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Artigo de método

Imagens químicas de conteúdo de informação ultra-alta com microscopia de tempo de vida de fluorescência de dois fótons e anti-Stokes coerente de banda larga

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DOI:

10.3791/68845

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7 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo demonstra uma plataforma de imagem multimodal que combina espalhamento anti-Stokes Raman coerente de banda larga (BCARS), fluorescência de excitação de dois fótons (TPEF) e microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons (2p-FLIM), permitindo bioimagem química de conteúdo de informação ultra-alto.

Resumo

A espectroscopia de impressão digital Raman e a imagem de fluorescência ao longo da vida são ferramentas emergentes para estudar perfis metabólicos de espécimes biológicos. Enquanto a espectroscopia de impressão digital Raman detecta vibrações moleculares intrínsecas que refletem a composição molecular e o ambiente químico de uma amostra, a imagem de tempo de vida de fluorescência mede as mudanças no tempo de vida do estado excitado dos fluoróforos que são sensíveis aos seus microambientes. Aqui, apresentamos uma plataforma de imagem multimodal que combina espalhamento Raman anti-Stokes coerente de banda larga (BCARS) e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência de dois fótons (2p-FLIM) que pode adquirir espectros de impressão digital Raman biologicamente relevantes e sinais de tempo de vida de fluorescência in vivo e simultaneamente. A tremenda informação química obtida a partir de imagens BCARS e 2p-FLIM co-registradas espacialmente nos permite caracterizar as diferenças sutis entre os compartimentos subcelulares e verificar os potenciais resultados falso-positivos gerados apenas pela imagem de fluorescência. Isso é demonstrado comparando diretamente os sinais BCARS, 2p-FLIM e fluorescência de excitação de dois fótons (TPEF) obtidos simultaneamente da mesma organela corada com corante no C. elegans vivo e intacto expressando um marcador de proteína fluorescente verde (GFP). Neste trabalho, apresentamos o esquema de configuração BCARS/2p-FLIM/TPEF, as etapas de aquisição de imagem, processamento de dados e resultados representativos mostrando que o método de imagem de modalidade cruzada permite caracterização rigorosa e detecção in vivo em resolução subcelular. Este protocolo fornece uma estrutura para imagens simultâneas de tempo de vida químico e de fluorescência para melhorar a precisão da interpretação biológica em sistemas vivos complexos.

Introdução

Um desafio em estudos biológicos é detectar com precisão materiais de construção biológicos em seus estados nativos e dentro da arquitetura intacta de células e tecidos. A espectroscopia Raman mostra um potencial sem precedentes para detectar metabólitos intrínsecos e espécies químicas em espécimes biológicos e foi recentemente reconhecida como uma ferramenta emergente para o perfil metabólico de espécimes biológicos1. Ao analisar os picos de vários grupos metabólicos mostrados nos espectros de impressão digital Raman, evidências crescentes mostram que as características da impressão digital podem ser usadas para detectar os estágios iniciais de doenças como câncer 2,3,4, distúrbios cardíacos 5,6 e doenças neurodegenerativas 7,8 e é particularmente útil para abordar problemas biológicos fundamentais 9,10 incluindo imagens de estruturas intracelulares sem qualquer perturbação de marcação11, diferenciando vários estados celulares12,13 e classificação do tipo de célula 14,15,16. A maioria das informações químicas (> 90%) codificadas nos espectros Raman está na região da impressão digital (500 a 1800 cm-1), tornando esta região de longe a mais útil para discriminar composições químicas em amostras biológicas17. No entanto, o sinal Raman fraco nesta faixa de frequência torna desafiadoras as aplicações da espectroscopia de impressão digital Raman para estudos biológicos, particularmente para espécimes biológicos vivos e intactos1.

As abordagens de imagem Raman coerente (CRI) reduzem significativamente o tempo de aquisição dos sinais Raman, mas a maioria delas adquire segmentos espectrais relativamente estreitos e são otimizadas para os fortes sinais de estiramento CH entre 2800 - 3100 cm-1. CARS de banda estreita e espalhamento Raman estimulado (SRS) (Figura 1A, B) usam pulsos de dois picossegundos, geralmente para adquirir uma porção estreita do forte sinal CH 18,19,20,21,22,23. As abordagens multiplex CRI, como o CARS multiplex (Figura 1C), usam uma combinação de pulsos de picossegundo e ~ 100 fs para obter uma faixa espectral moderada (geralmente ≤ 400 cm-1), geralmente na região CH 24,25,26,27,28,29,30. A aquisição de todo um espectro Raman biologicamente relevante (de 600 a 3200 cm-1) por pixel usando essas abordagens de imagem geralmente é proibitiva porque a maioria dos sinais de impressão digital é 10 a 100 vezes mais fraca do que os sinais de alongamento CH31. Ao contrário da maioria das abordagens CRI, o espalhamento Raman anti-Stokes coerente de banda larga (BCARS) é otimizado para aquisição de banda larga de disparo único que cobre as regiões de impressão digital e alongamento CH 31,32,33. O BCARS usa interações intra-pulso de um pulso de ~ 10 fs para excitar eficientemente vibrações de baixa frequência (impressão digital) (Figura 1D) e usa o mesmo mecanismo do CARS multiplex, a combinação do pulso fs com um pulso ps para gerar coerência vibracional na região de estiramento CH (Figura 1C) 32 , 33. Além disso, os sinais BCARS são intrinsecamente calibrados devido à sua interação com o fundo não ressonante (NRB), resultando em um espectro Raman completo quantitativo e invariante do instrumento por pulso de laser em cada pixel31, com a capacidade de adquirir rapidamente dados de alto conteúdo de informação de células, tecidos intactos e organismos biológicos vivos 32,34,35,36,37,38,39.

