1A e Figura 2).
  4. Coloque o globo no pedestal de três pinos, posicionando-o de forma que o limbo fique apoiado nos pinos.
  5. Faça um gel de agarose a 3% adicionando 3 g de agarose de uso geral a 100 mL de água destilada e, em seguida, aquecendo a solução até que seja dissolvida. Quando a solução tiver arrefecido a cerca de 37 °C, deitá-la na forma até que o olho esteja submerso em agarose.
    NOTA: Isso incorporará o olho em gel de agarose para estabilizar o olho para dissecção.
  6. Refrigere o cubo de agarose por pelo menos 4 h.
    NOTA: Isso aumenta a adesão do gel ao olho e garante que o olho permaneça imóvel durante a dissecção
  7. Após esfriar, remova o cubo de agarose do molde. Em seguida, remova o pedestal do cubo (Figura 1B).
  8. Construa uma moldura de três lados nas mesmas dimensões do cubo de agarose usando uma combinação de tijolos, placas e ladrilhos de Lego 1 x 8 (Figura 3).
    NOTA: Isso prenderá o cubo no lugar e fornecerá uma guia para a lâmina durante a dissecação. A altura da moldura de Lego determinará o local em que o olho será cortado. Isso pode ser visualizado através do gel de agarose semitransparente.
  9. Coloque o cubo de agarose resfriado na moldura de Lego. Segure uma lâmina de micrótomo de alto perfil pelas bordas cegas e alinhe a lâmina com a parte superior da moldura de Lego. Aplique uma leve pressão para baixo na parte superior do cubo e arraste suavemente a lâmina do micrótomo para frente e para trás por todo o cubo e pelo olho embutido (Figura 1C).
    NOTA: Isso criará uma seção de tecido ocular que está embutida na agarose, que será chamada de "tampa do olho".

2. Amostra de montagem para imagem

  1. Usando a lâmina do micrótomo, corte aproximadamente 1 mm de agarose de toda a superfície de corte do cubo (Figura 4A).
    NOTA: Isso deixará uma pequena seção da tampa do olho que se estende acima da superfície de corte do cubo de agarose
  2. Use um lenço de tecido ou uma pequena esponja triangular de celulose para secar a superfície de corte do cubo de agarose, especialmente perto da borda da tampa do olho.
  3. Adicione aproximadamente uma colher de chá de calafetagem de silicone multiuso a um pequeno saco plástico para sanduíche e faça um orifício de 3 mm em um dos cantos inferiores do saco para criar um saco de confeitar para a calafetagem.
  4. Usando o saco de confeitar, aplique uma fina camada de calafetagem na superfície de corte do cubo de agarose, bem ao longo da borda da tampa do olho, criando uma borda à prova d'água ao redor da amostra (Figura 4B). Isso evitará que o gel vítreo vaze para fora da tampa do olho.
  5. Coloque um copo grande sobre a tampa do olho e pressione para baixo para que a superfície cortada da tampa fique em contato com a lamínula sem nenhum ar ou fluido preso (Figura 4C). Confirme se o cordão de silicone faz uma vedação contínua com a lamínula.
    NOTA: Se a calafetagem de silicone não formar uma vedação contínua, o fluido vítreo pode vazar e permitir a entrada de ar na amostra. A exposição ao ar fará com que o vítreo encolha, resultando em fibras mais brilhantes e densas, bem como em uma área líquida sem fibras. Se o vítreo não estiver em contato com a lamínula, será difícil obter imagens.
  6. Enquanto segura o cubo de agarose, inverta a amostra e coloque-a no adaptador de lamínula grande para imagem em um microscópio invertido (Figura 4D e Figura 5).

