Artigo de investigação

Expressão, Significado Clínico e Papel na Avaliação da Eficácia da Imunoterapia da Molécula Co-estimulatória LLT1 no Câncer Gástrico

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DOI:

10.3791/68827

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10 de outubro de 2025

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1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

Neste artigo

Resumo

Esta pesquisa investiga o LLT1 como um biomarcador de imunoterapia preditiva no câncer gástrico por meio de análises clínicas e multiômicas. O estudo avalia o papel do LLT1 na evasão imunológica e na modulação do microambiente tumoral para facilitar abordagens de imunoterapia de precisão para melhorar os resultados do tratamento.

Resumo

LLT1 é uma nova molécula de checkpoint imunológico e potencial alvo terapêutico. A imunoterapia melhorou os resultados no câncer gástrico avançado; no entanto, muitos pacientes não respondem ou desenvolvem resistência, e faltam biomarcadores preditivos. O papel do LLT1 na evasão imune do câncer gástrico e seu efeito na resposta à imunoterapia permanecem obscuros. Para avaliar isso, a expressão de LLT1 foi analisada no conjunto de dados de adenocarcinoma gástrico do Cancer Genome Atlas (TCGA) usando vários algoritmos (TIMER, CIBERSORT e ESTIMATE) para quantificar a infiltração de células imunes. A expressão proteica foi validada por imuno-histoquímica (IHQ) em 268 amostras de adenocarcinoma gástrico e por imunofluorescência multiplex (MIF) em 115 tecidos pós-imunoterapia. Os dados transcriptômicos e proteômicos integrados foram analisados quanto a associações com características do microambiente tumoral e resultados clínicos da imunoterapia. Os resultados mostraram que a alta expressão da proteína LLT1 foi significativamente associada a características tumorais menos avançadas (menor profundidade de invasão e metástase nodal; P < 0,05) e maior sobrevida global (P = 0,012). Os níveis de mRNA e proteína de LLT1 correlacionaram-se com maior infiltração de células T CD8+ e macrófagos M1 e expressão elevada de PD-L1 no microambiente tumoral. Entre a primeira coorte de 198 pacientes com dados prognósticos disponíveis, os pacientes com alta expressão de LLT1 (n = 117) demonstraram sobrevida global significativamente mais longa em comparação com aqueles com baixa expressão (n = 81). Na segunda coorte de pacientes tratados com imunoterapia e quimioterapia combinadas, os tumores com alta expressão de LLT1 (n = 48) tiveram maior sobrevida livre de progressão (P = 0,014) do que aqueles com baixa expressão de LLT1 (n = 67). Um aumento significativo (P < 0,05) nas populações de células imunes PD-1 + CD161 + foi observado em pacientes eficazes em imunoterapia (n = 62) em relação aos pacientes resistentes ao tratamento (n = 53). Conclusivamente, a expressão de LLT1 é um biomarcador promissor de um prognóstico favorável no câncer gástrico. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a demonstrar que a expressão de LLT1 prevê melhor resposta à quimioterapia e imunoterapia combinadas no câncer gástrico, apoiando seu potencial na orientação de estratégias imunoterapêuticas.

Introdução

O câncer gastroesofágico, particularmente o câncer gástrico (GC), tem a distinção de ser a5ª forma mais comum de câncer em todo o mundo e a5ª mais mortal. As estatísticas globais revelam que cerca de 1 milhão de novos casos são identificados a cada ano, com o Leste Asiático assumindo uma parcela desproporcional da doença, contribuindo para mais da metade da incidência global1. Para aqueles diagnosticados com GC em estágio inicial, a perspectiva de sobrevida é significativamente favorável, com mais de 90% alcançando taxas de sobrevida em 5 anos após dissecção endoscópica da submucosa (ESD) ou intervenção cirúrgica radical2. No entanto, a apresentação sutil dos sintomas iniciais muitas vezes leva ao diagnóstico de uma fase localmente avançada ou metastática 3,4. As perspectivas para os pacientes nesses estágios avançados são terríveis, com aqueles que não são tratados experimentando uma sobrevida global (OS) média de apenas 6 meses. Mesmo com a administração de esquemas de quimioterapia combinados baseados em fluoruracila e platina, a SG mediana é apenas estendida para aproximadamente um ano5.

