Imagem de células vivas da segregação cromossômica durante a meiose de oócitos de camundongos

Resumo

Aqui, resumimos as técnicas de imagem de células vivas para estudar a segregação cromossômica em oócitos de camundongos, usando H2B-RFP para cromatina e SiR-Tubulina para visualização do fuso. Detalhamos a preparação da amostra, microinjeção, cultura, configuração e análise de imagens, oferecendo um guia prático para obter imagens de alta resolução e minimamente fototóxicas da dinâmica cromossômica meiótica.

Resumo

A segregação cromossômica precisa durante a meiose do oócito é essencial para garantir o desenvolvimento embrionário adequado e prevenir distúrbios relacionados à aneuploidia. A imagem de células vivas combinada com técnicas de marcação de fluorescência tornou-se uma abordagem poderosa para estudar a dinâmica cromossômica meiótica com alta resolução espaço-temporal. Neste protocolo, resumimos as principais metodologias para visualizar a segregação cromossômica em oócitos vivos de camundongos, com foco no uso da histona H2B-RFP para marcação da cromatina e SiR-Tubulin para rastreamento do fuso. Descrevemos os procedimentos para preparação de amostras, microinjeção de mRNA, cultura de oócitos, configuração da câmara de imagem de células vivas e configurações de microscopia confocal, todos otimizados para obter imagens de alta resolução, minimizando a fototoxicidade. Além disso, destacamos considerações experimentais críticas, como fototoxicidade, processamento de imagens e análise quantitativa de eventos meióticos. Ao fornecer uma avaliação abrangente das metodologias atuais, este protocolo serve como um guia prático para pesquisadores que buscam investigar a dinâmica cromossômica em oócitos vivos e melhorar a precisão e a reprodutibilidade dos estudos meióticos.

Introdução

A visualização precisa da dinâmica cromossômica e fusiforme durante a meiose do oócito é fundamental para a compreensão dos mecanismos que governam a maturação dos gametas femininos e o risco de aneuploidia 1,2,3,4,5. Os oócitos de mamíferos passam por uma série altamente coordenada de eventos meióticos, incluindo quebra da vesícula germinativa (GVBD), condensação cromossômica, montagem do fuso e divisão assimétrica⁶. Embora a imagem de ponto de tempo fixo tenha fornecido instantâneos valiosos desses processos, ela carece de resolução temporal e não pode capturar eventos transitórios ou rápidos que ocorrem entre os intervalos de amostragem. Em contraste, a imagem de células vivas de cromossomos e microtúbulos marcados com fluorescência oferece uma abordagem poderosa para monitorar esses processos dinâmicos em tempo real ^2,3,7. Isso permite a observação direta do tempo, duração e sequência de eventos meióticos em oócitos individuais e permite a identificação de eventos transitórios que, de outra forma, poderiam ser perdidos em amostras fixas. No entanto, manter a viabilidade e a integridade fisiológica do oócito durante a microinjeção e a imagem requer manuseio meticuloso e condições otimizadas⁸.

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho abrangente para microinjetar oócitos em estágio de vesícula germinativa de camundongo (GV) com cRNA H2B-RFP, permitindo a marcação fluorescente da cromatina, seguida por imagens confocais de lapso de tempo dos cromossomos e comportamento do fuso durante a meiose⁴. O método integra etapas-chave, incluindo priming hormonal, isolamento de oócitos, microinjeção sob condições controladas de temperatura e imagens ao vivo usando microscopia confocal com controle ambiental ^4,9. O objetivo geral deste artigo é apresentar um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para visualização em tempo real da dinâmica cromossômica e fusiforme em oócitos de camundongos vivos, fornecendo uma plataforma para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à regulação meiótica e ao risco de aneuploidia.

Embora este protocolo forneça alta resolução temporal e espacial, ele depende da expressão exógena do repórter, que pode não replicar totalmente a dinâmica da proteína endógena e pode interferir nos processos meióticos nativos se superexpresso. Os pesquisadores devem considerar essas limitações e validar os achados usando abordagens complementares sempre que possível.