Os espectros BCARS brutos adquiridos contêm um forte chamado "fundo não ressonante" (NRB). O NRB é a contribuição da resposta eletrônica aos pulsos de laser que não é quimicamente específica. O NRB interfere coerentemente no sinal vibracionalmente ressonante, atuando como um amplificador heteródino32. O NRB também distorce o espectro Raman subjacente (Figura 2A), mas o espectro Raman pode ser recuperado desde que seções espectrais contíguas significativas sejam adquiridas. Atualmente, não há método de pós-processamento disponível para separar o sinal CARS ressonante do componente não ressonante usando uma abordagem CARS de banda estreita. A recuperação do sinal Raman do sinal CARS de banda larga pode ser alcançada utilizando a relação Kramers-Kronig no domínio do tempo (ou transformada de Hilbert) 33 , 40 ( Figura 2B ), entropia máxima41 , 42 ou aprendizado de máquina43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 Abordagens. Observe que os dois primeiros métodos recuperam analiticamente a fase (o sinal Raman ressonante) dos espectros brutos do BCARS, as abordagens de aprendizado de máquina podem ser altamente dependentes da instrumentação e dos modelos de treinamento.

Embora a microscopia BCARS permita a caracterização sem rótulos do perfil metabólico de espécimes biológicos, o mesmo laser supercontínuo (950 - 1200 nm para a configuração BCARS apresentada neste trabalho) usado para geração de sinal BCARS também pode excitar uma ampla gama de corantes, como corantes à base de rodamina, Bodipy, Alexa Fluor e cianina, e várias proteínas fluorescentes, incluindo GFP e mCherry49, 50. Em comparação com a excitação de fóton único usando lasers de onda contínua (CW) visível, a microscopia de fluorescência multifotônica, como microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons (2p-FLIM) e microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons (TPEF), usando luz infravermelha próxima (NIR) oferece uma profundidade de penetração de amostra mais profunda, capacidade de seccionamento 3D intrínseca, imagens de alto contraste e boa resolução comparável à microscopia confocal de última geração, tornando-a uma ferramenta atraente para microscopia biológica Pesquisa 51,52. A microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) usando uma abordagem de contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo (TCSPC) detecta os sinais de decaimento de fluorescência repetidamente excitados por uma fonte de laser modulada no tempo53,54. O espectro de fluorescência de um determinado fluoróforo pode mudar com fatores ambientais, como a polaridade do solvente, mas essas mudanças geralmente são sutis. Por outro lado, os tempos de vida de fluorescência geralmente variam por fatores de dois ou mais com mudanças ambientais, como valores de pH55, viscosidade56, polaridade57 e concentração de espécies iônicas58,59, interações de ligação, presença de supressores ou mudanças estruturais53,54. Essa propriedade única do tempo de vida da fluorescência fornece um contraste de sinal adicional na imagem de fluorescência e abordou com sucesso os problemas de interferência de autofluorescência na imagem de células e tecidos60, desmisturando vários fluoróforos usando uma abordagem FLIM espectralmente resolvida61, diagnóstico de câncer e monitoramento de tratamento62, detecção sem rótulo de heterogeneidade celular63 e alterações metabólicas64,65.

Neste trabalho, apresentamos uma plataforma de imagem multimodal combinando BCARS, 2p-FLIM e TPEF. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que apresentamos uma plataforma de imagem que permite imagens simultâneas de BCARS e 2p-FLIM/TPEF. Demonstramos as capacidades de imagem in vivo deste instrumento usando um organismo modelo geneticamente tratável amplamente utilizado, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Mostramos que os espectros BCARS, os decaimentos 2p-FLIM do Vermelho do Nilo (um corante lipídico vital) e os sinais GFP de fluorescência de dois fótons de um marcador lipídico relatado (DHS-3 :: GFP) podem ser adquiridos simultaneamente in vivo de vermes corados com Vermelho do Nilo. Um guia prático para a abordagem de imagem aqui apresentado inclui (i) a amostra deve ser opticamente transparente e com uma espessura normalmente inferior a 100 μm; (ii) a condição de coloração pode ser diferente dependendo dos corantes e amostras. Nos resultados da coloração Nilo-Vermelho de C. elegans mostrados aqui, a concentração de Vermelho do Nilo está no nível ~μM, e o tempo de coloração pode variar de algumas horas a durante a noite66; iii) é necessário um ambiente de amostra escuro para evitar fugas de luz visível para os detectores 2p-FLIM/TPEF. Essas condições de imagem são idênticas às condições de imagem da maioria das microscopias ópticas e de fluorescência não lineares. Além disso, nosso sistema demonstrado aqui pode ser aplicado para detectar outros corantes e repórteres fluorescentes, além de Nile Red e GFP, introduzindo um laser adicional Ti: Sapphire fs que cobre a faixa de 700 a 950 nm para a excitação de fluorescência de dois fótons. Assim, enquanto os resultados representativos descritos neste protocolo são a imagem in vivo de C. elegans corado com corante expressando GFP, a plataforma de bioimagem química de conteúdo de informação ultra-alta tem aplicações que são amplas e de longo alcance.

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Protocolo

1. C . preparação de amostras elegans e coloração Nile Red Vital

NOTA: C. elegans tem sido muito usado para várias técnicas de imagem devido à sua transparência de corpo inteiro. Os órgãos e tecidos internos podem ser facilmente visualizados no animal intacto sem dissecação. Além disso, a aprovação ética não é necessária para pesquisas envolvendo C. elegans, pois eles não são considerados vertebrados e não estão sujeitos aos mesmos regulamentos éticos que animais superiores, como roedores. Esta seção descreve a sincronização de vermes C. elegans e a preparação de amostras coradas com vermelho do Nilo para imagens de fluorescência. Vermes adultos sincronizados de um dia são obtidos por meio de um protocolo de postura de ovos de duas gerações e corados com placas Nile Red-OP50 recém-preparadas.

