Artigo de método

Plataforma de imagem sem lentes implantável em campo para análise rápida e sem rótulos da ativação de células assassinas naturais

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DOI:

10.3791/68834

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8 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método sem rótulo para a análise rápida de uma única célula da contagem e atividade de células natural killer (NK) usando a tecnologia de imagem de sombra sem lente. Este método quantifica as mudanças morfológicas em células NK individuais por meio de análise computadorizada de seus padrões de difração.

Resumo

As células natural killer (NK) são importantes efetores da imunidade inata que eliminam células infectadas por vírus e malignas. O monitoramento da atividade das células NK é essencial para avaliar a função imunológica. No entanto, os métodos convencionais, como a citometria de fluxo, são trabalhosos e demorados. Este protocolo descreve uma técnica sem rótulo para a análise rápida da atividade das células natural killer (NK) usando a tecnologia de imagem de sombra sem lente (LSIT). As células NK isoladas do sangue periférico e estimuladas com um ativador proprietário foram analisadas usando a plataforma LSIT em 5 min. A plataforma LSIT captura imagens holográficas, conhecidas como imagens de sombra, criadas pela interferência da luz com as células NK, e monitora seu status de ativação analisando as alterações nos parâmetros de sombra. Os principais parâmetros derivados das imagens de sombra, incluindo a distância pico a pico (PPD) e o desvio padrão da largura máxima secundária (WSM-SD), refletiram quantitativamente a morfologia celular e a complexidade interna. Esses parâmetros foram integrados ao parâmetro de sombra combinado (CSP) e ao índice de imunidade inata (I3) para fornecer uma avaliação abrangente e quantificação da atividade das células NK com base nas mudanças morfológicas nas células. I3, calculado como a variação percentual no CSP após a ativação, serviu como uma medida direta da atividade das células NK. As células NK de indivíduos saudáveis apresentaram consistentemente valores de I3 significativamente mais altos do que as de indivíduos imunocomprometidos. A plataforma LSIT permite um perfil imunológico rápido e econômico, adequado para diagnósticos no local de atendimento.

Introdução

A morfologia celular está emergindo como um indicador-chave dos mecanismos moleculares. Ele não apenas fornece uma representação visual da estrutura celular, mas também oferece informações valiosas sobre os processos e funções subjacentes de células individuais1. A análise da forma, tamanho e atividade das células imunes no nível de uma única célula fornece informações cruciais sobre seu comportamento, heterogeneidade e papéis na saúde e na doença 2,3,4,5,6.

Entre essas células cruciais estão as células natural killer (NK), que são um componente central do sistema imunológico inato 7,8. Eles eliminam células infectadas por vírus e cancerígenas e regulam a resposta imune adaptativa por meio da liberação de citocinas 9,10,11. Câncer, infecções virais e imunodeficiências geralmente reduzem o número de células NK e prejudicam suas funções 12,13,14. Portanto, a ativação das células NK serve como um importante biomarcador e fornece informações sobre a saúde geral do sistema imunológico. Consequentemente, a avaliação rápida da ativação das células NK em uma única célula é essencial para o prognóstico, diagnóstico, monitoramento da doença e estratificação do paciente 15,16,17,18.

Atualmente, a atividade das células NK é avaliada com base em sua capacidade citotóxica (capacidade de matar células-alvo) e produção de citocinas 19,20,21,22. Métodos convencionais para medir a citotoxicidade mediada por células23, como ensaios de liberação de cromo-51 (51Cr)24,25, ensaios de citometria de fluxo26,27 e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) para quantificar o interferon-gama (IFN-γ) secretado por células NK após estimulação 28,29,30 têm várias limitações. Isso inclui a falta de padronização, protocolos demorados (por exemplo, incubação ELISA durante a noite), dependência da marcação de células e altos custos de equipamentos 31,32,33. Esses desafios destacam a necessidade de métodos inovadores que ofereçam resultados rápidos, custo-benefício, análise sem rótulo e alto rendimento. Além disso, a avaliação da ativação de células NK no nível de célula única fornece informações detalhadas sobre a heterogeneidade da população e as respostas celulares individuais à estimulação.

