É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Refinamento da produção de ribossomos OnePot PURE e brutos para síntese de proteínas livres de células reprodutíveis

1.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo atualizado para a produção do sistema OnePot 'Síntese de proteínas usando elementos recombinantes' (PURE) e ribossomos brutos para síntese de proteínas livres de células, com foco no controle do crescimento celular para minimizar as variações de lote para lote.

Resumo

Avanços recentes permitiram que o sistema livre de células de síntese de proteínas usando elementos recombinantes (PURE) fosse produzido em laboratórios individuais de forma econômica e com carga de trabalho reduzida. No entanto, a preparação dos 36 componentes proteicos e ribossomo, que compõem o PURE, ainda é uma tarefa complexa, com muito espaço para variações e erros. Apresentamos um procedimento detalhado e atualizado para fabricar PURE com base no protocolo OnePot publicado recentemente, que envolve a regulamentação de uma série de etapas importantes, em particular, a inoculação de culturas usando estoques de glicerol normalizados por densidade óptica (DO), monitoramento cuidadoso do crescimento celular e controle das concentrações finais de glicerol. Usando essa abordagem, relatamos preparações reprodutíveis de PURE de várias réplicas biológicas e usuários. Este protocolo serve como referência e ponto de partida para outros laboratórios fabricarem e solucionarem problemas de seus próprios sistemas PURE, aumentando assim a democratização das muitas aplicações que o PURE permite, como a construção bottom-up de sistemas biomoleculares e o desenvolvimento de células sintéticas.

Introdução

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) amadureceu como uma tecnologia para diversas aplicações, incluindo biofabricação, biossensoriamento e diagnóstico, prototipagem de partes e vias genéticas e metabólicas, engenharia rápida de proteínas e educação 1,2. Os sistemas CFPS usando componentes purificados, originalmente desenvolvidos como o sistema 'Síntese de proteínas usando elementos recombinantes' (PURE)3, oferecem uma série de vantagens sobre suas alternativas baseadas em lisados. Os sistemas PURE têm uma composição definida, consistindo em 36 fatores proteicos, o ribossomo de E. coli 70S e uma mistura definida de substratos químicos, incluindo trifosfatos de nucleosídeos (NTPs), aminoácidos e tRNAs, que podem ser adaptados à vontade para a aplicação necessária. Eles são, portanto, altamente adequados para estudos como incorporação de aminoácidos não canônicos, modelagem mecanicista e construção de baixo para cima de sistemas biomoleculares e células sintéticas1. Embora o PURE esteja disponível em fornecedores comerciais, seu custo (US$ 0,34 a US$ 1,63 por reação de 1 μL) é proibitivo para experimentação em larga escala; e a estratégia alternativa de produzir PURE internamente até agora tem sido prejudicada por protocolos de trabalho intensivo envolvendo purificação paralela de 36 proteínas e ribossomos4, que são difíceis de realizar de forma robusta e reprodutível, principalmente para usuários inexperientes.

Desenvolvimentos recentes ajudaram a produção caseira de PURE. Por exemplo, Wang et al. projetaram cepas de E. coli para incluir marcadores de hexa-histidina genomicamente integrados no maquinário de tradução, facilitando uma purificação em uma única etapa5. Os genes que codificam todas as proteínas PURAS foram reunidos em um pequeno número de plasmídeos, que também foram usados para reduzir o trabalho de purificação6. Villareal et al. projetaram consórcios elegantes de cepas PURE, que equilibram a expressão para produzir proteínas na proporção correta, ao mesmo tempo em que permitem a purificação em uma única etapa7.

O inovador sistema OnePot PURE desenvolvido por Lavickova et al. é uma grande promessa de facilidade de uso 8,9. Neste sistema, as cepas originais PURE são co-cultivadas e purificadas por meio de uma única etapa de cromatografia. Embora não seja possível definir com precisão a composição do sistema PURE resultante, os autores demonstraram que vários lotes do sistema são amplamente reprodutíveis, e um nível grosseiro de controle pode ser alcançado variando o volume de inoculação de cada cepa. A troca do controle de composição preciso pela facilidade de produção é aceitável para muitos usuários, uma vez que o rendimento geral da síntese de proteínas do sistema OnePot é semelhante ao obtido comercialmente. No entanto, embora existam protocolos detalhados para o sistema OnePot, tem sido um desafio reproduzir completamente os resultados de Lavickova et al. em outros laboratórios. Por exemplo, instabilidade do vetor de expressão, cepas de crescimento lento e proteólise foram observadas10.

Neste trabalho, apresentamos um protocolo OnePot PURE detalhado e refinado, que controla o crescimento celular usando estoques padronizados de glicerol e ajustes de meio, fornece orientação sobre o monitoramento do crescimento e da DO de colheita e normaliza a quantidade de glicerol na purificação final. Em segundo lugar, apresentamos um procedimento otimizado de purificação do ribossomo bruto usando apenas ultracentrifugação diferencial, que equilibra a compensação entre a atividade do ribossomo e o custo e a complexidade de métodos mais sofisticados.

Embora isso introduza mais etapas no protocolo OnePot, elas permitem ao usuário maior oportunidade de solucionar o procedimento de forma mais completa, se necessário, bem como modificá-lo de acordo com suas necessidades. Demonstramos a reprodutibilidade do processo mostrando múltiplas réplicas biológicas realizadas por vários usuários no mesmo laboratório. Descobrimos que o controle sobre os componentes PURE e a preparação do ribossomo são cruciais para garantir o alto desempenho do sistema em CFPS.

A preparação do PURE e do ribossomo leva 4 ou 5 dias, respectivamente, e pode ser realizada sequencialmente por um usuário ou simultaneamente por dois usuários. A preparação PURE envolve 4x500 mL de cultura líquida, cada uma produzindo ~ 2 g de pellet celular e ~ 1 mL de proteínas PURE a uma concentração de ~ 15 mg / mL. A preparação do ribossomo envolve 4 × 500 mL = 2 L de cultura líquida, levando a um total de ~ 3 g de pellet celular e produzindo ~ 1 mL de ribossomos brutos a uma concentração de ~ 17 μM. O protocolo atual produz sistemas PURE com rendimentos de síntese de até ~ 100 μg / mL GFP ou ~ 130 μg / mL de mCherry em 2 h de reação em lote11, o que se compara favoravelmente ao OnePot original, bem como aos sistemas comerciais (~ 140-160 μg / mL) 8 , 12 . Portanto, é um ponto de partida adequado para otimização adicional por meio da suplementação ou modulação de componentes sensíveis, como sais, agentes de aglomeração e fatores proteicos individuais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O protocolo é dividido em três partes. Por uma questão de concisão e clareza, enfatizamos as importantes mudanças específicas deste trabalho e, portanto, são referenciados detalhes que são os mesmos existentes em outras publicações.