3. Aquisição de imagem

  1. Use um microscópio confocal invertido que não seja do tipo disco giratório. Use uma objetiva de água (com água ou gel lubrificante ocular como acoplador) ou objetiva de óleo com pelo menos uma abertura numérica de 0.90, uma ampliação entre 30x-60x e uma distância de trabalho de pelo menos 200 μm.
  2. Ajuste as configurações do caminho da luz para o microscópio confocal para obter imagens de refletância. No lugar do espelho dicróico usado para redirecionar a luz excitante e transmitir a luz emitida para imagens de fluorescência, certifique-se de que haja um espelho divisor de feixe que redirecione uma proporção do laser iluminador e transmita uma proporção da luz refletida.
    NOTA: O sinal de refletância das fibras de colágeno vítreo é um pouco fraco, portanto, o ruído de fundo pode afetar a capacidade de imagem das fibras. Uma melhor relação sinal-ruído foi observada com um comprimento de onda de 473 nm, mas conseguimos obter imagens das fibras colágenas vítreas com comprimentos de onda variando de 405 nm a 635 nm.
  3. Defina os comprimentos de onda de detecção para incluir o comprimento de onda do laser iluminador.
  4. Para orientar a posição Z dentro da amostra, diminua a potência do laser para a configuração mais baixa possível e identifique o flash de luz refletida da lamínula. Isso acontecerá na parte inferior e superior da lamínula (Figura 6).
    NOTA: Perto da lamínula, há um sinal reflexivo considerável no fundo. Longe da lamínula, o sinal da luz refletida das fibras de colágeno diminui.
  5. Ajuste a posição z para que fique localizada acima da parte superior da lamínula e dentro da amostra.
  6. Aumente a potência do laser para um nível mais alto do que o normalmente usado para uma aplicação de fluorescência.
    NOTA: Há um artefato de anel reflexivo que estará no centro do campo de imagem. Uma combinação de zoom e descentramento do campo de imagem pode ajudar a excluir esse artefato (Figura 7).
  7. Use a média da linha e aumente o tempo de permanência do pixel nas configurações de aquisição de imagem, que são métodos padrão para aumentar a relação sinal-ruído em microscópios confocais.

4. Análise de imagem da largura da fibra usando CT-FIRE 14

  1. Instale o CT Fire seguindo as instruções deste site: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
    NOTA: As versões usadas aqui foram "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" e o tempo de execução do MATLAB, "MCR-2018b-win64". Ambos devem ser baixados para que o software funcione.
  2. Converta as imagens em tif de 8 bits e abra as imagens tif de 8 bits no CT-FIRE.
  3. Certifique-se de que o software esteja definido como CT-Fire no canto superior direito e selecione Executar.
  4. O CT-FIRE carregará automaticamente os resultados da análise para uma pasta chamada "ctfireout" localizada na mesma pasta da imagem original. Examine a qualidade da extração comparando o arquivo começando com o nome "OL_ctFIRE" com a imagem original. Para seguir este protocolo, use as seguintes configurações padrão para segmentação de imagem (ou seja, identificação de fibras): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15
    1. Se as fibras não forem identificadas com precisão, ajuste os parâmetros clicando no botão Atualizar na seção de parâmetros no canto superior direito.
      NOTA: Orientações sobre como ajustar os parâmetros podem ser encontradas na página 20 na seção "3 Notas" do manual CT-FIRE, que está localizado na pasta de aplicativos CTFIRE. Dicas adicionais podem ser encontradas no artigo de Liu et al. na seção 3.5.215.
  5. Ajuste as configurações de saída, se desejar, para limitar as fibras que aparecem nas imagens de saída. Para seguir este protocolo, use as seguintes configurações padrão: Comprimento mínimo da fibra [pixels]: 30; Res. de imagem [dpi]: 300; Largura da linha de fibra [0-2]: 0,5; Largura máxima da fibra [pixels]: 15
  6. Para converter as unidades de largura de pixel para μm, abra a imagem original em Fiji. Use as dimensões da imagem que aparecem em pixels e μm no canto superior esquerdo da janela de exibição para calcular uma proporção.