Este protocolo foi desenvolvido para apoiar estudos que investigam mecanismos meióticos, erros de segregação cromossômica e o impacto de perturbações genéticas ou ambientais na qualidade do oócito. Ele fornece uma plataforma robusta para pesquisa básica e aplicações translacionais em biologia reprodutiva.

Protocolo

Todos os experimentos devem ser conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Animal local. Os procedimentos experimentais devem aderir estritamente aos princípios dos 3Rs - Substituição, Redução e Refinamento. Os camundongos devem ser alojados em uma instalação de animais credenciada sob condições ambientais padronizadas (22 ° C, 60% de umidade) com livre acesso a comida e água.

1. Coleta e preparação de oócitos

NOTA: Todos os equipamentos e reagentes devem ser estéreis. Realize todo o manuseio de oócitos usando uma pipeta bucal sob um estereomicroscópio (consulte a Tabela de Materiais). Cubra todas as gotículas do meio de cultura com óleo mineral (Figura 1A-E).

1. Estimulação hormonal
   1. Injete camundongos fêmeas de 3-4 semanas de idade por via intraperitoneal com 5 unidades internacionais (UI) de gonadotrofina sérica de égua prenhe (PMSG; ver Tabela de Materiais) 46-48 h antes da coleta de oócitos.
      NOTA: B6CBAF1 camundongos (descendentes F1 de C57BL / 6J × CBA / CaCrl) são preferidos devido ao rendimento superior de oócitos e características favoráveis de maturação.
2. Preparação de meios de cultura
   1. Filtre os meios M2 e M16 (consulte a Tabela de Materiais) usando um filtro de seringa de 0,2 μm. Suplemento com IBMX até uma concentração final de 100 μM diluindo de um estoque de 100 mM.
   2. Prepare 5-6 gotículas de M2-IBMX (~ 30 μL cada) e 3 gotículas de M16-IBMX em placas de cultura de tecidos plásticos de 35 mm. Cubra todas as gotículas com óleo mineral. Coloque as placas M2-IBMX em um bloco quente a 37 ° C ( Figura 1A ) e as placas M16-IBMX em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO₂ por pelo menos 30 minutos antes do isolamento do oócito ( Figura 1 C ).
   3. Prepare um prato adicional contendo 800-1.000 μL de M2-IBMX (sem óleo) para dissecção do ovário. Colocar sobre uma placa de aquecimento a 37 °C montada sobre um estereomicroscópio (figura 1B).
3. Isolamento de oócitos
   1. Sacrifique camundongos por luxação cervical. Limpe a parte inferior do abdômen com etanol a 70% e, em seguida, faça uma pequena incisão horizontal na pele e no peritônio para entrar na cavidade peritoneal. Estenda a incisão separando as bordas da incisão com os dedos.
   2. Usando uma pinça, varra o intestino para fora do caminho para expor os ovários na parte superior do abdômen, localizada no pólo superior dos rins. Usando pinças finas e microtesouras, excise cuidadosamente os ovários, evitando danos ao tecido. Transfira imediatamente os ovários para um tubo de 1,5 mL contendo 100-200 μL de meio M2-IBMX pré-aquecido.
   3. Transfira os ovários para 1 mL de meio M2-IBMX pré-aquecido e passe para um estágio de microscópio de dissecção aquecido (Figura 1B). Remova cuidadosamente o tecido adiposo e os restos ovidutais.
      NOTA: Manuseie os ovários com cuidado para evitar danos aos folículos ou oócitos. Mantenha os ovários em meio quente durante a transferência da sala de animais para o laboratório.
   4. Libere complexos cumulus-oócitos (COCs) puncionando folículos usando uma agulha 27 G (Figura 1A-B). Colete os COCs e transfira para gotículas de 25-30 μL de M2-IBMX (Figura 1D).
   5. Dissocie as células do cumulus pipetando repetidamente com uma pipeta de Pasteur de vidro de calibre estreito (Figura 1E).
      NOTA: Embora a pipetagem bucal seja comumente usada para o manuseio de oócitos, pipetadores mecânicos ou micromanipuladores fornecem alternativas, especialmente em ambientes onde a pipetagem bucal é restrita ou inviável. Essas alternativas têm sido empregadas com sucesso em protocolos semelhantes^10,11.
   6. Identifique e selecione oócitos totalmente crescidos em estágio GV com base em um GV de diâmetro maior e localizado centralmente usando um estereomicroscópio com ampliação de 20x-40x. Transferir para 30 μL frescos de gotículas M2-IBMX em um bloco quente de 37 °C, protegido da luz.
      NOTA: Mantenha os oócitos a 37 °C durante todos os procedimentos para preservar a integridade fisiológica. Pré-aqueça todos os meios e use estágios com temperatura controlada para todos os manuseamentos e microinjecções baseados no microscópio.
   7. Permita que os oócitos se recuperem por 20 minutos em um estágio aquecido a 37 ° C antes da microinjeção.