  1. Mantenha as cepas de C. elegans (por exemplo, N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) em placas padrão de meio de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com bactérias OP50 a 20 °C.
  2. Sincronize os worms
    1. Escolha 10-20 minhocas adultas grávidas em um prato NGM recém-feito com sementes OP50.
    2. Incubar a placa a 20 °C durante 1-3 h para permitir a postura dos ovos.
    3. Remova todos os vermes adultos, deixando apenas os ovos recém-postos no prato.
    4. Incubar a placa a 20 °C até que os vermes atinjam a fase adulta de um dia.
    5. Repita as etapas acima para uma geração adicional para melhorar a precisão da sincronização.
  3. Prepare a solução de estoque de Nile Red
    1. Dissolva 15,92 mg de Vermelho do Nilo em 10 mL de DMSO até uma concentração final de 5 mM.
    2. Sonicar por 10-30 min, se necessário, para ajudar na dissolução.
  4. Prepare as placas de coloração Nile Red-OP50.
    1. Misture bem a pasta bacteriana OP50 com o estoque de vermelho do Nilo para obter uma concentração final de vermelho do Nilo de 5 μM por placa NGM. Por exemplo, misture 10 μL do estoque de Vermelho do Nilo com 20 μL de pasta bacteriana OP50 e, em seguida, aplique imediatamente toda a mistura em uma placa de ágar NGM de 6 cm (com volume de ~ 10 mL) não semeada para fazer uma concentração final de Vermelho do Nilo de 5 μM por placa NGM.
    2. Espalhe a mistura uniformemente em placas NGM de 6 cm sem sementes.
    3. Armazene os pratos no escuro em temperatura ambiente durante a noite para permitir o crescimento bacteriano e a absorção do corante.
  5. Manchar vermes sincronizados
    1. Transfira 30-50 minhocas adultas sincronizadas de um dia para cada placa preparada de Nile Red-OP50.
    2. Incubar os vermes no escuro a 20 °C durante 1-2 h antes de obter imagens.
  6. Imobilize vermes para imagens
    1. Aplique uma gota de azida sódica 100 mM em uma almofada de agarose a 2% em uma lâmina de microscópio (aproximadamente 10-15 μL para 20 vermes)
    2. Transfira os vermes corados para a gota de agente anestésico (azida sódica) e cubra os vermes com uma lamínula antes da microscopia.
      NOTA: Ao escolher 10-20 adultos grávidas em um prato NGM OP50 recém-feito na primeira etapa da sincronização da postura de ovos, escolha apenas os adultos, mas não os ovos ou larvas perdidas. Isso é para garantir que todos os ovos restantes nas placas sejam produzidos pelos vermes colhidos dentro da janela de tempo de postura de 1-3 horas. Além disso, a azida sódica é classificada como um material perigoso, embora exija uma quantidade muito pequena para anestesia de nematóides. O uso e descarte de resíduos de azida de sódio devem seguir as diretrizes do departamento institucional de Saúde e Segurança Ambiental.

2. Geração de feixe de sonda

NOTA: Este protocolo descreve a geração do feixe de sonda de picossegundo (ps) usando um oscilador paramétrico óptico (OPO) construído em casa seguido pela geração de segundo harmônico (SHG) com um sistema de loop de feedback de sinal construído em casa para estabilizar a potência de saída do feixe de sonda.

  1. Ligue o laser da bomba OPO de 1030 nm (Figura 3A ou o laser da bomba OPO próximo a 1ps, ~3 W mostrado na Figura 4) e aguarde pelo menos 2 h para o equilíbrio térmico. A saída estável é crítica para a operação OPO.
  2. Guie a saída para a cavidade OPO
    1. Selecione o período de polarização apropriado no cristal OPO PPLN (Figura 3A) para corresponder ao comprimento de onda do sinal alvo.
    2. Direcione o feixe para o primeiro espelho curvo (CM) (Figura 3A), formando parte de uma cavidade linear.
    3. Certifique-se de que o feixe passe pelo cristal de niobato de lítio (PPLN) com pólo OPO (Figura 3A) para facilitar a conversão paramétrica óptica (Figura 3B).
    4. Certifique-se de que o feixe reflita em um segundo espelho curvo (CM) e, em seguida, no espelho final (EM) (Figura 3A) para formar o loop da cavidade.
    5. Configure o acoplador de saída (OC) (Figura 3A) para extrair o feixe de sinal gerado da cavidade.
  3. Ajuste a temperatura do cristal OPO PPLN usando o controlador de temperatura (TC) (Figura 3A) para selecionar o comprimento de onda do sinal. Um comprimento de onda de sinal típico é de 1530 nm, correspondendo a uma potência de saída de aproximadamente 0,8 W quando bombeado com 3 W a 1064 nm.
  4. Otimize o alinhamento OPO
    1. Ajuste a posição e a inclinação de dois CMs e EM para maximizar a potência de saída e a qualidade do feixe.
    2. Ajuste o comprimento da cavidade para mudar o espectro do sinal para a frequência desejada.
  5. Direcione o feixe de sinal OPO através de um conjunto de ópticas de colimação e foco e guie-o para o estágio SHG.
    1. Selecione o período de polarização apropriado no cristal SHG PPLN (Figura 3A) para corresponder ao comprimento de onda do sinal alvo.
    2. Controle com precisão a temperatura do cristal usando um controlador de temperatura para maximizar a eficiência do SHG.
    3. Direcione o feixe para o cristal SHG PPLN para geração de segundo harmônico, convertendo o sinal OPO de 1530 nm em 765 nm (Figura 3C). A eficiência de conversão típica do SHG é de aproximadamente 30% em condições ideais de alinhamento.
    4. Insira um filtro passa-curta de 1300 nm (SPF na Figura 3A, especificações na Tabela de Materiais) após o SHG PPLN para remover a luz fundamental residual de 1530 nm.
    5. Colime o feixe de 765 nm resultante usando uma lente apropriada (como L na Figura 3A).
  6. Implementar estabilização de energia
    1. Use uma janela de cunha (WW) para amostrar o feixe SHG e direcioná-lo para um fotodiodo (PD).
    2. Certifique-se de que um loop de feedback compare o sinal de fotodiodo (PD na Figura 3A) com um valor de referência e acione o Picomotor no espelho final (EM) para ajustar o comprimento da cavidade OPO em tempo real, estabilizando assim a potência de saída do SHG.
      NOTA: Para determinar o valor de referência, primeiro escaneie a posição EM usando o Picomotor enquanto registra a potência de saída SHG. Identifique a intensidade do pico neste perfil e defina o valor de referência como 90% do pico. Essa escolha garante uma direção clara de correção de feedback, permitindo que o sistema compense as tendências crescentes e decrescentes de potência e estabilize efetivamente a potência de saída ao longo do tempo.

