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Construção de perfis de Torque-Velocidade-Potência de Carga Constante (Isotônica) e Velocidade Constante (Isocinética) In vivo para os Flexores Plantares de Ratos

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DOI:

10.3791/68858

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3 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Neuromechanical Performance Research Lab, Department of Human Health and Nutritional Sciences, College of Biological Sciences, University of Guelph, 2Aurora Scientific Inc.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um novo protocolo para medir de forma não invasiva a relação torque-velocidade angular-potência in vivo em flexores plantares de ratos usando estimulação muscular transcutânea. Essa configuração permite testes simples de contrações musculares isotônicas em um sistema de transdutor de força/controlador de comprimento para representar melhor a natureza de carga constante dos movimentos diários.

Resumo

Compreender a relação torque-velocidade-potência do músculo é fundamental para avaliar o desempenho muscular dinâmico, o que tem implicações para a saúde e a doença. Enquanto os estudos de dinamometria em humanos usam contrações isocinéticas (velocidade constante) ou isotônicas (carga constante) para avaliar essa relação, os modelos de roedores têm se baseado quase exclusivamente em contrações isocinéticas devido à complexidade de executar experimentos de pinça de carga isotônica em sistemas disponíveis comercialmente. As contrações isotônicas se alinham melhor com as condições de carga constante dos movimentos que ocorrem fora do laboratório. Aqui, apresentamos um novo protocolo de estimulação elétrica transcutânea minimamente invasivo e um fluxo de trabalho passo a passo para avaliar a relação torque isotônico-velocidade angular-potência in vivo para os flexores plantares de ratos. Curvas isotônicas e isocinéticas de torque-velocidade angular-potência foram comparadas em 10 ratos Sprague-Dawley. As contrações isotônicas produziram uma velocidade máxima de encurtamento (Vmáx.) e potência de pico mais altas em comparação com as contrações isocinéticas que usaram torque médio. No entanto, a potência de pico isocinética correspondeu melhor à potência de pico isotônica ao medir o pico de torque a partir de contrações isocinéticas devido a uma redução na curvatura da curva de velocidade torque-angular. Além disso, o torque e a velocidade na potência de pico diferiram dependendo do tipo de protocolo usado. Todos os conjuntos de dados se encaixam fortemente na equação de Hill (R2 > 0,98), embora os dados isotônicos tenham os ajustes "mais fracos", provavelmente devido à natureza mais variável das contrações de carga constante. Com base nesses achados, recomenda-se o uso de contrações isotônicas quando possível, especialmente se o objetivo é avaliar Vmax ou potência de pico. Se os testes isocinéticos devem ser usados, um guia valioso é fornecido aqui para entender as limitações e maximizar a traduzibilidade para contrações de carga constante.

Introdução

A investigação básica de como o desempenho muscular muda com exercícios, maturação, envelhecimento ou doença geralmente inclui apenas avaliações de produção de força ou torque durante contrações isométricas (ou seja, comprimento muscular constante ou ângulo articular, respectivamente). No entanto, desde o trabalho pioneiro de A.V. Hill na década de 19301, os experimentos sobre desempenho muscular gradualmente se expandiram para incorporar condições dinâmicas, avaliando a relação entre força, velocidade e seu produto, potência 2,3,4,5,6,7,8 . À medida que a velocidade de encurtamento aumenta, a probabilidade de formar pontes cruzadas actina-miosina produtoras de força é reduzida, criando a forma hiperbólica inversa da curva força-velocidade 1,2. Assim, a potência fornece uma representação geral do desempenho dinâmico de um músculo, mostrando o trade-off entre força submáxima e velocidade submáxima para atingir a potência máxima9. Estudos em humanos, em particular, avançaram para o uso de dinamometria de corpo inteiro (por exemplo, HUMAC ou Biodex), permitindo a avaliação da relação torque-velocidade-potência usando isocinética10 (velocidade angular constante) ou isotônica 11,12,13,14,15,16 (carga constante). Desses dois tipos de movimento, as contrações isotônicas se alinham melhor com as condições de carga constante dos movimentos que ocorrem fora do laboratório, colocando o desafio de mover uma carga nos músculos envolvidos, enquanto as contrações isocinéticas são mais antinaturais, pois o braço de alavanca de transdução de força do dinamômetro só pode se mover a uma velocidade angular fixa 12,16,17, 18.