2. Preparação de cRNA H2B-RFP

NOTA: Execute todas as etapas usando luvas em um ambiente limpo e livre de RNase. Use apenas água e reagentes livres de RNase e, de preferência, trabalhe na presença de inibidores de RNase.

1. Verifique a sequência do plasmídeo H2B-RFP (consulte a Tabela de Materiais) por sequenciamento de Sanger usando primers flanqueando o inserto. Amplifice o plasmídeo transformando E. coli competente (por exemplo, DH5α), selecionando uma única colônia e cultivando-a em caldo LB com antibióticos apropriados. Purifique o plasmídeo usando um kit de preparação midi ou maxi padrão. Para procedimentos detalhados, consulte Green e Sambrook¹².
2. Purifique o DNA do plasmídeo usando um kit miniprep comercial de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro.
3. Linearize 2-4 μg de DNA de plasmídeo a jusante da inserção usando uma enzima de restrição adequada que corta uma vez na estrutura do vetor (NotI foi usado para H2B-RFP). Estabelecer a reação de digestão utilizando o tampão e a concentração enzimática adequados, conforme descrito no quadro 1 , e incubar a 37 °C durante 1-2 h. Confirme a linearização completa por eletroforese em gel de agarose. Múltiplas bandas indicam digestão incompleta. Se estiver usando um kit comercial, siga as instruções do fabricante.
   NOTA: Escolha uma enzima de restrição que corte precisamente a jusante do inserto e em condições ideais de digestão. Verifique a linearização executando uma pequena alíquota em um gel de agarose.
4. Remova a contaminação por RNase incubando a reação de digestão com 1 μL de proteinase K (10 μg / mL), 5,3 μL de SDS a 10% e 50 μL de água livre de nuclease a 50 ° C por 1 h.
   NOTA: Esta etapa é essencial para eliminar RNase e contaminantes proteicos. Use apenas reagentes livres de RNase e mantenha condições de trabalho limpas.
5. Extrair o ADN digerido com álcool fenol:clorofórmio:isoamílico (25:24:1), seguido de uma extração com clorofórmio.
   NOTA: Para minimizar a toxicidade e agilizar o manuseio da amostra, métodos comerciais de purificação baseados em colunas ou esferas (por exemplo, membrana de sílica ou sistemas de esferas magnéticas) também podem ser usados no lugar da extração de fenol/clorofórmio.
6. Precipite o DNA adicionando acetato de sódio 3 M e etanol 100%. Incubar a -80 °C durante pelo menos 2 h.
7. Pulverize o DNA por centrifugação a 12.000-14.000 x g por 10 min a 4 ° C. Lave o pellet com etanol a 70%, centrifugue novamente na mesma velocidade por 5 min a 4 ° C, seque ao ar brevemente (2-5 min) e ressuspenda em 6 μL de água livre de RNase.
   NOTA: Após a precipitação e centrifugação do etanol, uma pelota translúcida ou branca visível deve se formar no fundo do tubo. Se nenhum pellet for visto, repita a centrifugação em uma velocidade mais alta ou reavalie a concentração de DNA.
8. Realize a transcrição in vitro usando o kit T7 mMESSAGE mMACHINE (ver Tabela 2), seguindo o protocolo do fabricante.
9. Incubar a reação de transcrição a 37 °C durante pelo menos 2 h. Estenda a incubação se o comprimento da transcrição exceder 5 kb.
10. Remover o ADN molde por tratamento com DNase utilizando 1 U de DNase I por 10 μL de volume de reacção, incubado a 37 °C durante 15 min.
11. Purifique o cRNA sintetizado usando precipitação de cloreto de lítio¹³. Após a precipitação e centrifugação, um pellet translúcido ou branco visível deve se formar no fundo do tubo. Lave o pellet de RNA com etanol a 70%.
12. Ressuspenda o pellet final de cRNA em 20 μL de água livre de RNase. Meça a concentração de RNA e confirme a presença e o comprimento da cauda poli(A) realizando RT-PCR seguido de sequenciamento do produto de PCR. Aliquotar o cRNA em volumes de 1 μL e armazená-lo a -80 °C.