O trabalho preliminar só precisa ser realizado uma vez. As quatro seções envolvem a preparação de estoques de glicerol e placas iniciais para as proteínas PURE, bem como a verificação e medição dos tempos de expressão das cepas. O uso de placas iniciais remove a variabilidade associada à inoculação direta de estoques de glicerol raspados. É crucial garantir que esse trabalho seja feito minuciosamente antes de prosseguir para o estágio de fabricação. Devido ao grande número de diferentes estoques de glicerol envolvidos na preparação do PURE, é essencial verificar a integridade do plasmídeo e a expressão de cada cepa antes de tentar produzir o sistema.

Um esquema do fluxo de trabalho é fornecido na Figura 1 e um cronograma recomendado na Tabela 1. Os materiais necessários e as etapas em que são usados são fornecidos na Tabela de Materiais, e o esboço dos buffers e mídias necessários em cada estágio está resumido na Figura Suplementar S1.

1. Trabalho preliminar

  1. Geração de estoques de glicerol
    NOTA: Todos os plasmídeos estão disponíveis na Addgene.
    1. Gerar 25% p/v de reservas de glicerol de todas as estirpes listadas no Quadro 2, seguindo os procedimentos normalizados9, e conservar em criogeniais a -80 °C.
  2. Preparação de placas de arranque PURE (durante a noite)
    1. Prepare 20 mL de meio LB suplementado com 100 μg / mL de ampicilina (LB + AMP).
    2. Rotule 36 tubos de microcentrífuga estéreis de 1.5 mL de #1 a #36.
    3. Adicione 500 μL de LB+AMP em cada tubo. Inocule cada tubo com a cepa correspondente usando uma ponta de pipeta para raspar uma pequena quantidade do estoque original de glicerol. Certifique-se de que os estoques de glicerol não descongelem. Vórtice para misturar bem.
    4. Alíquota de 300 μL de cada tubo inoculado para o alvéolo correspondente de uma placa estéril de 1 mL de 96 poços profundos, seguindo o esquema mostrado na figura 2.
      NOTA: Em todas as etapas subsequentes envolvendo placas, mantenha o mesmo layout de placa por toda parte.
    5. Incubar a placa durante a noite num agitador de placas a 37 °C, 1.000 RPM durante 15 h.
    6. No dia seguinte, prepare 25 mL de meio LB suplementado com 100 μg / mL de ampicilina (LB + AMP) e 15 mL de glicerol estéril a 50% (v / v).
    7. Transfira 30 μL de cada cultura da placa de poço profundo para o fundo de uma placa óptica de 96 poços, usando uma pipeta multicanal. Adicione 270 μL de meio LB+AMP em cada poço contendo culturas, para obter uma diluição de 10x de cada cultura.
    8. Meça o OD600 de cada cultura usando um leitor de placas. Calcular o volume de cada cultura necessário para inocular 650 μL de LB+AMP fresco até uma DOinicial 600 de 0,2. Uma planilha para ajudar nos cálculos é fornecida como Tabela Suplementar S1.
    9. Prepare três novas placas estéreis de 1 mL 96 de poços profundos. Em uma placa, adicione 650 μL de LB + AMP a 36 poços e inocule cada poço com o volume calculado de cultura durante a noite para obter OD600 = 0,2.
    10. Transferir 300 μL de cultura inoculada para cada uma das outras duas placas. Uma placa será a cultura e a outra será usada para monitorar a DO. Incubar as duas placas num agitador de placas a 37 °C, 1000 RPM, até as culturas atingirem OD600 ~ 1 (~1,5-2 h). Monitore o OD em 1 h e, em seguida, novamente conforme necessário, removendo amostras de 30 μL da segunda placa e adicionando 270 μL de LB + AMP para uma diluição de 10x.
    11. À medida que os poços individuais atingem OD600 ~ 1, remova-os do agitador. Adicione um volume igual de glicerol estéril a 50% (v / v) a cada cultura para atingir uma concentração final de OD600 = 0,5 em glicerol a 25%. Misture bem e guarde esses tubos no gelo. Estes são os principais estoques de trabalho.
    12. Alíquota de um máximo de 40 μL de cada matéria-prima em placas de PCR de 96 poços, mantendo o padrão original do poço. Distribua no maior número possível de pratos com base na capacidade de armazenamento. Sele com selos de placa de alumínio e armazene essas placas de partida PURE a -80 °C.
      NOTA: Essas placas iniciais devem ser descongeladas no máximo 3x. Substitua por placas novas se exceder esse limite para manter a integridade e a reprodutibilidade da tensão.
  3. Determinação dos tempos de crescimento da cultura inicial (durante a noite)
    1. Descongele um prato inicial PURE no gelo.
    2. Adicione 50 μL de ampicilina 100 mg / mL a 50 mL de meio LB estéril em um tubo cônico estéril (LB + AMP).
    3. Rotule 36 tubos de microcentrífuga estéreis de 1.5 mL de # 1 a # 36 e adicione 1 mL de LB + AMP a cada tubo.
    4. Adicione 10 μL de cada um dos estoques de glicerol ao tubo rotulado correspondente e misture bem por vórtice.
    5. Adicione 300 μL da cultura inoculada de cada tubo no poço correspondente de uma placa estéril de 1 mL de 96 poços profundos. Selar as placas com um selo de placa respirável e incubar a placa de cultura num agitador de placas a 1000 RPM, 37 °C. Determine e registre o tempo que leva para as culturas atingirem OD600 ~ 2-3 sem exceder OD600 = 3. Estabeleça esse parâmetro antes de continuar.
      NOTA: Em nosso laboratório, isso leva 15 h.
  4. Teste de expressão de cepas PURE
    1. Prepare 38 mL de meio LB suplementado com 100 μg/mL de ampicilina (LB+AMP), estoque de IPTG 10 mM e 1x reagente de extração de proteína.
    2. Descongele um prato inicial PURE no gelo.
    3. Adicione 1 mL de LB + AMP a cada um dos 36 poços de uma placa estéril de 2 mL de 96 poços profundos. Inocular cada alvéolo com 20 μl da cultura inicial correspondente. Incubar a placa num agitador de placas a 1000 RPM, 37 °C, durante cerca de 1 h ou até atingir OD600 = 2.
    4. Induza a expressão de proteínas adicionando 10 μL de 10 mM IPTG a cada poço, para uma concentração final de IPTG de 0,1 mM. Continue a incubação por 3 h a 1000 RPM, 37 °C.
    5. No final do período de expressão de 3 h, transfira 700 μL de cada cultura para tubos de microcentrífuga estéreis de 36 x 1,5 mL. Centrifugar a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    6. Ressuspenda cada pellet em 70 μL de 1x reagente de extração de proteína. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente sob agitação suave para permitir a lise celular.
    7. Centrifugar lisados a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C para granular a fracção insolúvel.
    8. Realize a purificação His-tag em pequena escala de cada proteína usando esferas magnéticas Ni-NTA de acordo com as instruções do fabricante.
    9. Analise proteínas purificadas usando SDS-PAGE para confirmar a expressão de cada proteína e / ou contaminação cruzada entre cepas9.
      NOTA: As cepas que expressam proteína exibirão bandas distintas no SDS-PAGE correspondentes ao peso molecular esperado da proteína alvo. Se nenhuma banda for detectada, a cepa pode não estar expressando a proteína. Nesses casos, isole e sequencie o plasmídeo para confirmar a identidade e integridade da sequência e, se necessário, substitua o plasmídeo.