3. Geração de supercontínuo (SC) para BCARS

NOTA: O esquema simplificado do sistema multimodal baseado em BCARS é mostrado na Figura 4. Este protocolo descreve a geração do feixe SC.

  1. Ajuste o pré-chirp (Group Delay Dispersion, GDD) para a saída de pulso de femtossegundo (fs) (1030 nm, 150 fs, ~ 1 W) para obter uma largura de banda SC ampla o suficiente cobrindo os sinais da região da impressão digital (largura de banda SC ≥ 1800 cm−1). Consiga isso ajustando a separação de um par de grades (veja a Figura 4), permitindo um controle preciso sobre a dispersão.
    NOTA: A aplicação de GDD pré-compensado é crucial para gerar o pulso desejado e otimizar a geração de SC. O valor GDD necessário pode variar dependendo das características específicas do sistema laser usado.
  2. Incorpore um telescópio de feixe composto por duas lentes com as mesmas distâncias focais para ajustar a divergência do feixe da bomba.
    NOTA: Quando o feixe percorre metros antes de entrar na fibra em alargamento, o controle preciso da divergência do feixe torna-se essencial. Manter um feixe colimado durante essa distância é fundamental para garantir a geração eficiente de SC.
  3. Configure o alinhador automático (Figura 4) usando suportes de espelho cinemáticos equipados com atuadores piezoelétricos para direção do feixe. Combine-os com cunhas ópticas e um detector de detecção de posição (PSD) para monitorar ativamente e corrigir o alinhamento do feixe.
  4. Posicione os componentes de forma que a distância do calço ao primeiro espelho seja igual à distância do calço ao primeiro PSD. Essa configuração simétrica garante a estabilidade do apontamento do feixe na fibra em alargamento.
    NOTA: O alinhamento ativo é essencial para maximizar a eficiência do alargamento espectral e minimizar o risco de danos à entrada de fibra.
  5. Use uma placa de meia onda (HWP) e um divisor de feixe polarizador (PBS) para controlar a potência do laser antes de acoplar na fibra. Gire o HWP para ajustar o ângulo de polarização em relação ao PBS, ajustando assim a potência transmitida. Embora esses componentes não sejam mostrados na Figura 4, eles são essenciais para o alinhamento seguro e o controle de energia.
  6. Acople aproximadamente 1 W de potência do laser em uma fibra de cristal fotônico (PCF) de manutenção de polarização de grande área de modo (LMA-PM-5) de 10 cm usando um acoplador de fibra. O procedimento de acoplamento é o seguinte:
    1. Primeiro, reduza a potência do laser para ~20-50 mW durante o alinhamento inicial para evitar danos à fibra.
    2. Direcione o feixe colimado para a fibra, garantindo que alguma luz surja do outro lado. Otimize o caminho do feixe ajustando sua posição para maximizar a potência de saída.
    3. Insira a lente asférica (Figura 4), ajuste o feixe novamente para maximizar a potência de saída.
    4. Ajuste a posição z da lente asférica para garantir um foco preciso na faceta da fibra.
    5. Repita os ajustes de alinhamento e foco iterativamente para maximizar a eficiência do acoplamento.
    6. Aumente a potência do laser para 1 W para operação.
  7. Colime a saída de supercontínuo de banda larga (SC) resultante do PCF usando um espelho parabólico fora do eixo (OAP) com distância focal f = 15 mm, conforme mostrado na Figura 4.
    NOTA: Óptica reflexiva, como o espelho OAP, é preferida para feixes de banda larga para minimizar a aberração cromática introduzida por elementos de refração.
  8. Guie a saída do supercontínuo de banda larga colimada (SC) para um compressor de prisma (Figura 4) que consiste em um par de prismas Schott Flint (SF10).
    1. Direcione o feixe SC para o ápice do primeiro prisma para iniciar a dispersão espectral.
    2. Posicione o segundo prisma de forma que o feixe disperso entre por seu ápice.
    3. Monte ambos os prismas em um sistema de trilhos para permitir o ajuste grosseiro da separação do prisma. Translade o segundo prisma ao longo do trilho para ajustar o comprimento do caminho óptico e a compactação geral. A separação para este sistema é de 44 cm.
    4. Monte o primeiro prisma em um estágio de translação linear de precisão. Ajuste a profundidade de inserção do primeiro prisma para ajustar a compensação de dispersão.
    5. Ajuste iterativamente a separação do prisma e o comprimento de inserção do segundo prisma para obter a compressão temporal ideal do pulso SC. Determine a compressão temporal ideal combinando o sinal de mistura degenerada de quatro ondas (DFWM) observado experimentalmente com resultados simulados que levam em conta a dispersão de atraso de grupo (GDD) e a dispersão de terceira ordem (TOD). Essa abordagem envolve a realização de uma simulação do processo de geração do supercontínuo, incorporando os efeitos de GDD e TOD, que fornece uma referência para as características temporais e espectrais esperadas dos pulsos SC otimamente comprimidos. Em seguida, ajuste iterativamente os parâmetros do compressor de prisma para compensar o GDD e o TOD presentes no sistema até que o sinal experimental do DFWM corresponda às previsões da simulação. Um resultado típico do perfil espectral do SC é mostrado na Figura 5.
      NOTA: A compensação de dispersão adequada aumenta a coerência espectral do SC. Sob alinhamento ideal, a saída SC tem uma potência de aproximadamente 150 mW, um comprimento de onda central em torno de 1060 nm e abrange uma faixa espectral de 950 a 1200 nm (correspondendo a 1800 cm−1). Esses valores podem variar um pouco dependendo do alinhamento e da eficiência do acoplamento da fibra.
  9. Combine os feixes de sonda e supercontínuo usando um espelho dicróico (veja DM na Figura 4). Alinhe-os com um par de orifícios para garantir que ambas as vigas sejam colineares. Focalize os feixes combinados em um fotodiodo de alta frequência (largura de banda de 1 GHz). Para uma qualidade de sinal ideal, ambos os feixes devem ser sobrepostos nos domínios espacial e temporal. O processo é o seguinte:
    1. Direcione a saída do fotodiodo para um osciloscópio de alta frequência (largura de banda de 500 MHz). Use o gatilho do laser como relógio de referência.
    2. Bloqueie o feixe da sonda e meça os pulsos SC. Registre as diferenças temporais entre os pulsos SC e a referência do laser.
    3. Bloqueie o feixe SC e meça os pulsos da sonda. Ajuste a linha de atraso mecânico (conforme mostrado na Figura 4) de modo que os pulsos da sonda se sobreponham aos pulsos SC no tempo. Certifique-se de que os dois feixes atinjam seu máximo simultaneamente.
    4. Remova o fotodiodo e deixe o feixe prosseguir para o microscópio.
      NOTA: As etapas acima descrevem um ajuste grosseiro para sobreposição de feixe. A otimização adicional para um alinhamento mais preciso é abordada nas etapas 6.1 a 6.9.