3. Preparação e microinjeção de ovócitos

NOTA: Durante todo o procedimento, mantenha os oócitos a 37 °C usando meios pré-aquecidos e estágios de microscópio com temperatura controlada para preservar a qualidade do oócito.

1. Preparação
   1. Descongele as alíquotas de cRNA H2B-RFP no gelo, centrifugue brevemente e dilua até a concentração desejada (por exemplo, 250 ng/μL).
      NOTA: A concentração ideal de cRNA pode variar dependendo da construção, sistema de expressão e objetivos experimentais. Recomendamos titular a concentração de cRNA (por exemplo, dentro da faixa de 50-300 ng/μL) para minimizar os artefatos de superexpressão e, ao mesmo tempo, garantir sinal suficiente. Os usuários também devem monitorar a progressão meiótica (por exemplo, GVBD, formação de fuso e extrusão de corpo polar) como uma leitura funcional da saúde e viabilidade do oócito após a expressão do construto. Foi relatado que as concentrações de injeção de cRNA normalmente variam de 0,2 a 1 μg/μL, com resultados ótimos geralmente alcançados em 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
   2. Prepare agulhas de microinjeção a partir de capilares de vidro borossilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm, comprimento = 100 mm) usando um extrator de pipeta (Figura 2A).
      NOTA: Usamos um extrator de pipeta vertical (consulte a Tabela de Materiais; Figura 2A). Otimize os parâmetros de tração empiricamente. A ponta da agulha deve ser fina o suficiente para minimizar os danos ao oócito, mas larga o suficiente para evitar entupimento e permitir a entrega suave de cRNA.
   3. Carregue 0,5-1,5 μL de solução de cRNA na ponta da agulha usando pontas de microcarregadores sem RNase. Remova quaisquer bolhas de ar antes da injeção.
2. Configuração do prato de microinjeção
   1. Prepare uma placa de microinjeção com 100 μL de meio M2-IBMX e cubra completamente com óleo mineral para evitar evaporação e mudanças de osmolaridade.
3. Microinjeção de oócitos
   1. Monte as pipetas de retenção e injeção no sistema micromanipulador (Figura 2B,C).
   2. Coloque a placa de microinjeção no microscópio stage. Usando uma pipeta de boca, transfira os oócitos para a gota M2-IBMX.
   3. Coloque as pipetas de retenção e de injeção no mesmo plano horizontal dos ovócitos.
   4. Capture um oócito usando sucção suave com a pipeta de retenção (Figura 2B e C).
   5. Insira a agulha de injeção através da zona pelúcida e do oolema, visando o citoplasma e evitando o núcleo.
   6. Forneça cRNA H2B-RFP usando um breve pulso de capacitância negativa através de um eletrômetro intracelular (Figura 2B-E). Mantenha o volume de injeção aproximadamente 5% do volume do oócito. Uma injeção bem-sucedida é normalmente visível como uma dispersão pequena, mas distinta, do citoplasma. Ajuste a pressão e o tempo de injeção para evitar danos à membrana.
   7. Retire a agulha rápida e suavemente no mesmo ângulo para minimizar o rasgo da membrana.
   8. Solte o oócito da pipeta de retenção e reposicione-o em uma área separada do prato para distinguir os oócitos injetados dos não injetados (Figura 2F). Para esta configuração, organize o fluxo de trabalho mantendo os oócitos não injetados na parte superior do prato e movendo os injetados para a parte inferior.
   9. Repita as etapas 3.3.4-3.3.8 para todos os oócitos restantes. As taxas de sobrevivência pós-injeção variam de acordo com a técnica e as propriedades do mRNA. Espere 60% -80% de viabilidade.
4. Manuseio pós-injeção
   1. Transfira os oócitos injetados para uma gota fresca de meio M16-IBMX em uma placa de cultura limpa.
   2. Incubar a 37 °C durante 1-4 h para permitir a expressão de H2B-RFP. Ajuste a duração da incubação com base na concentração de cRNA, tamanho do transcrito e eficiência de expressão.