2. Purificação da proteína OnePot PURE (4 dias)

NOTA: Uma única preparação do sistema PURE requer o processamento de 500 mL de cultura líquida. É aconselhável produzir 4 preparações de 500 mL simultaneamente para produzir quatro lotes PURE independentes em uma única execução. Esses lotes podem então ser quantificados independentemente ou combinados, se apropriado. O protocolo de 4 dias pode ser reduzido para 3 dias realizando a etapa de incubação da resina durante a noite, mas isso envolve um longo terceiro dia. Ambas as opções são detalhadas abaixo.

  1. Dia 1: preparação de materiais e crescimento de culturas iniciais
    1. Prepare soluções de estoque e tampões para a preparação PURE conforme descrito na Tabela Suplementar S2 e na Figura Suplementar S1.
      NOTA: Prepare a mídia e os buffers relevantes necessários imediatamente antes da execução de cada parte do protocolo e armazene apenas pelo número máximo de dias antes do uso, conforme indicado.
    2. Descongele um prato inicial PURE no gelo.
    3. Adicione 50 μL de ampicilina 100 mg / mL a 50 mL de meio LB estéril em um tubo cônico estéril de 50 mL (LB + AMP).
    4. Rotule 36 tubos de microcentrífuga estéreis de 1.5 mL de # 1 a # 36 e adicione 1 mL LB + AMP a cada tubo.
    5. Adicione 10 μL de cada um dos estoques de glicerol ao tubo rotulado correspondente e misture bem por vórtice.
      NOTA: Para rastrear facilmente a inoculação de cada cepa, depois de adicionar a cepa a cada tubo, ejete a ponta da pipeta no poço correspondente da placa inicial PURE. Repita este processo para todas as cepas. Depois de concluído, remova as pontas da pipeta cuidadosamente da placa antes de selar novamente com papel alumínio e fita de autoclave e armazenar a -80°C.
    6. Adicionar 300 μL da cultura inoculada de cada tubo no poço correspondente de uma placa estéril de 1 ml de 96 poços profundos, exceto a estirpe #25 (EF-Tu). Placas de vedação com uma vedação de placa respirável. Incubar a placa de cultura num agitador de placas a 1.000 RPM, a 37 °C, durante 14 h.
    7. Adicione 1 mL de cultura inoculada do tubo #25 a 10 mL de LB em um tubo cônico de 50 mL para preparar a cultura inicial EF-Tu. Incubar o tubo numa incubadora a 260 RPM, 37 °C durante 14 h.
      NOTA: A cepa # 25, EF-Tu, é necessária em uma concentração muito maior do que os outros componentes e, portanto, é processada separadamente, conforme descrito no protocolo original8.
    8. Coloque 2 L de meio estéril 2x YTP em um frasco de vidro de 2 L e coloque em incubadora estática a 37°C para pré-aquecer durante a noite.
  2. Dia 2: crescimento e peletização
    1. Prepare os reagentes necessários:
      1. 2 L de meio YTP pré-aquecido estéril 2x (a partir do dia 1)
      2. 2 mL de ampicilina 100 mg/mL
      3. 100 mM IPTG, estéril
      4. 100 mL de PBS, estéril, gelado
      5. 10 mL LB de mídia
    2. Transfira 30 μL de cada cultura inicial da placa de poço profundo do iniciador e do tubo de partida EF-Tu para o fundo de uma placa óptica de 96 poços, usando uma pipeta multicanal.
    3. Adicione 270 μL de meio LB em cada poço contendo culturas, para obter uma diluição de 10x de cada cultura.
    4. Meça o OD600 de cada cultura usando um leitor de placas. Todas as cepas devem estar em OD600 = 2-3.
      NOTA: Se uma cultura cresceu demais acima de OD600 = 3, dilua para OD600 = 3 usando 2x YTP + AMP (Tabela Suplementar S1). A diluição de fermentos crescidos pode ser demorada e propensa a erros. Como tal, é aconselhável estabelecer o tempo exato de incubação necessário para atingir OD600 2-3, conforme descrito na Seção 1.3 do trabalho preliminar.
    5. Transfira 500 mL de meio YTP 2x pré-aquecido e 500 μL de ampicilina 100 mg / mL para um frasco defletor estéril de 2,5 L (2x YTP + AMP).
    6. Em um único tubo cônico estéril de 15 mL, adicione 55 μL de cada cultura da placa de cultura inicial e 1675 μL da cultura EF-Tu. Misture bem por vórtice.
      NOTA: Esta é a cultura OnePot que combina todas as estirpes PURE. É nesta fase que os sistemas knockout (ΔPURE) podem ser criados deixando de fora algumas cepas, ou outros componentes que requerem co-purificação podem ser adicionados.
    7. Adicione o conteúdo deste tubo ao frasco defletor de 2,5 L contendo 500 mL de 2x YTP+AMP. Repita as etapas 5 a 7 para obter 4x culturas independentes.
    8. Incubar os frascos a 260 RPM (37 °C) durante 1,5-2 h até OD600 = 0,2-0,3.
    9. Uma vez atingidoOD 600 = 0,2-0,3, inocular cada balão com 500 μL de IPTG 100 mM, para uma concentração final de indução de 0,1 mM IPTG.
    10. Incubar as culturas durante mais 3 h a 260 RPM, a 37 °C.
    11. Durante a incubação, pesar e rotular quatro tubos cônicos estéreis de 50 mL.
    12. Pré-resfrie centrífugas a 4 ° C conforme necessário e rotule e pré-resfrie quatro frascos de centrífuga de copolímero de polipropileno.
    13. Coloque quatro garrafas de vidro rotuladas de 500 mL em um banho de água gelada.
    14. No final das 3 h de incubação, decantar cuidadosamente cada cultura para uma garrafa de vidro com gelo para terminar o crescimento.
      NOTA: A transferência de culturas para garrafas resfriadas é essencial para interromper rapidamente o crescimento: colocar frascos quentes diretamente no banho de água gelada não resultará em uma interrupção eficiente do crescimento. Todas as etapas subsequentes são feitas no gelo, salvo indicação em contrário.
    15. Adicionar 250 ml de cada cultura nos frascos de centrifugação correspondentes e centrifugar a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min, mantendo os restantes 250 ml em banho-maria gelado.
    16. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante e secar em papel toalha.
    17. Adicione os 250 ml restantes de cada cultura aos frascos de centrifugação correspondentes e centrifugue novamente a 3.220 × g, 4 °C, por 10 min.
    18. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante e secar em papel toalha.
    19. Adicione 20 mL de PBS gelado estéril em cada frasco de centrífuga e ressuspenda completamente o pellet celular.
    20. Transfira cada ressuspensão para os tubos cônicos de 50 mL preparados.
    21. Centrifugar os tubos a 2.000 × g, 4 °C, durante 8 min.
    22. Remover o sobrenadante decantando cuidadosamente.
    23. Centrifugar novamente os tubos a 2.000 × g, 4 °C, durante 2 min.
    24. Remova o sobrenadante residual por pipetagem e mantenha os grânulos celulares no gelo.
    25. Cada tubo agora contém o pellet celular de uma única cultura de 500 mL. Pese cada tubo, calcule a massa do pellet celular (normalmente, ~ 2 g) subtraindo o peso vazio de cada tubo e registre.
    26. Estalar os grânulos de células congeladas e conservar a -80 °C até à lise.
      NOTA: Opcionalmente, o protocolo pode ser concluído em 3 dias, prosseguindo diretamente para a etapa de lise neste momento.
  3. Dia 3: lise, purificação e diálise
    1. Prepare os reagentes necessários:
      1. Prepare 50 mL de tampão de ressuspensão.
      2. Prepare 0,5 M TCEP.
    2. Descongele os pellets de células no gelo.
    3. Alicote 50 mL de tampão de ressuspensão em um tubo cônico de 50 mL e adicione 100 μL de TCEP 0,5 M. Misture bem por vórtice.
    4. Ressuspenda os grânulos celulares em tampão de ressuspensão + TCEP na proporção de 2 mL por 1 g de grânulo celular. Vórtice completamente para ressuspender.
    5. Distribua a ressuspensão celular em tubos cônicos de 50 mL, de modo que cada tubo tenha 5 mL de suspensão. Rotule os tubos conforme necessário para acompanhar as 4 culturas independentes. Armazene no gelo.
    6. Lise as células por sonicação a 30% de amplitude, 20s ligados, 20s desligados, por 10 ciclos em banho-maria gelada usando uma sonda de sonicação resfriada ( Figura 3A , B ).