5. Análise de imagem da densidade da fibra, curvatura, alinhamento, lacunaridade, unidade de crescimento de hifas e dimensão fractal usando TWOMBLI16

  1. Baixe o TWOMBLI do https://github.com/wershofe/TWOMBLI.
  2. Siga as instruções no arquivo: TwombliDocumentation em "Instalação e dependências".
  3. Abra a pasta TWOMBLI_v1/programs e substitua AnamorfProperties.xml arquivo por AnamorfPropertiesEH.xml arquivo (Arquivo Suplementar 1).
  4. Na pasta TWOMBLI_v1/programs, substitua o arquivo Twombli_v1.ijm pelo arquivo Twombli_v2.ijm (Arquivo Suplementar 2).
  5. Crie uma pasta com pastas vazias chamadas "teste HDM", "teste de máscaras", "HDM" e "máscaras".
  6. Converta as imagens para tif de 8 bits.
  7. Coloque de 3 a 5 imagens em uma pasta de "entrada do conjunto de testes".
  8. Coloque todas as imagens a serem analisadas em uma única pasta sem subpastas chamadas "elegíveis".
  9. Em Fiji, clique em Plug-ins | Macros | Executar | escolha Twombli_v2.ijm em twombli/Programs.
  10. Siga as instruções para executar o TWOMBLI. Para seguir este protocolo, use os seguintes parâmetros: Saturação de contraste, 0,35; Largura mínima da linha, 3; Largura máxima da linha, 3; Janela de curvatura mínima, 40; Janela de curvatura máxima, 40; comprimento mínimo do ramo, 10; HDM máximo de exibição, 100; Diâmetro mínimo da lacuna, 0
    NOTA: Os parâmetros das imagens podem precisar ser ajustados. O software guiará o usuário na escolha dos parâmetros, e instruções adicionais podem ser encontradas no TwombliDocumentation.docx de arquivos, que acompanha o programa.

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Resultados

Um olho de cada um dos três porcos adultos jovens (uma fêmea de 4 meses, um macho de 5 meses e uma fêmea de 6 meses) foi fotografado após seccionar o olho em um plano axial através do limbo inferior. Seis locais de imagem foram adquiridos no plano de secção X-Y, espaçados de 4 mm. Em cada local de imagem, foi obtida uma grade contígua de 4 x 4 de imagens de 70 μm x 70 μm (Figura 8). Para cada porco, cada imagem foi analisada separadamente para vários parâmetros (Tabela 1).

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Discussão

Métodos anteriores de imagem vítrea mostraram agregação de fibras artefactuais13, perda de organização, orientação e localização da fibra17, ou dependiam de uma resolução muito maior com um campo de visão menor, limitando os insights sobre a distribuição da fibra10. A microscopia de refletância confocal de tecido fresco ex vivo, grosseiramente seccionado, fornece imagens em escala de mícron de fibras colágenas vítrea...

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Divulgações

Todos os autores não relatam conflitos de interesse relevantes.

Agradecimentos

Subsídio Básico do National Institutes of Health EY014800; Bolsa irrestrita de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Nova York, NY, para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais, Universidade de Utah; NIH NEI K08 EY034549; Fundação do Hospital Infantil Primário; Fundação E. Matilda Ziegler; Agradecemos aos Drs. Guillaume L. Hoareau e M. Austin Johnson pelos olhos suínos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose IVWR0710-500G
Silicone multiuso 1 calafetagem, transparenteGE2795576
Esponja de celulose (Weck-Cel Eye Spear)Beaver - Visitec000865
Pedestal personalizado de 3 pinos  NANA
Adaptador personalizado para montagem de vidro coberto grandeNANA
Vidro grande de cobertura para lâmina, 1,42" x  2,36" Nº 1Ted Pella260460-100
Lego (base clássica, 1 x 8 peças, 1 x 8 tijolos, 1 x 6 placas)Lego11023, 3008, 3666, 4162
Lâminas Microtome (perfil alto) & nbsp;Lieca Biosystems14035838926
Objetiva de silicone Olympus UPlanSApo 30xOlimpoUPLSAPO30XS
Bandeja grande de cubos de gelo de silicone (Samuelworld)Amazona713243280060
Lenços de tecido (Kimwipes) e nbsp;Kimberly Clark34120

Referências

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