4. Imagem em timelapse de cromossomos marcados com H2B-RFP durante a meiose

1. Preparação de equipamentos e meios
   1. Pré-aqueça o microscópio confocal, a incubadora e a câmara ambiental a 37 °C por ≥ 30 min antes do uso (Figura 3A). Ligue o controlador de gás e inicie o fluxo de gás para manter a câmara a 5% de CO₂ e O₂ ambiente. Certifique-se de que a câmara esteja umidificada para apoiar a saúde dos oócitos durante a imagem estendida de células vivas.
   2. Prepare gotas de cultura: Coloque 5-6 gotas de 50 μL de meio M16 suplementado com SiR-Tubulina (concentração final de 100 nM) em uma placa de Petri de 35 mm. Cubra com óleo mineral. Em um prato de imagem separado com fundo de vidro, coloque três gotas de 5 μL de M16 + SiR-Tubulina e cubra com óleo mineral. Pré-aqueça ambos os pratos a 37 °C durante ≥ 30 min antes de utilizar.
2. Transferência e lavagem de oócitos
   1. Lavagem de ovócitos: Transfira os oócitos injetados sequencialmente através das gotas de 50 μL M16 + SiR-Tubulin para lavar o IBMX residual (5 lavagens recomendadas). Faça lavagens suaves para evitar danos aos oócitos.
      NOTA: O IBMX residual pode inibir a retomada da meiose, portanto, a lavagem completa é crítica.
   2. Transferência final: Após as lavagens, transfira 15-20 ovócitos para a gota de 5 μL de M16 + SiR-Tubulina na placa de imagem com fundo de vidro pré-aquecido.
3. Configuração do microscópio
   1. Montagem do prato de imagem: Coloque o prato com fundo de vidro no microscópio confocal stage (Figura 3A). Deixe os oócitos assentarem por ~ 10 min.
   2. Posicionamento do palco: Usando imagens de campo claro, centralize os oócitos no campo de visão. Salve posições usando o software do microscópio.
      NOTA: Neste estudo, usamos um microscópio confocal Leica TCS SP8 com uma lente objetiva de imersão em água HC PL APO 20x/1.0 NA. No entanto, outros sistemas confocais e lentes objetivas com especificações semelhantes podem ser usados dependendo da disponibilidade.
   3. Configuração da bomba de água para objetivas de imersão em água: Se estiver usando uma lente objetiva de imersão em água, opere o sistema de bomba de água para fornecer água intermitentemente em intervalos de 5 a 10 minutos. Esse fluxo periódico mantém a coluna de água entre a lente e o prato de imagem com fundo de vidro, evitando o ressecamento e garantindo condições de imagem estáveis durante experimentos de longo prazo. Para lentes de imersão em óleo, essa configuração de fluxo de água não é necessária.
4. Configurações de imagem
   1. Mude para o modo de varredura a laser. Defina as intensidades do laser da seguinte forma: 561 nm a 0,5% (~100 μW na objetiva) para H2B-RFP (cromossomos); 633 nm a 3% (~300 μW na objetiva) para SiR-Tubulina (microtúbulos do fuso; Figura 3B, E).
      NOTA: Siga as diretrizes de segurança do laser adequadas. Minimize a exposição ao laser para proteger a viabilidade da amostra.
5. Aquisição de pilha Z
   1. Adquira pilhas Z abrangendo 30-50 μm com um tamanho de passo de 2-4 μm (Figura 3B,C).
   2. Capture imagens em intervalos de 5 a 10 minutos usando uma velocidade de varredura de 600 Hz (Figura 3B,D). A duração total da imagem pode abranger 12-16 h, dependendo do estágio meiótico que está sendo monitorado, e é limitada pela fototoxicidade e tolerância do oócito à cultura in vitro estendida.
6. Aquisição sequencial de imagens
   1. Nos sistemas de microscópio, execute varredura sequencial com dois detectores HyD: H2B-RFP: Excitação a 561 nm; emissão coletada em 580-630 nm; Excitação de SiR-Tubulina a 633 nm; emissão coletada a 650-700 nm (Figura 3E).
7. Iniciando imagens de lapso de tempo
   1. Antes de iniciar a aquisição de lapso de tempo de longo prazo, verifique a qualidade do sinal tirando uma imagem de teste. Os sinais fluorescentes devem ser distribuídos uniformemente: H2B-RFP deve rotular a cromatina distintamente e SiR-tubulina deve destacar as estruturas dos microtúbulos sem fundo excessivo. Confirme a estabilidade do foco automático e o fotobranqueamento mínimo em curtas execuções preliminares de imagens.
   2. Inicie a aquisição de imagens com lapso de tempo clicando em Iniciar.
      NOTA: GVBD, marcando a entrada na fase M, geralmente ocorre 60-90 min após o washout do IBMX (Figura 4A). Nesta configuração, os oócitos C57BL / 6 expulsam o primeiro corpo polar cerca de 8-9 h após o GVBD ( Figura 4A ). O tempo pode variar com a cepa do camundongo e as condições de cultura.