Nas últimas duas décadas, também houve avanços significativos em pequenos sistemas dinamométricos para avaliar o desempenho muscular em roedores 19,20,21,22,23,24. Modelos de roedores permitem possibilidades quase infinitas para a investigação pré-clínica de doenças que afetam adversamente os músculos, incluindo diabetes tipo 225, obesidade26, caquexia do câncer27, sarcopenia19,28, paralisia cerebral espástica29,30, distrofia muscular de Duchenne31, desminopatia32e muito mais. Medidas longitudinais repetidas do desempenho muscular usando animais vivos tornaram-se possíveis empregando-se estimulação elétrica do nervo periférico ou músculo percutâneo sob anestesia 33,34. Infelizmente, como essas contrações precisam ser evocadas eletricamente, elas têm sido mais propícias à natureza simplista e controlada das contrações isocinéticas do que isotônicas (que requerem uma abordagem mais sutil) para construir a relação torque-velocidade-potência. Além disso, o implante de manguitos de nervos periféricos ou a estimulação muscular direta por meio de um eletrodo de agulha são procedimentos invasivos, exigindo cirurgia ou inserção cuidadosa de eletrodos de demora através da pele e, portanto, o uso repetido apresenta riscos de efeitos adversos ou inconsistências que podem confundir os resultados entre sessões repetidas de testes no mesmo animal.

Aqui, é apresentada uma nova configuração para avaliar a relação torque-velocidade angular-potência in vivo em ratos usando um procedimento consistente e minimamente invasivo de estimulação muscular transcutânea (ou seja, fora da pele) em um sistema de transdutor de força/controlador de comprimento. Além disso, este estudo fornece uma comparação entre curvas de torque-velocidade-potência isotônicas e isocinéticas construídas a partir dessa técnica, com recomendações técnicas/metodológicas baseadas nas nuances de ambos os procedimentos.

Protocolo

Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Guelph (AUP # 4905) e seguiram as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

NOTA: Os materiais listados na Tabela de Materiais são necessários para a construção da configuração do suporte do eletrodo, posicionando o rato dentro do sistema de controlador de força/comprimento do transdutor de força e coletando os dados de torque, posição e velocidade angular.

1. Animais

  1. Obter 10 ratas Sprague Dawley fêmeas (idade: 11 semanas; massa corporal: 228 ± 21 g).
  2. Aloje os ratos a 23 ° C em grupos de dois ou três e dê acesso ad libitum a uma dieta global de roedores com 18% de proteína da Teklad e água em temperatura ambiente.

2. Suporte de eletrodo feito sob medida

  1. Construa o suporte de eletrodo feito sob medida para estimulação transcutânea principalmente a partir de peças de construção disponíveis comercialmente, cujas instruções de construção são apresentadas no Arquivo Suplementar 1.
  2. Projete e imprima em 3D a peça do suporte do eletrodo com o arquivo STL anexado no Arquivo Suplementar 1.
    NOTA: Esta peça porta-eletrodo contém orifícios instalados para segurar pregos de acabamento liso galvanizado de aço de 1-1/2". O posicionamento dos pregos nesses orifícios deve ser ajustado com base no tamanho/posição do rato individual que está sendo testado. Soldados a esses pregos estão fios catódicos e anódicos que se conectam a um estimulador bifásico de alta potência para fornecer estimulação transcutânea dos flexores plantares.