      NOTA: Aproximadamente 1000 J de energia devem ser transferidos para cada tubo durante a sonicação. Use um suporte seguro para manter o tubo no lugar durante a sonicação para garantir a consistência da transferência de energia.
    7. Distribuir o lisado em tubos de microcentrífuga estéreis de 2 ml, de modo a que cada tubo contenha 1 ml de lisado. Repita as etapas 2.3.6 e 2.3.7 para lisar todas as quatro culturas. As etapas a seguir são realizadas para 4 lisados em paralelo.
    8. Centrifugar a 15.923 × g, 4 °C, durante 20 min.
    9. Durante a centrifugação, lave e equilibre 5 mL de resina de purificação de proteínas (prepare quatro colunas para os quatro lisados):
      1. Adicione 2 mL de resina de purificação de proteína fresca a uma coluna de cromatografia de fluxo por gravidade.
      2. Lave a coluna com 30 mL de água destilada estéril duas vezes para remover o etanol de armazenamento.
      3. Suplemente 30 mL de tampão de ressuspensão com 60 μL de TCEP 0,5 M até uma concentração final de 1 mM.
      4. Como a coluna tem um volume de 30 mL, despeje tampões diretamente na coluna para preenchê-la. Certificando-se de que a válvula está fechada, equilibre a coluna adicionando 30 mL de tampão de ressuspensão + TCEP.
      5. Abra a válvula para permitir que ~ 25 mL de tampão fluam, antes de fechar a válvula de coluna, deixando ~ 5 mL de tampão acima do leito de resina para evitar a secagem. A coluna agora está pronta para uso.
    10. Após a centrifugação, combine todo o sobrenadante clarificado sem pellets de cada cultura em 4 tubos cônicos frescos de 50 mL no gelo.
    11. Ressuspenda a resina nos 5 mL restantes de tampão de ressuspensão + TCEP dentro de cada coluna e adicione tampão e resina em cada um dos tubos cônicos contendo o sobrenadante do lisado.
    12. Feche e feche a tampa com Parafilm e incube em um agitador de espeto a 4 ° C por 5 h.
      NOTA: Se a lise foi realizada imediatamente após o crescimento, este lisado pode ser incubado com resina durante a noite.
    13. Prepare os reagentes necessários:
      1. Adicione TCEP a uma concentração final de 1 mM aos tampões de lavagem e eluição e armazene a 4 °C até o uso.
      2. Mantenha 20% (v/v) de etanol pronto.
    14. Após a incubação, pulse brevemente os tubos em uma centrífuga para coletar a resina até o fundo do tubo.
    15. Ressuspenda a resina usando uma pipeta e adicione a resina de volta à coluna de purificação de proteínas.
    16. Uma vez que a resina tenha se depositado em um leito na parte inferior da coluna, deixe o tampão passar.
      NOTA: Opcionalmente, colete o fluxo e as lavagens durante a purificação da proteína para análise via SDS-PAGE para solucionar problemas do procedimento de purificação
    17. Coluna de lavagem com um volume de coluna de tampão de lavagem + TCEP.
    18. Adicione 5 mL de tampão de eluição + TCEP na coluna, ressuspenda a resina algumas vezes com uma pipeta e incube por 10 min.
    19. Após a incubação, colete a eluição em um tubo de bijuteria rotulado de 5 mL e guarde no gelo.
    20. Limpe e armazene a resina de purificação de proteínas:
      1. Após a conclusão da eluição, lave a coluna com 30 mL de tampão de eluição para remover quaisquer proteínas ligadas restantes.
      2. Enxágue a resina com 30 mL de água destilada estéril, repetida 3x.
      3. Passe 30 mL de etanol a 20% (v/v) pela coluna uma vez.
      4. Encha a coluna com etanol a 20% e feche com uma tampa ou parafilme. Conservar a 4 °C até à próxima utilização.
        NOTA: Apenas a limpeza é necessária - não tente retirar o níquel da resina. A resina limpa é apropriada para reutilização em preparações padrão do sistema PURE; no entanto, para variantes do sistema ΔPURE, sempre use resina nova para evitar contaminação cruzada.
    21. Mergulhe um de diálise de 15 mL 2 kDa em tampão HT (sem TCEP) por 10 min.
    22. Adicione 5 mL de solução proteica eluída no de diálise.
    23. Remova o máximo de ar possível do antes de colocar a tampa novamente.
    24. Dialisar 5 mL de proteína eluída contra 1 L de tampão HT (sem TCEP) por 2 h, seguido por mais 1 L de tampão HT fresco durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
      NOTA: Se combinar eluições de várias purificações, até 10 mL de eluição podem ser dialisados contra 2 L de tampão HT por 2 h, seguidos por mais 2 L de tampão HT durante a noite a 4 ° C. Se a incubação da resina foi realizada durante a noite, a diálise pode ser realizada durante o dia usando um protocolo de 2 h seguido de 4 h, seguido imediatamente pelas etapas de concentração de proteína abaixo.
  4. Dia 4: concentração e armazenamento
    1. Preparação dos reagentes necessários:
      1. Prepare a atualização do buffer HT + TCEP.
      2. Prepare Stock-60 + TCEP.
    2. Após a conclusão da diálise, remova 5 mL da amostra dialisada do e distribua alíquotas de 500 μL em tubos de microcentrífuga estéreis de 5 x 2 mL.
    3. Centrifugar para granular quaisquer proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 °C, durante 10 min.
    4. Recombine o sobrenadante sem pellets e adicione a uma unidade de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa e complete o volume com 10 mL de Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Centrifugue a 3.220 × g, 4 °C, por 30 min OU até que o volume da amostra tenha reduzido para 1,5 mL.
      NOTA: A precipitação de proteínas durante as etapas de concentração pode reduzir significativamente o desempenho geral da CFPS. Após cada ciclo de centrifugação de 30 minutos, use uma pipeta de 1 mL para ressuspender a amostra no tubo do filtro centrífugo para desalojar quaisquer proteínas precipitadas do fundo do filtro.
    6. Remova a amostra da unidade centrífuga e distribua alíquotas de 500 μL em tubos de microcentrífuga estéreis de 3 x 2 mL.
    7. Gire para granular quaisquer proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 ° C, por 10 min.
    8. Recombinar o sobrenadante sem pellets num tubo de microcentrífuga estéril fresco sobre gelo.
    9. Determine a concentração de proteínas em solução usando um ensaio de Bradford, seguindo as instruções do fabricante.
    10. Concentrar a solução proteica adicionando a um novo filtro MWCO de 3 kDa e centrifugando a 14,862 × g, 4 °C, durante 15 min OU até atingir o volume da amostra, para obter uma concentração final de 25-30 mg/ml.
    11. Remova a amostra da unidade centrífuga e distribua alíquotas de 500 μL em tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL.
    12. Centrifugar para granular quaisquer proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 °C, durante 10 min.
    13. Determine a concentração de proteína usando um ensaio de Bradford. Só prossiga para a próxima etapa se a concentração estiver entre 25 e 30 mg / mL.
    14. Recombinar o sobrenadante sem pellets num novo tubo de microcentrífuga sobre gelo.
    15. Adicione um volume igual de Stock-60 + TCEP à solução de proteína concentrada e misture por pipetagem suave.
    16. Determine a concentração final de proteína usando um ensaio de Bradford.
      NOTA: A proteína está agora em tampão HT + 30% de glicerol, e qualquer diluição adicional com Stock-30 não altera a concentração de glicerol.
    17. Se necessário, dilua a amostra com Stock-30 + TCEP para atingir uma concentração final de aproximadamente 12,5 mg / mL.
    18. Alíquota da solução proteica PURE em tubos de PCR a alíquotas de 20 μL, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.
      NOTA: É crucial determinar a concentração de proteína com precisão antes de adicionar Stock-60, pois a concentração de soluções proteicas contendo glicerol pode resultar em desempenho inconsistente da CFPS, devido a quantidades variáveis de glicerol na reação final da CFPS. O estoque-60 deve, portanto, ser adicionado somente após a confirmação de que a concentração de proteína está dentro da faixa ideal de 25-30 mg / mL.