Recentemente, houve uma mudança significativa no tratamento do câncer de estômago em estágio avançado, devido a esses novos medicamentos chamados inibidores de checkpoint imunológico. Eles são semelhantes a uma bala mágica para células cancerígenas que têm um certo marcador, PD-L1, aparecendo nelas - pelo menos uma pontuação de 1 na escala de Pontuação Positiva Combinada (CPS). Esses tratamentos também são altamente eficazes para cânceres que estão todos misturados em seu DNA, o que é chamado de alta instabilidade de microssatélites (MSI-H). Essa nova abordagem faz a diferença para proporcionar mais tempo aos pacientes 6,7. Ensaios clínicos principais indicam que, dentro da coorte positiva para PD-L1, indivíduos com CPS de 10 ou mais ganham um aumento mais pronunciado na sobrevida após o tratamento com anticorpos monoclonais PD-1 8,9. No entanto, a imunoterapia atual ainda enfrenta múltiplos desafios clínicos: taxas de resposta objetiva (ORR) geralmente abaixo de 20%, taxas de resistência secundária de até 40% a 60%, sistemas de previsão de biomarcadores imperfeitos (os biomarcadores existentes podem identificar apenas 30% a 40% dos potenciais beneficiários) e dificuldades no gerenciamento de eventos adversos relacionados ao sistema imunológico (irAEs)10,11,12,13,14. Embora o bloqueio de checkpoint imunológico duplo (por exemplo, inibição combinada de PD-1/CTLA-4) ou esquemas de quimioimunoterapia possam aumentar as taxas de resposta para 40% a 60%, aproximadamente metade dos pacientes ainda não consegue obter benefícios clínicos sustentados15. Portanto, o estabelecimento de sistemas de classificação de precisão baseados em recursos multiômicos, a descoberta de novos biomarcadores preditivos e a identificação de novos pontos de verificação imunológica tornaram-se direções críticas de pesquisa para melhorar os resultados clínicos da imunoterapia com GC.

Lectin-like Transcript 1 (LLT1) é uma proteína relacionada à lectina do tipo C, com CD161, um constituinte da família de receptores de células natural killer (NK), que serve como seu parceiro de ligação identificado. O gene CLEC2D, responsável por sua síntese, dá origem a cinco isoformas distintas por meio de eventos de splicing alternativos que ignoram certos éxons. A variante 1, conhecida como LLT1, foi validada como a única variante presente na membrana celular16,17. A expressão de LLT1 é predominantemente observada em vários tipos de células imunes, como linfócitos B, células NK, células dendríticas (DCs), populações específicas de células T (incluindo células T ativadas e reguladoras), monócitos e macrófagos, e também é observada em certas células malignas e durante episódios inflamatórios18. Os resultados iniciais indicam que o LLT1 é regulado positivamente em DCs e células B após a estimulação do receptor Toll-like (TLR). O envolvimento de LLT1 com CD161 demonstrou suprimir a citotoxicidade mediada por células NK, sugerindo seu envolvimento na modulação da resposta imune18. Nas células B, a expressão de LLT1 é regulada positivamente por infecção viral ou estimulação inflamatória. Ao funcionar como células apresentadoras de antígenos (APCs), a interação LLT1-CD161 exerce efeitos imunomoduladores duplos, suprimindo a função das células NK enquanto co-estimula a proliferação de células T ou a produção de IFN-γ19.

Sabe-se que o LLT1 está presente em uma variedade de células cancerígenas, incluindo câncer de mama triplo-negativo, glioblastoma e linfoma não-Hodgkin de células B. Essa proteína se envolve com o receptor CD161 encontrado nas células NK, bloqueando efetivamente sua capacidade de destruir as células cancerígenas, auxiliando na evasão da resposta imune 20,21,22. Uma observação notável no carcinoma espinocelular orofaríngeo HPV negativo é a expressão variável de LLT1, que, de acordo com estudos imuno-histoquímicos, indica um significado prognóstico positivo quando altamente expresso em estruturas linfóides terciárias (TLS), enquanto sua presença em células tumorais está ligada a um pior resultado23. Além disso, no contexto do câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), o LLT1 não é detectado nas próprias células cancerígenas, mas é encontrado no microambiente tumoral (TME), e seu nível de expressão de mRNA está associado a um melhor prognóstico24.