4. Configurando a detecção de fluorescência para 2p-FLIM e TPEF e introduzindo um laser adicional Ti:Sapphire fs

  1. Ligue o laser Ti:Sapphire e deixe-o atingir o equilíbrio térmico. Aguarde aproximadamente 2 h para garantir uma potência de saída estável e o apontamento do feixe.
    NOTA: Neste estudo, as imagens TPEF e FLIM foram realizadas usando a fonte SC, que fornece ampla cobertura espectral e potência suficiente para fluoróforos como GFP e Nile Red. O laser Ti:Sapphire está incluído no sistema como uma fonte de excitação opcional para fluoróforos com picos de absorção de dois fótons abaixo de 950 nm, que podem não ser excitados de forma eficiente pelo SC.
  2. Ative o mecanismo de bloqueio de modo no laser Ti:Sapphire. Confirme o bloqueio de modo estável através do monitor integrado.
  3. Pré-chirpe os pulsos Ti:Sapphire para compressão temporal ideal na amostra usando um compressor de prisma. Organize os prismas em uma configuração semelhante à descrita na etapa 3.8 e ajuste o comprimento de inserção do segundo prisma para ajustar a duração do pulso.
    NOTA: A compressão temporal adequada garante intensidade de pico e excitação eficiente de dois fótons no plano da amostra.
  4. (Opcional) Acople o feixe Ti:Sapphire em uma fibra monomodo de manutenção de polarização se o laser estiver localizado em uma mesa óptica separada. Ajuste a óptica de acoplamento de entrada e monitore a saída de fibra para minimizar as perdas de acoplamento.
  5. Combine o feixe Ti:Sapphire com o supercontínuo (SC) e os feixes de sonda usando um espelho dicróico (veja o ponto de combinação em PBS mostrado na Figura 3). Alinhe os feixes cuidadosamente para garantir a sobreposição espacial no dicróico e a co-propagação em direção ao microscópio.
  6. Guie os feixes combinados para o microscópio e ajuste sua sobreposição espacial. Use uma amostra fluorescente (por exemplo, uma lâmina com esferas de poliestireno fluorescente de 1 μm) para verificar o alinhamento do feixe Ti:Sapphire em relação ao caminho de excitação do BCARS. Ajuste os espelhos de alinhamento Ti:Sapphire para garantir que a emissão de fluorescência seja co-localizada com o ponto focal BCARS dentro do mesmo campo de imagem. Confirme a colocalização visualizando a sobreposição entre as imagens BCARS e TPEF que são adquiridas simultaneamente, onde o deslocamento espacial deve ser menor que um pixel.
    NOTA: Obter sobreposição espacial entre os sinais de fluorescência e BCARS é essencial para o registro de imagens multimodais.
  7. Insira um espelho dicróico antes da entrada do microscópio para refletir a fluorescência retroespalhada em direção ao caminho de detecção. Selecione um dicróico com um comprimento de onda de corte apropriado para separar eficientemente a fluorescência dos feixes de excitação.
  8. Insira um segundo espelho dicróico a jusante no caminho de emissão para dividir o sinal de fluorescência em duas ramificações de detecção:
    1. Transmita comprimentos de onda ≥ 550 nm para o detector FLIM.
    2. Reflita comprimentos de onda ≤ 550 nm em direção a um tubo fotomultiplicador (PMT) para detecção analógica de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF).
      NOTA: Instale filtros passa-banda em cada ramificação de detecção para bloquear a luz de excitação residual e isolar bandas de emissão específicas.
  9. Conecte a saída PMT a um préamplifier e alimente o ampsinal analógico lificado em um dispositivo de aquisição de dados (DAQ). Compartilhe o gatilho de sincronização global do FPGA (Field Programmable Gate Array) com o DAQ para garantir o alinhamento temporal entre as modalidades de imagem (Figura 7).
  10. Conecte a saída do detector FLIM a um módulo de contagem de fótons únicos correlacionado ao tempo (TCSPC).
    1. Conecte o sinal do detector FLIM à entrada de partida do módulo TCSPC.
    2. Conecte a saída de sincronização do laser Ti:Sapphire (ou BCARS SC) à entrada de referência do módulo TCSPC.
    3. Conecte o disparador global da câmera (gerado pelo FPGA) à entrada de sincronização de quadros do módulo TCSPC para sincronizar com a aquisição de imagem digitalizada por linha.