3. Preparação do ribossomo bruto (5 dias)

NOTA: O protocolo de purificação do ribossomo foi otimizado para o processamento de 2 L (4 frascos de 500 mL) de cultura líquida, levando a um total de ~ 3 g de pellet celular e produzindo ~ 1 mL de ribossomos brutos a uma concentração de 15-24 μM.

  1. Dia 1: preparação e crescimento das culturas iniciais
    1. Prepare soluções-mãe e tampões para a preparação do ribossomo, conforme descrito na Tabela Suplementar S2 e na Figura Suplementar S1.
      NOTA: prepare a mídia e os buffers relevantes necessários imediatamente antes da execução de cada parte do protocolo e armazene apenas pelo número máximo de dias antes do uso, conforme indicado.
    2. Prepare dois tubos cônicos de 50 mL: adicione 10 mL de meio LB a um tubo e 5 mL de meio LB ao outro.
    3. Remova o estoque de glicerol de BL21 (DE3) do freezer a -80 ° C e coloque no gelo, garantindo que as próximas etapas sejam concluídas antes que o estoque descongele.
    4. Inocular os 10 ml de meio LB com uma raspagem das células do stock de glicerol, para criar uma "minicultura" LB. Incubar a 37 °C, 220 RPM, juntamente com o outro tubo (não inoculado) para verificar se há contaminação do meio, uma vez que todos os crescimentos são feitos sem antibióticos.
    5. Substitua o estoque de glicerol no freezer a -80 °C.
    6. Coloque 2,2 L de Terrific Broth (TB) estéril em frascos de vidro esterilizados e armazene em uma incubadora estática a 37 ° C para pré-aquecer durante a noite.
  2. Dia 2: crescimento e peletização
    1. Remova as culturas da incubadora e certifique-se de que não haja contaminação no tubo não inoculado ou no frasco de mídia pré-aquecido antes de prosseguir.
    2. Prepare uma diluição de 10x adicionando 100 μL da minicultura a 900 μL de LB em uma cubeta de 1 cm e meça o OD600 usando um espectrofotômetro (verifique se é ~ 4-6).
    3. Adicione 200 mL da TB pré-aquecida a um frasco cônico estéril de 500 mL e inocule com o volume apropriado de minicultura para obter uma DO inicialde 600 = 0,05 (Tabela Suplementar S1). Esta é a 'cultura midi'.
    4. Incubar a cultura midi a 37 °C, 220 RPM até OD600 = 1, o que deve levar aproximadamente 1,5-2 h.
    5. Adicione 500 mL de TB a cada um dos 4 frascos defletores estéreis de 2,5 L. Inocular cada um com um volume apropriado de cultura midi para obter uma DO inicial600 = 0,05 (Tabela Suplementar S1). Estas são as 4 'maxi-culturas'.
    6. Incubar as maxiculturas a 37 °C, 220 RPM até OD600 = 0,7-0,8, o que deve levar aproximadamente 1,5-2 h.
    7. Enquanto isso, rotule e coloque quatro frascos de centrífuga de copolímero de polipropileno limpos e 4 frascos de vidro limpos de 500 mL no gelo para esfriar.
      NOTA: Meça a densidade máxima da cultura a cada 15 min após 1 h de crescimento para evitar ultrapassar OD600 = 0,7.
    8. Assim que OD600 = 0,7 for atingido, transfira rapidamente as culturas para garrafas de vidro resfriadas e coloque em banho de água gelada por 20 minutos para interromper o crescimento.
      NOTA: A transferência de culturas para garrafas resfriadas é essencial para interromper rapidamente o crescimento: colocar frascos diretamente no banho de água gelada não resultará em uma interrupção eficiente do crescimento. Todas as etapas subsequentes são feitas no gelo, salvo indicação em contrário.
    9. Enquanto as culturas estão esfriando no banho de água gelada, pré-resfrie a centrífuga para peletização de células e coloque 500 mL de solução de PBS no gelo para esfriar.
    10. Após 20 min, transferir 250 ml de cada cultura para o frasco de centrifugação pré-arrefecido correspondente e centrifugar a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min, mantendo os restantes 250 ml em gelo.
    11. Transvasar cuidadosamente o sobrenadante e secar em papel toalha.
    12. Adicionar os restantes 250 ml de cada cultura ao frasco de centrifugação correspondente e centrifugar novamente a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    13. Remova o sobrenadante por decantação e seque as garrafas em papel toalha antes de colocar os pellets de células de volta no gelo.
    14. Adicione 30 mL de PBS gelado estéril em cada frasco de centrífuga e ressuspenda completamente o pellet celular.
    15. Pese e rotule 4 tubos cônicos limpos de 50 mL.
    16. Transfira a suspensão celular para os tubos cônicos de 4 x 50 mL.
    17. Centrifugar novamente a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    18. Remover o sobrenadante por decantação e secar os tubos em papel toalha antes de voltar a colocar os sedimentos celulares no gelo.
    19. Adicione 30 mL de PBS gelado estéril em cada tubo cônico e ressuspenda completamente o pellet celular por vórtice.
    20. Centrifugar novamente a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    21. Remover o sobrenadante por decantação e secar os tubos em papel toalha antes de voltar a colocar os sedimentos celulares no gelo.
    22. Adicione 30 mL de PBS gelado estéril em cada tubo cônico e ressuspenda completamente o pellet celular por vórtice.
    23. Centrifugar novamente a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    24. Remova o sobrenadante por decantação e seque as garrafas em papel toalha antes de colocar os pellets de célula de volta no gelo.
    25. Centrifugar uma última vez a 3,220 × g, 4 °C, durante 2 min.
    26. Remova qualquer excesso de sobrenadante pipetando.
    27. Pesar e registar a massa de cada tubo cónico. A massa do pellet celular é a diferença entre esses valores e o peso vazio dos tubos (deve ser ~ 1 g).
    28. Congele os grânulos de células com azoto líquido e armazene a -80 °C.
  3. Dia 3: lise, ultracentrifugação e imersão em tampão B
    1. Descongele os pellets de células no gelo.
    2. Adicione 50 mL de tampão ribossomo A em um tubo cônico limpo.
    3. Pegue 100 μL de tampão ribossomo A do tubo cônico e adicione a um frasco de DTT sem peso. Dissolva completamente o pellet DTT para obter um estoque de 0,5 M DTT.
      NOTA: Prepare os estoques subsequentes de 0,5 M DTT conforme descrito aqui, mas usando o buffer apropriado para cada etapa.
    4. Adicione 100 μL de 0,5 M DTT de volta ao tubo cônico de 50 mL para obter uma concentração final de 1 mM DTT em 50 mL de tampão ribossomo A. Mantenha a solução no gelo.