Entre as tecnologias emergentes destinadas a superar essas limitações, a tecnologia de imagem de sombra sem lentes (LSIT) é uma solução particularmente eficaz 34,35,36. LSIT, uma holografia digital em linha (DIH) simplificada, permite uma análise rápida, sem rótulos e de alto rendimento da ativação de células NK com resolução de célula única 37,38,39. O DIH captura padrões de interferência entre a luz laser espalhada e um feixe de referência colinear em um sensor digital para reconstruir informações tridimensionais (3D) sobre objetos microscópicos40,41. O LSIT simplifica essa abordagem usando um LED parcialmente coerente, micropinhole e sensor CMOS para capturar os padrões de difração (ou seja, imagens de sombra) das células 42,43,44,45. A justificativa para esta técnica é baseada na observação de que a ativação de células imunes freqüentemente causa alterações morfológicas, incluindo variações no tamanho da célula, forma, granularidade citoplasmática e estrutura nuclear 46,47,48,49,50. O LSIT é altamente sensível a essas mudanças, que têm efeito direto nos padrões de difração 51,52,53.

Com base na sensibilidade do LSIT a essas mudanças morfológicas e seus efeitos nos padrões de difração, este protocolo apresenta um novo método para a quantificação rápida e precisa da contagem de células NK e da atividade funcional no nível de célula única usando a plataforma Cellytics NK, doravante denominada plataforma LSIT54. Conforme mostrado na Figura 1A, a plataforma LSIT integra processamento de amostras, ativação e imagem de sombra em um fluxo de trabalho multicanal compacto. As células NK foram isoladas do sangue total, estimuladas com um coquetel estimulador de ativação (ASC) especialmente formulado e carregadas em um chip de ensaio dedicado. O ASC induz alterações morfológicas nas células NK dentro de 1 h após a exposição, como aumento do tamanho da célula e da complexidade interna, que podem ser detectadas com precisão usando a plataforma LSIT55,56.

A plataforma LSIT usa uma fonte de luz LED e um sensor CMOS para capturar os padrões DIH (sombras) de células individuais (Figura 1B). Um algoritmo especial analisa esses padrões de sombra e extrai parâmetros-chave, como a distância pico a pico (PPD), que se correlaciona com o tamanho da célula, e o desvio padrão da largura do máximo secundário (WSM-SD), que se correlaciona com a complexidade e irregularidade do citoplasma (Figura 1C, D). Ao comparar os valores antes e depois da estimulação, a plataforma calcula índices compostos: o parâmetro de sombra combinado (CSP = PPD × WSM-SD) e o índice de imunidade inata (I³), que refletem a variação percentual no CSP após a ativação. A razão para a introdução do CSP é que a ativação imune envolve tanto o aumento celular quanto o aumento da complexidade citoplasmática. Confiar em apenas um dos dois critérios pode perder a ativação limítrofe ou ser afetado por ruídos, como detritos ou iluminação irregular. O CSP melhora a classificação exigindo mudanças consistentes em ambas as métricas. Esses índices classificam os estados de ativação de diferentes populações de células sem marcação fluorescente ou processamento complexo de amostras.

Este protocolo é particularmente útil para pesquisadores e médicos que precisam de um método rápido, quantitativo e sem rótulos para monitorar alterações morfológicas induzidas por ativação em células imunes. É adequado para pesquisa imunológica básica, triagem pré-clínica de medicamentos e avaliação de imunoterapias, e pode ser usado como uma ferramenta diagnóstica ou prognóstica em ambientes clínicos onde a avaliação rápida do estado imunológico é essencial. Este método requer populações de células isoladas, acesso à plataforma LSIT e um coquetel de ativação de células NK específico.

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Protocolo

Todas as pesquisas seguiram as diretrizes institucionais e foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Anam da Universidade da Coreia (número de aprovação: 2021AN0040). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta e manuseio de amostras

NOTA: Manuseie todas as amostras de sangue humano usando as precauções padrão de biossegurança e o equipamento de proteção individual apropriado.