5. Configurando o caminho de detecção do BCARS

NOTA: Este protocolo descreve a configuração de um caminho de detecção digitalizado para imagens hiperespectrais de varredura de linha. O espelho galvo 1D varre o feixe de excitação ao longo do eixo y com tempo de permanência de 2-4 ms por pixel para integração de sinal suficiente. Após cada varredura de linha, o estágio de amostra avança um passo ao longo do eixo x. A desvarredura usando um espelho galvo secundário sincronizado é essencial para manter o registro espacial consistente do sinal espectral na câmera durante a varredura rápida do feixe, eliminando a diafonia do sinal entre pixels adjacentes e preservando a fidelidade espectral espacial39.

  1. Introduza o supercontínuo (SC) e os feixes de sonda em um scanner galvo unidimensional (1D) (conforme mostrado na Figura 4 e mais detalhes na referência39). Posicione o espelho galvo conjugado com a abertura traseira da objetiva de foco para permitir uma varredura precisa do feixe em todo o campo de view.
  2. Expanda cada feixe usando um expansor de feixe reflexivo (como mostrado na Figura 4) para corresponder à abertura traseira da objetiva de excitação. Isso garante um foco ideal e a máxima resolução espacial no plano da amostra.
    NOTA: Use óptica reflexiva para minimizar a aberração cromática e manter o conteúdo espectral de banda larga do feixe SC.
  3. Coloque um alvo de alinhamento no plano de abertura traseira do objetivo de excitação. Ajuste os feixes SC e da sonda para que ambos passem pelo centro do alvo, garantindo o co-alinhamento ao longo do eixo óptico.
    NOTA: A sobreposição espacial precisa maximiza a intensidade do sinal BCARS e garante a máxima resolução espacial no ponto focal.
  4. Focalize os feixes na amostra usando uma objetiva de excitação de alta NA (por exemplo, objetiva de imersão em água de 1,2 NA, 60x) montada em um microscópio invertido.
  5. Prepare uma amostra de alinhamento imprensando uma gota de água entre duas lamínulas para criar uma lâmina de microscópio selada. Coloque a lâmina preparada no microscópio stage e ajuste o foco para trazer a amostra à vista.
  6. Colete o sinal anti-Stokes gerado na transmissão usando uma objetiva de coleta colocada em frente ao caminho de excitação.
  7. Implemente um sistema de desvarredura 4f (como mostrado na Figura 4) para preservar o mapeamento espacial do sinal anti-Stokes em linhas fixas do detector.
    1. Retransmita o plano focal traseiro (BFP) da objetiva de coleta no eixo do espelho galvo de devarredura usando um sistema óptico 4f. Consiste em duas lentes de tubo de precisão (consulte a Tabela de Materiais), dispostas de forma que:
      1. A primeira lente é colocada uma distância focal (200 mm) após o BFP da objetiva de coleta.
      2. A segunda lente é colocada uma distância focal antes do espelho galvo.
    2. Sincronize o galvo de desvarredura com o galvo de varredura usando um gerador de forma de onda controlado por FPGA.
    3. Integre um potenciômetro digital de 7 bits no sistema de controle FPGA para permitir o ajuste da amplitude do galvo de decancanção.
      NOTA: O espelho do galvo de varredura compensa as deflexões angulares introduzidas pelo galvo de varredura primário. Ao ajustar dinamicamente seu ângulo em sincronia, ele neutraliza o movimento do feixe, garantindo que o sinal anti-Stokes permaneça alinhado ao longo do eixo óptico que leva ao espectrômetro. Essa estabilização é essencial para manter o registro espacial no detector e evitar o deslocamento lateral da imagem espectral durante a varredura.
  8. Configure o sistema FPGA (consulte a Tabela de Materiais) para sincronizar a varredura galvo e o disparo da câmera.
    1. Gere saídas analógicas para os galvos de varredura e desvarredura.
    2. Aceite um gatilho de estágio de entrada para marcar o início de cada varredura de linha.
    3. A captura de quadros de saída aciona sinais para a câmera científica de semicondutores de óxido de metal complementar (sCMOS) em cada posição de varredura.
    4. Controle independentemente a amplitude de varredura para acomodar diferentes objetivos de coleta.
      NOTA: Um trem de pulso FPGA típico inclui um sinal de acionamento galvo de varredura, um sinal de acionamento galvo de varredura, uma entrada de disparo de estágio e um relógio de pixel para temporização de quadro sincronizada.
  9. Passe o sinal anti-Stokes colimado através de dois filtros passa-curto para bloquear a bomba residual e a luz de excitação SC.
  10. Focalize o sinal anti-Stokes filtrado através da fenda de entrada do espectrômetro e no detector sCMOS. Ajuste os ângulos dos galvos de varredura e desvarredura para garantir que o feixe seja varrido paralelamente ao eixo longo da fenda, alinhando o plano da imagem óptica com a fenda. Esse alinhamento preciso maximiza a resolução espectral e minimiza a diafonia do sinal lateral nas fileiras do detector.
  11. Configure o espectrômetro para dispersar o espectro anti-Stokes verticalmente ao longo das fileiras da câmera. Selecione uma grade apropriada (por exemplo, 300 linhas/mm, queimada a 700 nm) para uma cobertura espectral ideal.