    5. Ressuspenda cada pellet celular em Ribosome Buffer A + DTT, na proporção de 2 mL por 1 g de pellet celular, por vórtice completo. Combine todas as células ressuspensas em um tubo cônico para verificar o volume total de pasta ressuspensa, que deve ser de 10 mL de 2 L de cultura. Se necessário, complete o volume para 10 mL com tampão ribossomo extra A + DTT.
    6. Divida a pasta em 2 amostras de 5 mL em tubos cônicos separados.
    7. Lisar as células em cada tubo por meio de sonicação a 30% de amplitude, 20 s ligado, 20 s desligado por 10 ciclos (3 min 20 s de duração total do programa), em banho de água gelada, usando uma sonda de sonicação resfriada ( Figura 3A, 3C ).
      NOTA: Aproximadamente 1.000 J de energia devem ser transferidos por tubo durante a sonicação. Use um suporte seguro para manter o tubo no lugar durante a sonicação para garantir a consistência da transferência de energia.
    8. Aumente o volume de cada amostra lisada para 25 mL com o tampão ribossomo A + TDT e vore brevemente para misturar.
    9. Transfira o conteúdo para 2 tubos de centrifugação S30 resfriados.
    10. Centrifugar a 30.000 × g durante 1 h a 4 °C (figura 3E).
    11. Recupere no máximo 75% do sobrenadante livre de pellets (para evitar a contaminação da membrana pelo pellet) de cada tubo S30 em dois tubos S30 pré-resfriados limpos.
    12. Centrifugar a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C.
    13. Recupere um máximo de 75% do sobrenadante livre de pellets em dois tubos cônicos limpos de 50 mL e complete o volume de cada um para 25 mL com Ribosome Buffer A + DTT.
    14. Transfira a amostra para dois tubos S100 pré-resfriados limpos.
      NOTA: Certifique-se de que os tubos estejam balanceados com precisão (diferença máxima de 0.01 g entre os tubos opostos) antes da ultracentrifugação e sejam preenchidos até um volume de 25 mL (capacidade máxima do tubo S100).
    15. Centrifugar a 100.000 × g durante 4 h a 4 °C (figura 3F).
    16. Trinta minutos antes do final da execução do S100, prepare um estoque de 0,5 M DTT usando o tampão de ribossomo B gelado de acordo com as instruções acima e gere uma solução final de 1 mM de DTT em 50 mL de tampão de ribossomo B.
    17. Remover o sobrenadante dos tubos de ultracentrífuga por decantação. Adicione 5 mL de tampão ribossomo B + DTT gelado em cada tubo S100 contendo pellet ribossômico. Armazene o tampão ribossomo B + DTT restante a 4 ° C para uso no dia seguinte.
    18. Incube os tubos no gelo em uma câmara fria para deixar o pellet de ribossomo de molho em Ribossomo Buffer B + DTT durante a noite.
      NOTA: Certifique-se de que o pellet de ribossomo esteja completamente submerso no tampão ribossomo B + DTT. Isso pode ser conseguido colocando tubos no gelo em um ângulo (Figura 3D).
  4. Dia 4: ultracentrifugação e imersão em tampão C
    1. No dia seguinte, adicione mais 5 mL de Ribosome Buffer B + DTT gelado em cada tubo S100 contendo o pellet de ribossomo embebido durante a noite.
    2. Tente suavemente ressuspender o pellet pipetando. Use a ponta da pipeta para raspar o pellet da parede do tubo e ressuspender dessa maneira. Transfira o conteúdo para dois tubos S30 pré-resfriados limpos.
    3. Adicione mais 10 mL de Ribossomo Buffer B + DTT gelado em cada tubo S100 contendo o pellet de ribossomo e repita as etapas de ressuspensão como acima.
    4. Agrupe a ressuspensão no mesmo tubo S30 de antes.
    5. Centrifugar a 30.000 × g durante 1 h a 4 °C (figura 3G).
    6. Recupere um máximo de 75% do sobrenadante livre de pellets em dois tubos cônicos limpos de 50 mL e complete o volume para 25 mL com Ribosome Buffer B + DTT.
    7. Transfira esta amostra para dois tubos S100 pré-resfriados limpos.
      NOTA: Certifique-se de que os tubos estejam balanceados com precisão antes da ultracentrifugação e sejam preenchidos até um volume de 25 mL (capacidade máxima do tubo S100).
    8. Centrifugar a 100.000 × g durante 4 h a 4 °C (figura 3H).
    9. Trinta minutos antes do final da execução do S100, prepare um estoque de 0,5 M DTT usando o tampão de ribossomo C gelado de acordo com as instruções acima e gere uma solução final de 1 mM de DTT em 5 mL de tampão de ribossomo C. Mantenha este tampão no gelo.
    10. Após a ultracentrifugação, rejeitar o sobrenadante e remover qualquer tampão residual por pipetagem. Trabalhe rapidamente para evitar deixar o pellet descoberto pelo tampão por muito tempo.
    11. Adicione 400 μL de tampão ribossomo C + DTT gelado em cada tubo de ultracentrífuga contendo pellet ribossômico.
    12. Incube os tubos no gelo em uma câmara fria para deixar o pellet de ribossomo de molho no Ribossomo Buffer C + DTT durante a noite.
      NOTA: Certifique-se de que o pellet de ribossomo esteja completamente submerso no tampão ribossomo C + DTT. Isso pode ser conseguido colocando tubos no gelo em ângulo.
  5. Dia 5: coleta
    1. No dia seguinte, ressuspenda suavemente o pellet de ribossomo usando uma pipeta de 1 mL e girando suavemente para dissolver completamente o pellet de ribossomo de halo transparente.
      NOTA: O pellet de ribossomo deve se dissolver completamente no tampão neste estágio: não deve haver pellet insolúvel neste ponto, mas se um pellet insolúvel amarelo permanecer, não tente ressuspendê-lo: apenas ressuspenda o pellet de ribossomo de halo transparente.
    2. Transfira a solução de ribossomo para dois tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL e centrifugue a 20.000 × g por 10 min a 4 ° C para pellet qualquer material insolúvel restante.
    3. Colete o sobrenadante isento de pellets em um tubo limpo e armazene no gelo (Figura 3I).
    4. Crie uma diluição de 100x da solução de ribossomo adicionando 2 μL a 198 μL de tampão ribossomo C, em triplicado.
    5. Medir a concentração de RNA a 260 nm; 10 unidades de absorbância da amostra diluída equivalem a 24 μM de ribossomos13.
    6. Soluções de ribossomas alíquotas (por exemplo, em alíquotas de 50 μL, dependendo das necessidades do utilizador), congelar em azoto líquido a uma concentração máxima de 24 μM e conservar a -80 °C até à utilização.
      NOTA: O protocolo deve levar a aproximadamente 1 mL de ribossomos na concentração de 12-18 μM. Se os ribossomas estiverem demasiado diluídos, a concentração pode ser obtida utilizando um filtro MWCO de 3 kDa8.