Conforme demonstrado por Mathewson et al. na pesquisa de glioma, o bloqueio do CD161 aumenta a morte mediada por células T de células de glioma in vitro e melhora sua função antitumoral in vivo, destacando o potencial terapêutico do CD161 como um alvo de checkpoint imunológico25. Dado que LLT1 é o ligante canônico de CD16118, seu papel como alvo imunoterapêutico merece séria consideração. Análogo à interação crítica entre PD-1 e PD-L1 na imunoterapia, investigar as funções biológicas do LLT1 no câncer gástrico e sua correlação com os resultados da imunoterapia tem valor clínico significativo.

Este estudo fornece uma análise abrangente dos padrões de expressão de LLT1 no microambiente tumoral do câncer gástrico, integrando investigações de mRNA e nível de proteína. Ele avalia sistematicamente o potencial do LLT1 como um biomarcador prognóstico no câncer gástrico avançado e avalia seu valor preditivo para a eficácia da imunoterapia. Esses insights contribuem para uma compreensão mais profunda de seu potencial translacional clínico.

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Protocolo

A pesquisa envolvendo seres humanos foi revisada e aprovada pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Soochow (Parecer nº 2019026). O conselho de revisão ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Soochow aprovou ou concedeu uma isenção para a revisão ética desse uso de dados. Além disso, o consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

Análise de dados de bioinformática
Após um exame completo de análise de expressão pan-cancerígena dos bancos de dados TCGA e Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER), o comportamento de LLT1 foi investigado em vários tipos de câncer, com foco particular no câncer gástrico. O banco de dados TISIDB foi utilizado para investigar a correlação entre os níveis de expressão de LLT1 e diferentes subtipos moleculares de câncer gástrico. A correlação entre as características clínicas dos pacientes e a expressão de LLT1 foi posteriormente analisada com dados de TCGA por meio de programação R. As análises GO e KEGG foram empregadas para investigar o papel funcional da LLT1 na carcinogênese gástrica. O algoritmo ESTIMATE (Estimativa de células estromais e imunes em tecidos tumorais de lignantes usando dados de expressão) foi adicionalmente empregado para quantificar os níveis de infiltração de células imunes e estromais em tecidos tumorais de acordo com os padrões de expressão de LLT1. Uma análise mais aprofundada utilizando o algoritmo CIBERSORT foi conduzida para avaliar as correlações entre os níveis de expressão de LLT1 e padrões específicos de infiltração de células imunes dentro do microambiente tumoral. A análise bioinformática abrangente foi realizada usando conjuntos de dados TCGA e programação estatística R (v4.4.1) para interrogar possíveis correlações entre os perfis de expressão de LLT1 e biomarcadores imunorreguladores. Finalmente, o banco de dados TCIA (The Cancer Immunome Atlas) foi utilizado para investigar se a expressão de LLT1 poderia prever a resposta à terapia de bloqueio de checkpoint imunológico PD-1 / PD-L1.

Amostras GAC e construção de microarray de tecido (TMA)
Dois conjuntos de dados de microarray de tecido foram gerados da seguinte forma:

O primeiro conjunto analisou retrospectivamente amostras de 268 pacientes com GAC que foram submetidos à cirurgia em 2011. Os patologistas selecionaram blocos de parafina, identificaram regiões do núcleo do tumor e os construíram em microarrays de tecido. Cada local de amostra individual recebeu um identificador distinto para monitorar meticulosamente os parâmetros clínicos associados, como sexo, idade, dimensões da neoplasia, grau de diferenciação neoplásica, fase de progressão do câncer, profundidade de invasão, envolvimento linfático e presença de disseminação à distância. A duração da sobrevida global (OS) foi definida como o intervalo desde o início da terapia até a ocorrência de mortalidade ou a data limite de dezembro de 2017. Deve-se destacar que os dados abrangentes do OS estavam disponíveis apenas para um subconjunto de 198 participantes.

O segundo conjunto incluiu 115 pacientes virgens de tratamento com GC avançado, que foram submetidos à ressecção cirúrgica/endoscópica no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Soochow entre 2016 e 2023. Os patologistas avaliaram os blocos de parafina e construíram microarranjos de tecido com acompanhamento rigoroso da progressão da doença. Notavelmente, todas as amostras foram coletadas antes de qualquer tratamento pré-operatório, e o tratamento pós-operatório consistiu principalmente em anticorpos monoclonais PD-1 combinados com quimioterapia.