  1. Colete sangue total periférico do paciente em um tubo de heparina estéril assepticamente.
  2. Inverta suavemente o tubo 8 a 10 vezes para misturar o anticoagulante com o sangue.
  3. Analise a amostra de sangue imediatamente após a coleta. Se a análise for retardada, armazenar a amostra em um tubo heparinizado a 2-8 °C e usar dentro de 48 h.
    NOTA: Não congele sangue total. Use amostras frescas para preservar a integridade celular.

2. Isolamento e ativação de células NK

NOTA: Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho otimizado e abrangente para o isolamento e ativação de células NK diretamente do sangue total humano usando o NK Prep Kit, que consiste no NK Sep Kit para isolamento celular e no NK Activation Kit para estimulação. Este kit integra seleção negativa e estimulação magnética baseada em esferas para permitir uma avaliação fenotípica rápida por meio de uma plataforma de citometria de imagem sem lente.

  1. Configuração de pré-teste
    1. Retire os kits do frigorífico e leve-os à temperatura ambiente (15-28 °C).
      NOTA: O kit NK Sep inclui os seguintes componentes:
      a) Tampa verde: Tubo de reacção que contém o cocktail de anticorpos.
      b) Tampa vermelha: Tubo de separação 1 contendo partículas magnéticas no meio de diluição (1,5 ml).
      (c) Tampa roxa: Tubo de separação 2 contendo as partículas magnéticas.
      (d) Tampa cinza: Tubo de recuperação (limpo e vazio).
      O kit de ativação NK inclui os seguintes componentes:
      (a) Veículo: Oito tubos transparentes em um saco de alumínio lacrado.
      (b) ASC: Oito tubos amarelos em um saco de alumínio lacrado.
      Remova apenas os tubos necessários dos sacos lacrados. Feche novamente e refrigere todos os componentes não utilizados.
    2. Preparar o equipamento necessário: separador magnético, pipetas com pontas estéreis e uma incubadora calibrada ou bloco de aquecimento regulado para 37 °C.
  2. Procedimento de isolamento de células NK
    1. Adicione 0,5 mL de sangue total ao tubo de reação com a tampa verde contendo o coquetel de anticorpos. Misture delicadamente invertendo o tubo 2-3 vezes e incube por 5 min.
    2. Transfira todo o conteúdo para o tubo de separação 1 com uma tampa vermelha. Misture delicadamente 2-3 vezes.
    3. Coloque o tubo em um separador magnético e incube por 10 min em temperatura ambiente.
    4. Com o ímã no lugar, transfira aproximadamente 1.5 mL do sobrenadante para o tubo separador com tampa roxa 2. Misture delicadamente 2-3 vezes.
    5. Coloque o tubo de separação dois no suporte magnético e incube por 10 min.
    6. Com o ímã ainda conectado, transfira aproximadamente 1,0 mL do sobrenadante para um tubo de recuperação com tampa cinza. Misture com cuidado.
  3. Ativação de células NK
    1. Adicione 100 μL da suspensão isolada da célula NK ao tubo do veículo e outros 100 μL ao tubo ASC
    2. Misture cuidadosamente o conteúdo dos dois tubos.
    3. Incubar os tubos a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: Use um bloco de aquecimento calibrado para manter uma temperatura de incubação constante.

3. Imagiologia e análise com a plataforma LSIT

NOTA: As células devem ser analisadas imediatamente após a incubação. Se a análise imediata não for possível, armazene as células incubadas a 2-8 °C e analise-as dentro de 6 h. A plataforma LSIT avalia a morfologia e a contagem celular em amostras de sangue humano usando DIH. Para analisar a atividade imunológica, as células NK não estimuladas e estimuladas por ASC foram carregadas em uma lâmina especial, inseridas no dispositivo e automaticamente fotografadas.