4. Configurando experimentos CFPS

  1. Trabalho preliminar
    1. Preparar o molde de DNA (linear ou plasmídeo) de acordo com os protocolos estabelecidos9.
      NOTA: Em nosso laboratório, usamos modelos de DNA baseados no sistema de expressão T7p14 otimizado para expressão livre de células14. Os produtos de PCR purificados podem ser usados como modelos lineares. É importante notar que os plasmídeos devem ser limpos após a minipreparação e que diferentes kits comerciais produzem resultados variados15.
    2. Prepare a solução energética 5x conforme descrito na Tabela 3.
    3. Prepare a solução de matriz 6x conforme descrito na Tabela 4.
  2. Configurando e monitorando uma reação PURE
    NOTA: Este protocolo descreve a configuração de uma medição triplicada usando uma mistura principal. O número de reações pode ser ampliado ou reduzido conforme necessário, usando a planilha fornecida na Tabela Suplementar S3, mas recomendamos um mínimo de repetições triplicadas para uma única condição experimental.
    1. O descongelamento exigia alíquotas de PURE, ribossomos, solução energética e solução de matriz no gelo.
    2. Preparar uma mistura principal para um único conjunto de reações triplicadas em um tubo de PCR, totalizando 17 μL, conforme mostrado na Tabela 5, montando os componentes na seguinte ordem: solução energética, proteínas PURAS, ribossomos, solução de matriz, água livre de nuclease a 17 μL.
    3. Defina a pipeta para 5,1 μL e aspire suavemente a solução 5-6 vezes para misturar, garantindo homogeneidade.
    4. Usando a mesma configuração de pipeta (5,1 μL), carregue a mistura principal em três poços individuais de uma placa óptica de 384 poços. Evite empurrar a pipeta além da primeira parada para evitar a formação de bolhas. Deixe um espaço de poço entre cada réplica para minimizar a diafonia de fluorescência.
    5. Sele a placa usando uma vedação adesiva da placa.
    6. Prossiga com as medições de incubação a jusante ou leitor de placas, conforme necessário.
      NOTA: Ao incorporar componentes adicionais contendo glicerol (por exemplo, proteínas potenciadoras), certifique-se de que o volume final de tais componentes não exceda 10% do volume da reação. Por exemplo, um componente com 30% de glicerol deve ser limitado a 1,7 μL por master mix de 17 μL.
      Não centrifugue a placa de 384 poços após o carregamento. A centrifugação pode causar a separação de componentes ricos em glicerol (por exemplo, o sistema PURE), resultando em níveis de expressão inconsistentes. O design da placa suporta reações de pequeno volume e a pipetagem cuidadosa garante uma sedimentação adequada sem centrifugação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O fluxo de trabalho para as preparações de PURE e ribossomo é mostrado na Figura 1, e um cronograma recomendado para o trabalho é mostrado na Tabela 1. Normalmente, as reações são monitoradas por meio da produção de proteínas fluorescentes, como GFP ou mCherry, e as leituras de RFU podem ser convertidas em concentrações por calibração11. No entanto, os rendimentos da CFPS dependem da p...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Apresentamos um procedimento detalhado que nos permitiu obter sistemas PURE reproduzíveis em vários lotes e usuários no mesmo laboratório. Há uma série de etapas críticas necessárias para conseguir isso.