5. Processamento pós-imagem

1. Abra o arquivo de imagem em um software de análise de imagem selecionando Arquivo > Abrir e escolhendo o arquivo .lif na sessão de imagem.
2. Gere projeções Z para os canais H2B RFP e SiR-Tubulin selecionando Processamento > Gerar projeção. Defina o tipo de projeção como Projeção de intensidade máxima. Selecione os canais RFP e SiR Tubulin e clique em Executar.
   NOTA Não execute uma projeção Z para o canal DIC, pois isso pode resultar em uma imagem borrada. Em vez disso, identifique e selecione o único plano DIC com foco mais nítido. Use esta imagem DIC focada em combinação com as projeções de intensidade máxima dos canais H2B-RFP e SiR-Tubulin para obter a visualização ideal.
3. Extraia um único plano focal de campo claro. Retorne às Ferramentas de processo e selecione Editar > recorte. Escolha o canal Campo claro, use o controle deslizante Z para encontrar o plano focal ideal e clique em Aplicar.
4. Mescle as imagens de projeção e campo claro abrindo Ferramentas de processo, selecionando Mesclar > Adicionar canais. Adicione a projeção RFP, a projeção SiR-Tubulin e a imagem de campo claro único. Clique com o botão direito do mouse no conjunto mesclado e clique em Aplicar.
5. Exporte a imagem mesclada final selecionando Arquivo > Exportar > imagem. Escolha o formato TIFF para saída não compactada de alta qualidade.
   NOTA: A exportação no formato TIFF é recomendada para análise downstream e preparação de figuras.

Resultados

Conforme mostrado na Figura 4A, B, este protocolo permite imagens de células vivas de alta qualidade de cromossomos (H2B-RFP) e microtúbulos fusiformes (SiR-tubulina) em oócitos, fornecendo assim informações espaço-temporais abrangentes durante a maturação meiótica.