Todos os espécimes de ressecção cirúrgica foram coletados do antro do estômago. Todas as amostras foram fixadas em formalina tamponada neutra e incluídas em parafina. Com base na avaliação das seções coradas com H & E, dois patologistas seniores identificaram independentemente as regiões de tecido mais representativas das amostras embebidas em parafina. Os microarrays de tecido (TMAs) foram construídos usando um array de tecido automatizado Finalmente, os blocos de TMA completos foram seccionados com 4 μm de espessura por um histotecnólogo experiente.

Imuno-histoquímica (IHQ) e imunofluorescência multiplex (mIHQ)
Ensaios de imuno-histoquímica e imunofluorescência multiplex foram conduzidos em um microarranjo de tecido construído. A coloração IHQ foi realizada de acordo com uma metodologia previamente estabelecida26. O primeiro conjunto de seções de parafina de microarranjo foi transferido para lâminas de vidro e cozido a 72 ° C por 1 h. Após os cortes serem desparafinizados com xileno e reidratados em diluições sucessivamente crescentes de etanol, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada pela aplicação de solução bloqueadora da peroxidase por 30 min. A recuperação do antígeno foi realizada fervendo as lâminas a 110 ° C em solução de recuperação de antígeno citrato (pH 6,0) por 3 min. Após o bloqueio com tampão de bloqueio BSA a 5%, as seções foram incubadas com camundongo anti-humano CLEC2D monoclonal, camundongo anti-humano CD3 monoclonal (pronto para uso), camundongo anti-humano CD4 monoclonal (pronto para uso), coelho anti-humano CD8 monoclonal (pronto para uso), camundongo anti-humano CD11c monoclonal (1:50) camundongo anti-humano CD19 monoclonal (pronto para uso), camundongo anti-humano CD31 monoclonal (pronto para uso), CD56 monoclonal anti-humano de ratinho (pronto para uso), monoclonal de camundongo anti-humano CD68 (pronto para uso), monoclonal de coelho anti-humano Foxp3 (1:50), monoclonal de IL-17 anti-humano de camundongo (1:50), monoclonal de camundongo anti-humano IFN-γ (1:50), camundongo anti-humano Ki67 monoclonal (1:50), camundongo anti-humano PD-L1 monoclonal (pronto para uso) a 4 °C durante a noite27,28. As lâminas foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano (anti-camundongo e coelho) em temperatura ambiente por 30 min. Após a incubação, as amostras foram lavadas e o sistema de detecção EnVision foi usado para imunodetecção. Sob o microscópio, quando áreas marrons começam a aparecer no chip, é necessária uma observação cuidadosa. A reação cromogênica deve ser interrompida assim que as áreas marrons não aumentarem mais. As lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Mayer e montadas com cola neutra. No controle negativo, IgG de camundongo ou coelho foi usada no lugar do anticorpo primário. O controle positivo foi o tecido da amígdala humana. O segundo conjunto de seções de microarray é usado para imuno-histoquímica multiplex (mIHC). Reutilizando as condições de recuperação e bloqueio de antígenos acima mencionadas, o painel de anticorpos é otimizado espectralmente da seguinte forma: PD-L1 (480 nm), CD161 (520 nm), LLT1 (570 nm), PD-1 (620 nm), CD8 (690 nm) e PAN-CK (780 nm). Os anticorpos primários foram incubados nas mesmas condições do protocolo original29 (exceto PANCK e CD161, que foram introduzidos recentemente), na diluição recomendada de 1:100, seguidos de coloração de fluorescência de amplificação de sinal de tiramida (TSA). Após cada rodada de coloração por fluorescência, é realizada a remoção de anticorpos, seguida por recuperação repetida de antígenos, bloqueio da peroxidase endógena e bloqueio de alvos não específicos antes de incubar o próximo anticorpo primário. Ao realizar a imuno-histoquímica multiplex, três pontos são cruciais: pré-experimentos devem ser conduzidos para cada corante fluorescente, anticorpos fortemente expressos devem ser emparelhados com sinais fluorescentes fracos, enquanto anticorpos fracamente expressos devem ser emparelhados com sinais fluorescentes fortes e, após a coloração de cada marcador fluorescente, os resultados da coloração devem ser observados ao microscópio sob condições protegidas contra luz. Após a coloração com o6º corante fluorescente, a contracoloração DAPI é aplicada aos núcleos das células marcadas e as lâminas são montadas. Finalmente, todos os microarrays de tecido foram escaneados usando um scanner de patologia digital e analisados com um software de análise de imagem de patologia digital alimentado por IA.