6. Otimização de sinal e calibração de resolução espectral

  1. Inicie o software de aquisição caseiro e inicie o monitoramento de sinal em tempo real da câmera sCMOS. O software de aquisição é construído internamente em Python 3.8+ (Windows 10) com dependências, incluindo drivers Hamamatsu DCAM-API e Measurement Computing Universal Library, gerando dados no formato HDF5. O software está disponível mediante solicitação razoável do autor correspondente.
  2. Preparar uma amostra de calibração espectral colocando uma gota de benzonitrila entre duas lamínulas para formar uma lâmina selada. Coloque a lâmina na platina do microscópio e coloque-a em foco usando a objetiva de excitação.
  3. Localize o sinal BCARS na câmera sCMOS. Ajuste a posição z da objetiva de coleta para maximizar a intensidade do sinal anti-Stokes.
  4. Ajuste a posição lateral da objetiva de coleta para garantir que a luz anti-Stokes seja corretamente focalizada através da fenda de entrada do espectrômetro. Esse alinhamento garante um acoplamento ideal no espectrômetro e uma fidelidade espectral aprimorada.
  5. Otimize a sobreposição espacial entre o supercontínuo (SC) e os feixes de sonda no plano da amostra. Use espelhos no caminho do feixe da sonda para ajustar com precisão sua posição lateral e ângulo de incidência.
  6. Traduza a linha de atraso óptico no caminho do feixe da sonda para garantir a sobreposição temporal com os pulsos SC. Monitore a intensidade do sinal e ajuste até que o sinal anti-Stokes seja maximizado, confirmando a sincronização temporal adequada.
  7. Identifique um pico Raman forte e nítido na benzonitrila (por exemplo, 1002 cm-1) na imagem sCMOS.
  8. Registre o comprimento de onda da sonda e sua posição de pixel correspondente na câmera. Use a linha de Rayleigh (0 cm-1 no comprimento de onda da sonda) e os picos Raman de benzonitrila conhecidos em 1002 cm-1 e 3073 cm-1 para estabelecer um mapeamento linear de pixel para número de onda no detector sCMOS. A linha de Rayleigh fornece a referência do número de onda zero, enquanto os picos de benzonitrila determinam o incremento do número de onda por pixel.
    NOTA: Como a análise requer apenas informações relativas do número de onda (mapeamento entre a posição do pixel e o deslocamento Raman), a calibração absoluta do comprimento de onda usando lâmpadas de emissão não é necessária.
  9. Insira o mapeamento do número de onda de pixels no software de aquisição. Esta calibração deve permanecer válida, a menos que sejam feitas alterações no caminho óptico, na configuração da grade no espectrômetro ou no alinhamento.

7. Aquisição de sinal

  1. Carregue a amostra de C. elegans preparada nas etapas 1.1 a 1.6 no estágio de microscópio. Localize uma região de interesse e coloque-a em foco usando a objetiva de excitação.
  2. Identifique uma região no slide que não tenha sinal Raman-ativo (fundo de água ou uma lamínula de vidro nu) para servir como referência de fundo não ressonante (NRB).
  3. Localize o sinal BCARS no detector sCMOS. Ajuste a posição z da objetiva de coleta para maximizar a intensidade do sinal anti-Stokes.
  4. Ajuste a posição lateral da objetiva de coleta para garantir que a luz anti-Stokes esteja alinhada corretamente através da fenda de entrada do espectrômetro.
  5. Inicie a varredura sincronizada e a varredura de espelhos galvo usando o FPGA. Ajustar a amplitude do galvo de descantilação utilizando o potenciómetro digital até que a deflexão angular do rastreio primário seja totalmente compensada. O sinal anti-Stokes deve permanecer confinado dentro de ~ 12 linhas na câmera em toda a faixa de varredura.
  6. Definir uma sequência de aquisição temporal
    1. Adquira um sinal de correlação cruzada entre o SC e os pulsos da sonda atrasando o pulso da sonda. Para adquirir isso, plote o sinal BCARS de três cores integrado versus o atraso de tempo do pulso da sonda. O sinal mais forte aparecerá no tempo 0 quando os pulsos SC e da sonda estiverem temporariamente sobrepostos.
      NOTA: Como os sistemas de detecção FLIM e TPEF compartilham o mesmo gatilho que o BCARS, seus sinais são adquiridos simultaneamente durante esse período.
    2. Registre com um atraso posterior do feixe da sonda (por exemplo, 1-2 ps) para BCARS e um atraso posterior do feixe SC para fundo não ressonante (espectros NRB na Figura 6A). Quando um atraso de tempo é aplicado ao pulso de banda estreita (sonda), o NRB no sinal CARS de três cores pode ser efetivamente suprimido e, portanto, a relação sinal-ruído pode ser melhorada67.
    3. Adquira uma imagem escura sem sobreposição temporal entre o SC e a sonda para capturar o ruído do detector de linha de base (referência escura).
    4. Salve todas as imagens BCARS, NRB e escuras, incluindo os metadados em um único arquivo h5.
  7. Protocolo de Processamento de Sinal BCARS
    1. Abra o software CRIkit268.
    2. Carregue todos os conjuntos de dados necessários usando a ferramenta Open HDF, conforme mostrado na Figura 6B: Carregar dados hiperespectrais BCARS, referência NRB e referência escura. Selecione a região de frequência dentro da largura de banda de geração de sinal BCARS usando a ferramenta Freq Window (de 400 cm-1 a ≥ 3200 cm-1 para o sistema BCARS demonstrado aqui).
    3. Execute as etapas de pré-processamento:
      1. Use a ferramenta Anscombe (como mostrado na Figura 6B) para estabilizar a variância dos conjuntos de dados BCARS e NRB.
      2. Use a ferramenta Redução de ruído para executar a decomposição de valor singular (SVD): retenha os componentes principais com base na inspeção visual. Preserve os componentes que exibem distribuições espaciais correspondentes à morfologia da amostra e descarte os componentes dominados por ruídos não estruturados ou semelhantes a manchas. Essa etapa de redução de ruído melhora a relação sinal-ruído (SNR), principalmente para recursos espectrais de baixa intensidade.
      3. Use a ferramenta Inverse Anscombe para restaurar os dados para seu domínio original.
        NOTA: Essas etapas podem ser ignoradas se estiver executando o processamento em tempo real na aquisição.
    4. Recupere espectros do tipo Raman usando a transformada de Kramers-Kronig (KK):
      1. Abra a ferramenta KK (conforme mostrado na Figura 6B).
      2. Habilite Norm para NRB para garantir a normalização de referência espectral apropriada.
      3. Defina parâmetros, incluindo polarização NRB, fator de preenchimento e média de pixels de borda.
      4. Execute a transformação KK para obter espectros Raman recuperados.
    5. Executar correções de erro pós-KK
      1. Corrija erros de fase usando a suavização de Savitzky-Golay: Abra a ferramenta de correção de erros de fase (Figura 6B). Ajuste o tamanho da janela de suavização e a ordem polinomial. Inspecione os espectros originais versus corrigidos usando o painel de visualização .
      2. Corrigir erros de escala: Abra a ferramenta de correção de erros de balança (Figura 6B). Normalize os espectros para corrigir a escala de intensidade relativa no conjunto de dados. Garanta a consistência entre as dimensões espaciais e espectrais.
    6. Calibrar eixo espectral (opcional, se desalinhado): Abra a ferramenta de calibração (Figura 6B). Compare os números de onda medidos com os picos de referência conhecidos. Aplique a inclinação/interceptação corrigida para realinhar o eixo espectral.
    7. Definir e extrair dados de regiões de interesse (ROIs)
      1. Use o ROI Spect. ou Pt Spect. (Figura 6B) para marcar regiões espaciais de interesse ou pontos de interesse na imagem BCARS.
      2. Visualize e compare o conteúdo espectral de diferentes ROIs.
      3. Exporte espectros recuperados para análise quantitativa ou quimiométrica adicional.