O canal H2B-RFP na Figura 4A revela todos os aspectos do movimento cromossômico desde o alinhamento inicial após GVBD (Figura 4A

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve um método robusto para a microinjeção e imagem de células vivas de oócitos de camundongos, permitindo a visualização da dinâmica cromossômica durante a meiose com alta resolução temporal e espacial. Fundamental para o sucesso dessa abordagem é o manuseio meticuloso dos oócitos em cada etapa do procedimento, desde a coleta e microinjeção até a imagem. Os oócitos são altamente sensíveis às flutuações ambientais, e desvios de temperatura, pH ou osmolari...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringas de 1 ml	Terumo	Tuberculina SS+01T	Seringas para injeções precisas de PMSG.
Gel de agarose	Invitrogen	16500500	Usado para eletroforese em gel de DNA e RNA para separar ácidos nucléicos por tamanho, para conformar a sequência H2B-RFP
Queimador de álcool	LabTek	LW15557-01	Usado para esterilização e preparação de petitte bucal.
Meios de cultura bacterianos (caldo LB)	Sigma-Aldrich	L3022	Meio padrão usado para o cultivo de E. coli e outras culturas bacterianas.
Placas de cultura de células (35 &vezes; 10 mm e 60 &vezes; 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Usado para cultura de oócitos; Disponível em vários tamanhos.
Centrífuga (bancada)	Eppendorf	5424R	Uma centrífuga compacta para pequenos volumes de amostra comumente usada em laboratórios de pesquisa.
Tubos de centrífuga (15 ml e 50 ml)	Corning	352096, 352070	Tubos maiores para centrifugação, comumente usados para processamento de células e proteínas.
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	C2432	Solvente comumente utilizado em protocolos de biologia molecular, especialmente na extração de DNA/RNA.
Incubadora de CO2	Sanyo	(modelo: MCO-18AIC)	Incubadora projetada para manter uma atmosfera controlada de CO2 para a cultura de oócitos.
Agulhas ultrafinas descartáveis (27 G &vezes; 1/2")	Hanke Lobo Sávido	4710004012	Agulhas finas para coleta de oócitos
DNase I (sem RNase)	Thermo Fisher Científico	EN0521	Enzima usada para remover o DNA contaminante das preparações de RNA.
Bloco de aquecimento seco	Instrumentos de Subvenção	(modelo: QBD4)	Um bloco usado para aquecer amostras ou reações em temperaturas precisas sem a necessidade de água.
Etanol (grau de biologia molecular)	Sigma-Aldrich	E7023	Usado para precipitação de DNA e RNA, bem como em procedimentos de esterilização.
Tesoura de dissecação fina	Met-App Instrumentos Científicos e Cirúrgicos	2235	Usado para oócitos de camundongo de dissecção precisa
Pinça fina	Met-App Instrumentos Científicos e Cirúrgicos	2127	Usado para oócitos de camundongo de dissecção precisa
Sistema de eletroforese em gel	Bio-Rad	1645050	Sistema para realizar eletroforese de ácidos nucléicos ou proteínas em géis.
Sulfato de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1264	Antibiótico usado para prevenir a contaminação bacteriana em culturas de células.
Pipetas Pasteur de vidro (230 mm)	VWR	6121702	Pipetas de vidro usadas para pipeta de boca de oócitos
A IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	Um inibidor da fosfodiesterase usado para prevenir a GVBD
Microscópio invertido	Nikon		Um microscópio projetado para observar células vivas ou organismos por baixo da placa de cultura.
Óleo mineral leve adequado para cultura de embriões de camundongos	Sigma-Aldrich	M5310	Usado para cobrir oócitos em cultura para evitar a evaporação e manter a temperatura.
Cloreto de lítio	Sigma-Aldrich	L9650	Usado em métodos de precipitação de RNA.
Sistema de imagem de células vivas	Leica	LAS X	Sistema de imagem projetado para observação em tempo real de células vivas usando técnicas avançadas de microscopia.