3. Configuração inicial de teste mecânico in vivo

  1. Ligando o sistema in vivo
    1. Ligue a bomba de calor e ajuste-a para 37 °C.
    2. Ligue o computador. Abra o software DMCv5.5.
    3. Na caixa do estimulador, aperte o botão liga/desliga grande e o botão de saída liga liga/desliga menor.
    4. Ligue o botão liga/desliga para o sistema de alavanca de modo duplo.
    5. Clique em Protocolo no software. Carregue um protocolo que forneça uma contração de 500 ms e 100 Hz (largura de pulso de 0,1 ms) em um ângulo de tornozelo de 90° (ou seja, o ângulo neutro padrão para o software).
      NOTA: As etapas de como projetar um protocolo estão além do escopo do presente estudo e podem ser acessadas nos manuais de operação de um determinado sistema.
    6. Defina a Força de Deslocamento para 350 mN×m (o torque máximo capaz de ser registrado por este sistema; é improvável que um rato exceda esse valor 28,35,36,37,38) e, em seguida, Carregue o protocolo.
    7. Mova o botão do sistema para Executar. Certifique-se de que o pedal (identificado na Figura 1) trava no lugar.
  2. Preparando o rato
    1. Anestesiar o rato com isoflurano usando procedimentos operacionais padrão na instituição de pesquisa aplicável39 (por exemplo, aqui, foram usadas diretrizes do treinamento em anestesia com roedores da Universidade de Guelph, com isoflurano definido para 4% e taxa de fluxo de oxigênio definida para 2,5 L / min para indução inicial, e isoflurano reduzido para 1,5-2% e taxa de fluxo de oxigênio para 1,5 L / min para manutenção). Posicione o rato com a boca/nariz em um cone bucal em uma plataforma aquecida (Figura 1). Monitore a respiração e a pulsação do rato para garantir uma profundidade consistente e segura da anestesia, consultando os procedimentos operacionais padrão39.
    2. Espalhe pomada para os olhos sobre os olhos para evitar que os olhos sequem.
    3. Raspe completamente o cabelo da perna esquerda usando um barbeador elétrico.
    4. Espalhe um creme depilatório disponível comercialmente em toda a perna usando um cotonete (por exemplo, cotonete). Aguarde 3 minutos e raspe o creme com quantos cotonetes forem necessários. Procure ter a perna o mais nua possível.
      NOTA: Esta etapa é necessária porque o cabelo interromperá o contato entre os eletrodos, o gel condutor e a pele ao tentar fornecer estimulação elétrica.
    5. Limpe totalmente a perna umedecendo bolas de algodão com água destilada e passando-as sobre a perna.
    6. Seque a perna com uma toalha de papel.
  3. Posicionando o rato
    1. Enrole fita cirúrgica ao redor do pé e do pedal para prendê-lo no lugar. Precisa ser o mais apertado possível. Certifique-se, especialmente, de que o calcanhar esteja fixado na ranhura na parte inferior do pedal. Use o botão de ajuste 3 (identificado na Figura 1) para mover o pedal para mais perto ou para mais longe, conforme necessário, para garantir que o joelho esteja estendido.
    2. NOTA: A verdadeira extensão total do joelho é difícil de alcançar aqui, portanto, não se preocupe se o joelho não estiver totalmente estendido.
    3. Configure o grampo, empurrando para dentro da tíbia médio-proximal para fixar a perna no lugar (consulte a Figura 1para uma representação visual). Use os botões de ajuste 1 e 2 (identificados na Figura 1) para posicionar o pedal de forma que fique alinhado com o clamp.
  4. Colocação do eletrodo
    1. Usando uma pinça, espalhe gel condutor em ambos os eletrodos, bem como na face posterior da perna do rato.
    2. Posicione os eletrodos conforme mostrado na Figura 1, certificando-se de que haja gel entre os eletrodos e a perna. O eletrodo distal vai logo distal ao gastrocnêmio, enquanto o eletrodo proximal vai na extremidade proximal do gastrocnêmio, onde encontra a articulação do joelho. Encontre esses locais palpando a 'protuberância' do gastrocnêmio na parte posterior da perna.
    3. Gire a engrenagem (rotulada na Figura 1) para colocar os eletrodos no lugar para garantir um contato consistente durante as estimulações. Não o empurre com muita força, ou ele exercerá torque passivo indesejado no pedal. É necessário que haja apenas uma ligeira curvatura no eixo (rotulado na Figura 1) que segura os eletrodos para garantir que ele permaneça no lugar durante a estimulação.
  5. Ativando o salvamento automático
    1. Retorne ao software DMCv5.5. Na parte superior, clique em Configuração e, em seguida, em Salvar pasta automaticamente.
    2. Vá para a pasta escolhida para salvar os arquivos de dados e clique em Pasta atual.
    3. Digite um nome base (por exemplo, o código de identificação do rato) na caixa Base de Salvamento Automático e clique em Ativar Salvamento Automático. Todos os arquivos de dados agora serão salvos na pasta selecionada com o nome base do salvamento automático. Não se esqueça de adicionar ao nome base dependendo do protocolo que está sendo executado (por exemplo, "C1Black-70deg" para uma contração de 100 Hz em um ângulo de tornozelo de 70°; como um nome de arquivo, isso aparecerá como "C1Black-70deg.ddf" na pasta AutoSave escolhida).

4. Otimização atual para estimulação de 100 Hz

  1. O protocolo de 100 Hz a 90° já está carregado a partir da etapa 3.1.5. Defina o estimulador para 20 mA. Este será um nível muito baixo de estimulação e permitirá que o pesquisador saiba se ele precisa fazer algum ajuste no posicionamento do eletrodo/gel (por exemplo, se o traço de torque parecer irregular ou a perna escorregar para fora da pinça) sem induzir muita fadiga muscular 28,35,36,37,38.
  2. Clique em Iniciar teste para executar o protocolo. Os músculos que se contraem devem ser visíveis. Após a execução do protocolo, clique em Análise para verificar quanto torque foi produzido, garantindo que a caixa Correção de linha de base seja clicada.
  3. Depois de permitir 2 min de descanso, aumente para 30 mA e execute o protocolo novamente. Clique em Análise para verificar quanto torque foi produzido, garantindo que a caixa Correção da linha de base seja clicada (esta caixa garante que o torque passivo seja subtraído do torque total para obter uma medição do torque ativo).
    NOTA: O uso desta ferramenta de correção de linha de base só funciona nesta configuração em um tornozelo de 90°. Em todos os outros ângulos, o método descrito na etapa 5.1 deve ser usado para calcular o torque ativo. Embora 2 minutos de descanso sejam recomendados aqui em ratos jovens saudáveis, esse tempo de descanso pode precisar ser mais longo (por exemplo, 3-5 minutos) em modelos de envelhecimento ou doença.
  4. Repita a etapa acima para 40 mA. Se o torque diminuiu em comparação com 30 mA, então 30 mA é o estímulo ideal. Se o torque de 40 mA for maior, aumente para 50 mA e estimule novamente após 2 min de repouso. Se o torque diminuiu, então 40 mA foi a corrente de estímulo ideal.
  5. Repita esse processo até que o estímulo ideal seja encontrado (ou seja, não veja mais um aumento na produção de torque após aumentar ainda mais a corrente de estimulação). Normalmente, a corrente de estímulo ideal é de 40 mA ou 50 mA.