  1. Configuração e calibração do dispositivo
    NOTA: Sempre execute a calibração de fundo antes de analisar uma amostra.
    1. Ligue a plataforma LSIT. Certifique-se de que o LED, o ventilador e a câmera estejam funcionando.
    2. Inicie o software LSIT Capture . Faça login digitando seu ID e senha.
    3. Vá para Configurações e selecione Calibrar.
    4. Pressione o botão Abrir na tela sensível ao toque ou use o botão físico da porta deslizante para abrir a porta. Quando a gaveta abrir, remova a corrediça de calibração e guarde-a.
    5. Certifique-se de que nenhuma lâmina de teste esteja presente. Feche a gaveta.
      NOTA: Use apenas lenços ópticos para limpar as superfícies dos slides.
    6. Clique em Definir plano de fundo para calibrar a intensidade óptica.
    7. Recoloque a corrediça de calibração e feche a gaveta.
    8. Clique em Iniciar calibração.
      NOTA: Se for derramado líquido no dispositivo, desligue-o imediatamente. Limpe-o. Não desmonte o dispositivo.
  2. Preparação e carregamento da lâmina do ensaio
    1. Remova uma lâmina de ensaio de sua bolsa, etiquete-a com os dados da amostra e coloque-a em uma superfície limpa e plana.
    2. Pipetar 10 μL da amostra do veículo (não estimulada) para os canais A e B.
    3. Pipetar 10 μL da amostra estimulada por ASC nos canais C e D.
      NOTA: Evite a formação de bolhas e o enchimento excessivo.
    4. Pressione Abrir para ejetar a gaveta, remova a corrediça de calibração e coloque-a em uma caixa de armazenamento.
    5. Insira a lâmina de ensaio preparada e pressione Fechar.
  3. Aquisição de imagem: Menu de teste 1 - Atividade da célula NK
    NOTA: Se a aquisição da imagem falhar, verifique a iluminação e o volume da amostra. Recalibre se necessário.
    1. Faça login no sistema LSIT e selecione o Teste de Atividade de Célula NK na tela principal.
    2. Insira o ID da amostra ou use o leitor de código de barras.
      NOTA: Para recuperar a ID de amostra da lista arquivada, use o botão Recuperar.
    3. Pressione Capturar para iniciar a gravação.
    4. Após capturar a imagem, clique em Analisar
    5. Verifique a atividade da célula NK (%) e a contagem de células exibidas na tela.
      NOTA: Os resultados válidos são exibidos numericamente. Se I3 estiver abaixo do intervalo, "≤100%" é exibido. Acima do intervalo, ">300%" é exibido.
    6. Baixe os resultados para um USB ou imprima-os usando o menu da tela sensível ao toque.
  4. Aquisição de imagem: Menu de teste 2 - contagem de células
    1. Selecione a opção Contagem de células no menu Teste 2 na interface principal.
    2. Carregue 10 μL da amostra em um novo canal de lâmina de ensaio.
    3. Insira o slide, feche a gaveta e insira o ID da amostra.
    4. Indicar o factor de diluição, se aplicável.
    5. Pressione Contagem.
      NOTA: Se o resultado estiver dentro do intervalo de teste, o número de células NK é exibido como um valor numérico na tela do sistema. Para resultados abaixo da faixa de teste, "≤ 10 células/μL" é exibido, para resultados acima de "> 1.000 células/μL".
    6. Exiba os resultados como células/μL.
      NOTA: Alterne o campo de resultado preto para visualizar a contagem real de células nas imagens.
    7. Revise os resultados e baixe-os ou imprima-os.
      NOTA: Certifique-se de que o fator de diluição correto seja inserido para obter resultados precisos.

4. Limpeza pós-análise

  1. Abra a gaveta usando o botão Abrir ou a chave seletora física.
  2. Remova o slide usado.
  3. Coloque a corrediça de calibração de volta na gaveta para proteger o sensor.
  4. Feche a gaveta.
  5. Descarte tubos, pontas e lâminas usados de acordo com os regulamentos para resíduos de laboratório.

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Resultados

Seguindo este protocolo, a plataforma LSIT permite uma avaliação quantitativa e sem rótulos da ativação de células NK com base em alterações morfológicas nas células. A Figura 2A mostra preparações de citospin coradas com Hema-3 de células NK primárias de doadores saudáveis após incubação de 2 h com ou sem ASC. A ativação pelo ASC resulta em mudanças acentuadas, principalmente aumento celular e aumento da complexidade ou granularidade interna, em comparação com os controles do veículo (não e...