Meio M16 (para cultura in vitro)	Sigma-Aldrich	M7292	Um meio projetado para a cultura de oócitos e embriões de camundongos e outras aplicações in vitro.
Tubos de microcentrífuga (0,6 ml e 1,6 ml)	Netuno	3735.X, 3745.X	Tubos de pequeno volume para centrifugação, frequentemente usados em protocolos de biologia molecular e bioquímica.
Tubos de microcentrífuga (sem RNase)	Eppendorf / Netuno	022431081 (Eppendorf)	Os tubos livres de RNA para RNA funcionam para prevenir a degradação do RNA.
Agulhas de microinjeção	Instrumentos Sutter	Extrator de pipetas P-30	Agulhas para microinjeção precisa em oócitos
Sistema de microinjeção	Aparelho de Harvard	FemtoJet, PicoPump	Sistemas usados para injetar cRNA em oócitos de camundongos com alta precisão.
Kit Miniprep	Qiagen	27106 (Kit Miniprep QIAprep Spin)	Um kit para isolar DNA de plasmídeo de culturas bacterianas para aplicações de biologia molecular.
Conjunto do tubo do aspirador da boca	Sigma-Aldrich	Rolamento A5177	para oócitos aspirados
Tinta Pellet	Merck Millipore	69049-3	Um produto para visualizar a formação de pellets durante a centrifugação.
Fenol: Clorofórmio: Álcool isoamílico	Thermo Fisher Científico	15593031	Uma solução usada na extração de H2B-RFP para separação de fases.
Plasmídeo que codifica H2B-RFP	Addgene	Plasmídeo #20972	Plasmídeo usado para marcar cromossomos com proteína de fluorescência vermelha (RFP)
PMSG	Especificações	HOR-272	Para superovalação de camundongos
Proteinase K	Thermo Fisher Científico	EO0491	Uma enzima usada para digerir proteínas, comumente usada em procedimentos de extração de DNA / RNA.
Enzima de restrição NotI	Biolaboratórios da Nova Inglaterra (NEB)	R3189S	Uma enzima de restrição usada em aplicações de clonagem de DNA e biologia molecular, para linearização de plasmídeo H2B-RFP.
Inibidor de RNase (opcional)	Biolaboratórios da Nova Inglaterra (NEB)	M0314S	Enzima usada para prevenir a degradação do RNA durante experimentos relacionados ao RNA.
Luvas sem RNase	VWR / Fisher Scientific	Varia de acordo com o tamanho	Luvas tratadas para evitar a contaminação por RNase, utilizadas em protocolos de manipulação de RNA.
Ponteiras de pipeta sem RNase	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Ponteiras de pipeta projetadas para serem livres de contaminação por RNase para aplicações relacionadas a RNA.
Água livre de RNase	Thermo Fisher Científico	AM9932	Água purificada para remover as enzimas RNase, essencial para o trabalho do RNA para evitar a degradação.
SDS (10%)	Sigma-Aldrich	L3771	Dodecil sulfato de sódio usado para desnaturar proteínas em eletroforese e outros experimentos.
SiR-Tubulina	Espirocromo	SC002	Um corante fluorescente que se liga especificamente à tubulina para imagens de células vivas do fuso
Acetato de sódio (3 M)	Sigma-Aldrich	S7899	Usado como tampão e para precipitação de DNA em procedimentos de biologia molecular.
Espectrofotômetro	Thermo Fisher (NanoDrop)	ND-UM-W	Instrumento usado para quantificar ácidos nucléicos, proteínas e outras substâncias medindo a absorbância.
Estereomicroscópio	Leica Microsystems	M165C	Um microscópio projetado para observar espécimes em três dimensões em baixas ampliações, útil para dissecações.
Unidade de filtro de seringa (0,22-µ m)	Merck	SLGP033RS	Usado para filtração estéril de líquidos, especialmente em aplicações de microbiologia e biologia molecular.
Seringas e conjunto de agulhas	Terumo	Seringas de tuberculina SS+01T	usado para entrega precisa de PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE Kit	Thermo Fisher Científico	AM1344	Um kit para transcrição in vitro de RNA de um promotor T7 para preparação de cRNA H2B-RFP.
Banho-maria / bloco de aquecimento	Instrumentos de Subvenção	QBD4	Usado para manter temperaturas precisas em experimentos que requerem calor.