O primeiro passo importante é garantir a integridade das 36 cepas PURE: além de sequenciar todos os plasmídeos, é essencial realizar um teste de expressão para verificar se todas as cepas estão superexpressando corretamente, pois a perda de uma única cepa pode...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

SL é cofundador e CTO da Biophoundry Inc., que desenvolve tecnologia livre de células para engenharia de fagos.

Agradecimentos

NL, SL, AB e NZ são apoiados pela UKRI Future Leaders Fellowship (MR / V027107 / 1) da NL. O SL também é apoiado pela Biophoundry Inc. O SY é apoiado por uma bolsa de doutorado do Darwin Trust da Universidade de Edimburgo. CW é apoiado por uma bolsa de doutorado BBSRC Eastbio. Os autores agradecem a A. Pompa pela assistência no uso da ultracentrífuga, que foi apoiada pelo financiamento da Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Além disso, agradecemos a B. Lavickova e S. J. Maerkl pela assistência na configuração do protocolo OnePot original. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. A Figura 1 foi parcialmente criada no BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2x YTSigmaY2377-250G
AminoácidosSigmaLAA21-1KT
RNAse sem acetato de amônioTermo CientíficaAM9070G
cloreto de amônioSigma09718-1KG
ampicilinaSigmaA8351-5G
BL21(DE3) competente para E. coliNEBC2527H
garrafa, centrífuga (Nalgene)Termo Científica3120-9500Garrafa de copolímero de polipropileno
garrafa, vidro (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Ensaio Bradford, Início Rápido 1x Reagente de CoranteBio-Rad5000205
centrifugaTermo CientíficaHeraeus Megafuge 16R
centrífuga, microEppendorf5424R 
Coluna de cromatografiaBio-Rad7321010
Fosfato de creatinaSigma27920
Cuvettes, semi micro 1,6 mLFisherbrandFB55147
Di-sódio hidrogênio ortofosfosfato di-sódicoFisher ChemicalS/4450/60
fita de diálise, Slide-A-Lyzer G3, MWCO de 2 kDa, 15 mLTermo CientíficaA52962
Hidrogênio dipotássio ortofosfato anidroFisher ChemicalP/5240/60
DTT Sem PesoTermo CientíficaA39255
unidade de filtro, centrífuga MWCO Amicon Ultra 15 de 3kDaEMD MilliporeUFC900324
garrafa, 500 mLVWR214-1133
frasco, defletor 2,5 L TunairSS-5013
Ácido folínicoSigmaF7878-100MG
GlicerolSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
HEPES buffer, solução de 1 M pH 7,3Termo CientíficaBP299
ImidazolSigmaI2399-500G
incubadoraEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGTermo CientíficaR0392
Pelotas KOHTermo CientíficaP1767-500G
Ácido L-glutâmico hemimagnésio sal tetrahidratadoSigma49605-250G
Ácido L-glutâmico sal monopotássio monohidratadoSigma49601-500G
Tetrahidrato de acetato de magnésioSigmaM5661-50G
Cloreto de magnésioFluka63020-1L
Configuração de agitação magnéticaStuartUS152
NanodropTermo CientíficaNanodrop 2000
Contas de Carregador NEBExpress Ni-NTANEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipeta, multicanal Eppendorf Research Plus 30-300 e micro; LEppendorf3125000052
Vedação adesiva de placa para leitor de placasExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Estéril)
Vedação respirável de placaStarlabE2796-3005
Vedação de folha de placaExcelScientificFCS-25
Leitor de placasBioTekSinergia H1
Agitador de placasAllshengMBI100-4A
Placa, poço 384Termo Científica242764
chapa, poço profundo 96 1 mLTermo Científica736-0601
chapa, poço de profundidade 96 2 mLSarstedt82.1972.002
PCR de placa, 96 poçosSarstedt721,978
Placa, poço óptico 96Termo Científica10057581
cloreto de potássioSigmaP5405-500G
Dihidrogênio potássico ortofosfatoFisher ChemicalP/4800/53
reagente de extração de proteína (BugBuster)EMD Millipore70584-3
Resina de purificação de proteínas (cOmplete)Roche5893682001
Shaker de rotisserieStarlabRM-Multi 1
cloreto de sódioFisher ChemicalS/3105/70
sonda de sonicação, FisherBrand 15-50 mLTermo Científica12931181
SonicatorFisher ScientificFB120
espectrofotômetroJenwayGenova Plus
EspermidinaSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris com bufferTermo CientíficaR1481
tRNA de E. coli MRE600Roche10109541001
TriptonaFormediumTRP02
tubo, grau PCR de 0,2 mLSarstedt72,737,002
tubo, bijoux Sterilin 7 mL poliestirenoTermo Científica129A
tubo, cônico (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tubo, cônico (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
tubo, centrifugação S100 & nbsp;Beckman-Coulter355619
tubo, centrifugação S30 & nbsp;Termo Científica3118-0050
UltracentrífugaBeckman-CoulterOptima XPN-100
Rotor de ultracentrífugaBeckman-CoulterRotor de ângulo fixo 70Ti
Água Destilada UltraPure Livre de DNase/RNaseTermo Científica10977049
vórticeVWR444-2791
extrato de leveduraOxoideLP0021T

Referências

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Sistema PUREPreparação de RibossomosBiologia SintéticaUltracentrifugaçãoFluorescência de GFPNormalização de Densidade ÓpticaConcentração de GlicerolExpressão Proteica
Refinamento da produção de ribossomos OnePot PURE e brutos para síntese de proteínas livres de células reprodutíveis
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.