Avaliação da coloração IHC/mIHC
Os resultados da coloração foram interpretados por dois patologistas especialistas de forma duplo-cega. Eles mediram a profundidade da coloração usando uma objetiva de alta potência (ampliação de 200x) ou configuração fluorescente correspondente (200x), atribuindo pontuações que variam de 0 (sem coloração) a 3 (coloração intensa). As frações de células LLT1-positivas dentro das amostras de carcinoma gástrico foram divididas em quatro estratificações: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) e 3 (>50%). O Escore de Imunorreatividade (IRS) foi derivado do produto da profundidade de coloração e proporção de células LLT1-positivas. Os espécimes com pontuação zero foram considerados negativos, enquanto os escores de 1-4 indicaram expressão fraca, 5-7 moderada e 8-9 expressão forte; os mesmos critérios foram aplicados para avaliar a expressão de outros marcadores, como Ki67 e CD3. Com base na metodologia de avaliação e agrupamento, as amostras foram rotuladas como tendo forte (IRS8-9), moderada (IRS5-7), fraca (IRS1-4) ou nenhuma expressão (IRS0). Os pacientes com os escores mais baixos (IRS≤4) foram designados para o grupo de baixa expressão, e aqueles com escores mais altos (IRS≥5) foram designados para o grupo de alta expressão.

No entanto, para o marcador PD-L1, uma abordagem diferente foi adotada usando o CPS. Essa pontuação foi determinada pela proporção de células positivas para PD-L1 (incluindo células tumorais, imunes e estromais) para o número total de células tumorais viáveis aumentadas por um fator de 100. Indivíduos com CPS superior a cinco foram colocados na coorte de alta expressão, enquanto aqueles com CPS de cinco ou menos foram agrupados na coorte de baixa expressão.

Agrupamento de resposta à imunoterapia
De acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos versão 1.1 (RECIST 1.1), a avaliação de lesões-alvo em pacientes se enquadra em quatro categorias distintas: (a) Resposta Completa (CR): todas as lesões-alvo desapareceram completamente, e o eixo curto de todos os linfonodos patológicos (alvo e não-alvo) deve medir menos de 10 mm; (b) Resposta Parcial (PR): o diâmetro cumulativo de todas as lesões-alvo mensuráveis foi reduzido em pelo menos 30% em relação às medições iniciais; (c) Doença Progressiva (DP): esta categoria é aplicável quando o diâmetro acumulado das lesões-alvo aumentou pelo menos 20% em relação ao menor valor registrado durante o estudo (usando a linha de base como referência se representar o menor valor), com o aumento absoluto não inferior a 5 mm; além disso, o surgimento de novas lesões também é categorizado como Doença Progressiva (DP); (d) Doença Estável (DS): o diâmetro cumulativo das lesões-alvo não atinge os critérios de redução para RP nem os critérios de aumento para DP ao longo do estudo. Duas técnicas de estratificação foram implementadas. O primeiro método envolveu a segregação de pacientes com base em seu status de resposta, onde os pacientes com DP (n = 53) e SD (n = 46) compuseram o grupo não respondedor (n = 99), enquanto os pacientes PR (n = 15) e CR (n = 1) formaram o grupo respondedor (n = 16). A segunda abordagem envolveu a categorização dos pacientes de acordo com a progressão da doença, com pacientes CR, PR e SD classificados como coorte eficaz em imunoterapia (n = 62) e pacientes com DP como coorte não eficaz em imunoterapia (n = 53).

Análise estatística
As avaliações empíricas foram realizadas usando a plataforma computacional R (versão 4.4.1) e o pacote de software SPSS Statistical (versão 27.0). As disparidades entre as coortes de estudo foram investigadas pela aplicação da análise da tabela de contingência qui-quadrado. A técnica de correlação não paramétrica de Spearman foi empregada para sondar a força e a direção das associações entre as variáveis. As variações no tempo de sobrevida foram analisadas por meio da construção de estimadores de Kaplan-Meier complementados por testes de log-rank para significância. Posteriormente, modelos de regressão de riscos proporcionais de Cox foram empregados para identificar fatores que potencialmente influenciam os resultados de sobrevida do paciente. A significância estatística foi predefinida como um limiar bilateral de valor de p de <0,05. Para garantir a robustez dos achados, análises abrangentes de sensibilidade foram realizadas para avaliar possíveis variáveis de confusão, com modelos multivariados ajustados de acordo. Além disso, interpretações explícitas das taxas de risco foram fornecidas para facilitar a compreensão clínica, enfatizando as implicações práticas dos fatores de risco identificados no prognóstico do paciente.