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Discussão

Este protocolo apresenta um método padronizado e sem rótulo para quantificar a ativação de células NK que combina isolamento e ativação celular usando o NK Prep Kit, com análise via plataforma LSIT. Ele oferece uma alternativa rápida e quantitativa aos ensaios convencionais, como liberação de 51Cr, citometria de fluxo e ELISA. O protocolo foi desenvolvido para laboratórios equipados com a plataforma LSIT e fornece resultados simples com base na análise de imagem de so...

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Divulgações

I.L., S.H., H.S.J. e S.S. são afiliadas à Metaimmunetech Inc., uma empresa envolvida no desenvolvimento e comercialização da plataforma LSIT apresentada neste estudo. Especificamente, H.S.J. é o fundador e CEO, S.H. é o CEO e S.S. é o CTO da empresa. No entanto, os autores afirmam que os resultados e interpretações deste manuscrito são relatados de forma objetiva e não são influenciados por interesses comerciais de qualquer tipo. Todos os outros autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelos Programas de Pesquisa em Ciências Básicas da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) da Coreia (Grant#: RS-2024-00353675, Grant#: 2021R1I1A3056109), o programa de apoio ITRC (Information Technology Research Center) supervisionado pelo IITP (Instituto de Planejamento e Avaliação de Tecnologia da Informação e Comunicação) e a Agência de Promoção de Comercialização para Resultados de P&D (COMPA) financiada pelo Ministério da Ciência e TIC (MSIT), Coreia (Grant#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), Grant#: 2710084652), o programa de apoio do Instituto Coreano de Promoção de Ciência e Tecnologia Marinha (KIMST) financiado pelo Ministério dos Oceanos e Pescas da Coreia (Grant#: 20210660) e o Korea University Grant. Os autores agradecem à Metaimmunetech Inc. por sua colaboração, com base na tecnologia transferida da Universidade da Coreia, no desenvolvimento do dispositivo Cellytics NK.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mLAXYGENMCT-175-CEstéril, livre de DNase/RNase
Slide de ensaioMetaimmunetechAS050-GSlide dedicado para sistema Cellytics
50 slides em uma caixa
Sistema Cellytics com softwareMetaimmunetechCS001Plataforma de imagem de sombra sem lentes
Centrífuga (rotor de caçamba oscilante)LABOGENE1580R300– 500 &vezes; Gama G
Sensor de imagem CMOSIncluído com o dispositivo CellyticsIntegradoUsado para imagens de difração
Centrífuga CytospinNasco CoreiaCentrífuga TXT3 CytoPara coloração de citospin
Bloco de Aquecimento Digital (37 ° C)Daihan CientíficoDH. WHB00349Para incubação celular
Kit ELISA (IFN-&gama;)R& DDIF50CIFN-&gama humano; Kit ELISA
Citômetro de fluxo Goiaba easyCyteMillipore0500-5005Para análise de expressão de CD107a
Pacote de 3 Estatísticas HemaThermoFisher122-911Para coloração de citospin
IL-12 (Humano Recombinante)R& DComponente do ASC
IL-2 (Humano Recombinante)Peprotech200-02Componente do ASC
Rack de separação magnéticaMetaimmunetechM13R8Para separação de esferas
Lâminas de microscópioMarienfeld1000612Para preparações de citospin
Kit de ativação NKMetaimmunetechMIT2301V, MIT2301APara ativação de células NK
Kit NK SetMetaimmunetechMIT2301-500Para isolamento de células NK
Rato PE Anti-Humano CD107a, 100testBD biociências555801Para análise de expressão de CD107a
Abertura do orifícioIncluído com o dispositivo CellyticsIntegradoUsado no caminho de iluminação LSIT
Pipetas (2– 20 µ L, 20– 200 µ L)AXYGENT-200-YVolume ajustável
Slide de calibração de sombraMetaimmunetechAS050-GPara calibração do dispositivo.
1 Lâmina de calibração em 1 caixa de lâminas de ensaio
Misturador de vórticeMerck SI-0246APara ressuspensão

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