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Resultados

A Figura 5 mostra os espectros medidos da sonda de banda estreita e os pulsos de supercontínuo (SC) de banda larga usados para excitação BCARS. O pulso da sonda, gerado por meio da geração de segundo harmônico de um sinal de ~ 1530 nm a partir de um oscilador paramétrico óptico construído em casa (OPO, Figura 3), é centrado em 764,2 nm com uma largura total na metade do máximo (FWHM) de 0,2 nm, fornecendo a resolução espectral em ~ 6,8 cm-1 n...

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Discussão

Este trabalho demonstra a arquitetura da plataforma de imagem BCARS e 2p-FLIM/TPEF em detalhes. Enquanto um laser de 1030 nm de saída dupla é usado em nossa configuração atual, a maioria dos lasers de fibra fs 1030 nm de alta potência pode ser usada como uma fonte de laser mestre para a construção de um microscópio BCARS. Ao escolher cuidadosamente o comprimento e o período dos cristais OPO / SHG PPLN, é possível gerar um pulso de sonda de alguns ps com uma bomba sub-ps OPO 1030 nm. Embo...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar e não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

W-W.C. reconhece o apoio do NIH (R21AG086974). A MTC reconhece o apoio do Departamento de Energia dos EUA (DOE BERDE-SC0022121).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CâmeraHamamatsuORCA-FusãosCMOS, 2304× 2304 píxeis
Objetivo da coleção  Olimpo  LUMPLFLN60XW  Imersão em água, 1,0 NA
Perguntas frequentes  Diligente  MCC USB-1208HS  Cartão de aquisição de dados
Linha de atraso  Newport  DL225  Atraso mecânico para pulso de sonda
Dichroic  Semrock  FF925-DI01  combinando sonda e SC
Dichroic  Semrock  FF705-DI01  Detecção de fluorescência de modo epi
Dichroic  Thorlabs  DMLP550R  separando o sinal FLIM e o sinal TPEF
Objetivo de excitação  Olimpo  UPLSAPO60XWIR  Imersão em água, 1,2 NA
Filtro  Semrock  FF01-1326/SP-25  Rejeite o laser fundamental após SHG
Filtro  Semrock  FF01-758/SP  Rejeite o laser fundamental antes da câmera BCARS
Filtro  Thorlabs  FESH0650  Rejeite o laser fundamental antes da modalidade de fluorescência
FLIM PMT  PicoQuant  PMA Híbrido  Detector de fóton único FLIM
FPGA  Redpitaya  STEMlab 125-14  Sincronização e acionamento de varredura
Galvo  Thorlabs  GVS101  Para digitalização e desdigitalização
Grelha  Coerente  LightSmyth 1040nm  1000 Groves/mm, pré-chirp para SC
Placa de meia onda  Thorlabs  AHWP05M-980  Controle de polarização
Cubo K  Thorlabs  KPA101Driver PSD para o alinhador automático
Laser  Instrumentos Prospectivos  FSX-Dual  Laser de femtossegundo de saída dupla
Laser  Coerente  Mira-900  Laser de femtossegundo para excitação de fluorescência
PBS  Thorlabs  PBS255  Combinação de feixe para SC e sonda
PCF  Thorlabs  LMA-PM-5  Fibra de cristal fotônico de 10 cm para geração SC
PD  Thorlabs  PDA100A2  Ciclo de feedback OPO
Suporte de espelho piezoelétrico  Thorlabs  POLARIS-K1S2P  Ajustador piezoelétrico para o auto-alinhador
Pré-amplificador  EdmundOptics  59-179  Pré-amplificador TPEF
Prisma  Óptica de pesquisa Lambda  EQP-30SF10  Compressão SC
PSD  Thorlabs  PDQ80A  Detector sensível à posição para o alinhador automático
Espectrómetro  Teledyne Princeton Instrumentos  IsoPlano 160  Grelha de 300 g/mm, centrada a 700 nm
Palco  ASI  MS-2000  Platina motorizada de 3 eixos
TCSPC  PicoQuant  Multiharpa 150  Dispositivo de contagem de fótons para FLIM
TPEF PMT  Hamamatsu  H9305-03  Detector TPEF
Lente de tubo  Thorlabs  TL200-2P2  Usado no sistema de digitalização

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