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Resultados

Associação entre a expressão de mRNA CLEC2D e a subclassificação/parâmetros clínicos do câncer gástrico
Um exame inicial abrangente do câncer utilizando o conjunto de dados TCGA, facilitado pelo banco de dados TIMER, revelou uma elevação notável nos níveis de transcrição CLEC2D em vários tecidos cancerígenos, conforme ilustrado na Figura 1A. Essa observação implica que o CLEC2D pode servir como um fator oncogên...

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Discussão

Nosso estudo mostrou maior expressão de mRNA CLEC2D em tecidos tumorais do que em tecidos normais. Os resultados imuno-histoquímicos do câncer gástrico revelaram que a alta expressão da proteína LLT1 nos tecidos tumorais foi associada a melhor prognóstico e positivamente correlacionada com a infiltração de células imunes no microambiente tumoral. A análise de tecidos de pacientes com câncer gástrico recebendo imunoterapia indicou que a alta expressão de LLT1 prediz melhor respos...

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Divulgações

Nenhum potencial conflito de interesse é relatado pelos autores.

Agradecimentos

O agradecimento é estendido ao banco de dados TCGA por fornecer suporte de dados. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 81974375) e Grants of Suzhou Science and Technology Development Plan (SKY2022129). O estudo segue as diretrizes do ARRIVE.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5% de Buffer de Bloqueio BSAPequim Solarbio Ciência & Technology Co., Ltd., ChinaSW3015
anti-CD11c ZSGB-BIO, China5D11
Anti-CD161Abcam, Cambridge, Reino UnidoAB302564
anti-CD19  ZSGB-BIO, ChinaEPl69
anti-CD3 ZSGB-BIO, ChinaLNl0
anti-CD31ZSGB-BIO, China  UMAB30
anti-CD4ZSGB-BIO, ChinaUMAB64
anti-CD56ZSGB-BIO, ChinaUMAB83
anti-CD68 ZSGB-BIO, ChinaKP1
anti-CD8ZSGB-BIO, ChinaEP334
Anti-CLEC2DAbcam, Cambridge, Reino UnidoAB197341
anti-Foxp3R& D Systems, EUA1054C
anti-IFN-&gama;  Santa Cruz BiotecnologiaSC-74108
anti-IL-17R& D Systems, EUA  MAB317 
anti-Ki67 ZSGB-BIO, China8H5
Anti-pan Citoqueratina Abcam, Cambridge, Reino UnidoAB7753
Anti-PD-1Abcam, Cambridge, Reino UnidoAB137132
Anti-PD-L1DAKO, Dinamarca22C3
Equipamento automatizado de matriz de tecidosEstigen OU, Tartu, EstôniaBeecher ATA 27Este instrumento é usado principalmente para a construção de microarrays de tecido.
Solução de recuperação de antígeno de citratoAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaC752119
Kit de cromogênio DAB AiFang biológico, ChinaAFIHC004
Scanner de patologia digitalNingbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd, ChinaKF-FL-020Este instrumento é usado principalmente para varredura de imuno-histoquímica e chips de imuno-histoquímica multiplex.
GraphPad Prisma 10Software GraphPad, EUAv10.0.3Este software é para traçar curvas de Kaplan-Meier (com análise estatística de log-rank), visualização de dados científicos e preparação de figuras.
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaP743267
Solução de bloqueio de peroxidaseAiFang biológico, ChinaAFIHC012
Anticorpo secundário de cabra conjugado com polímero-HRP anti-camundongo/coelhoAiFang biológico, ChinaAFIHC001
Kit de coloração de imunofluorescência multiplex de seis cores e sete marcadoresAiFang biológico, ChinaAFIHC037Este kit de reagentes foi projetado para imuno-histoquímica multiplex (mIHC)
SPSSIBM Corporation, EUAEstatísticas do IBM SPSS 27O software foi utilizado para análise estatística dos dados.
O Projeto REquipe Principal RV4.4.1Todos os pacotes R, código relacionado e arquivos originais foram carregados no banco de dados público.
Software VISIOPHARMVisiopharm, Dinamarca2025.02.2.18022 x64Este software foi desenvolvido principalmente para a análise quantitativa de imagens patológicas.

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