5. Contrações isotônicas para a relação torque-velocidade-potência

  1. Crie um protocolo que induza uma contração isométrica de 500 ms e 100 Hz em um ângulo de tornozelo de 70 ° (ou seja, o ângulo mais dorsiflexionado para o qual esse sistema de alavanca irá) (arquivo de protocolo disponível no Arquivo Suplementar 2). Execute este protocolo. Registre o torque ativo máximo (ou seja, torque total menos o torque passivo basal antes da estimulação) produzido durante essa contração. Use esse valor para determinar os grampos de carga nos protocolos isotônicos.
  2. Na tela Protocolo , crie um protocolo para mover o tornozelo para uma posição dorsiflexionada e, em seguida, estimule por 500 ms antes de retornar a uma posição neutra (Figura 2; arquivo de protocolo .dpf fornecido no Arquivo Suplementar 2).
  3. Calcular as cargas isotónicas correspondentes a 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% e 80% do binário activo máximo a 70° registado no passo 5.1. Certifique-se também de adicionar o torque passivo de linha de base de volta ao grampo de carga (veja o exemplo na Figura 2). Execute esses grampos de carga em uma ordem aleatória usando as etapas descritas abaixo.
  4. No software DMCv5.5, na caixa Força de deslocamento (que atualmente está definida como 350 a partir da etapa 3.1.6), digite o valor de torque calculado (ou seja, dos valores calculados na etapa 5.3 acima) correspondente ao primeiro grampo de carga a ser executado. Agora, carregue o protocolo isotônico criado na etapa 5.2 e essa nova Força de Deslocamento será aplicada. Configurando essa força de deslocamento submáxima, o encurtamento ocorrerá quando o torque produzido pelos flexores plantares atingir esse valor, e permanecerá fixo nesse valor (Figura 2).
  5. Clique em Iniciar Teste para executar o protocolo. Ocorrerá uma contração isotônica.
  6. Repita as duas etapas acima com 2 minutos de descanso entre cada pinça de carga isotônica até que todas as oito contrações isotônicas (10–80%) tenham sido realizadas.

6. Contrações isocinéticas para a relação torque-velocidade-potência

  1. Defina a Força de Deslocamento para 350 mN×m se ainda não estiver lá.
  2. Crie oito protocolos de encurtamento isocinético correspondentes a velocidades de encurtamento de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000°/s (arquivos de protocolo disponíveis no Arquivo Suplementar 2). Nesses protocolos, primeiro mova passivamente o tornozelo para 70° (ou seja, o ângulo mais dorsiflexionado disponível neste sistema), depois defina a estimulação de 100 Hz para ocorrer no início do encurtamento e continue enquanto o tornozelo se move para 120° (ou seja, o ângulo mais flexionado plantar disponível neste sistema) (Figura 3). Após o término da estimulação, ajuste o tornozelo para retornar ao ângulo neutro padrão do sistema de 90°.
  3. Execute cada um desses testes isocinéticos em ordem aleatória, com 2 minutos de descanso entre cada teste.

7. Análise dos arquivos de teste isotônicos e isocinéticos

  1. Análise de teste isotônico
    1. Como os testes isotônicos usam uma carga constante, registre a velocidade angular durante o encurtamento. Para analisar a velocidade angular desses testes, abra o arquivo de dados. Amplie a parte do traço de posição que representa quando ocorreu o encurtamento isotônico. Clique em Análise Muscular.
    2. Para calcular a inclinação média durante o encurtamento, observe a coluna Posição e execute o cálculo: Velocidade angular média = (Posição mínima - posição máxima)/Tempo total. Observe que a "Posição mínima" representa o ângulo mais dorsiflexionado, que é a posição inicial da junta.
  2. Análise de teste isocinético
    1. Como os testes isocinéticos usam uma velocidade constante, registre o torque produzido durante o encurtamento.
      NOTA: O presente estudo apresenta dois métodos diferentes de registro de torque a partir desses protocolos: torque médio durante o encurtamento e pico de torque durante o encurtamento. As vantagens vs. desvantagens de cada um são apresentadas nos Resultados Representativos.
    2. Abra o arquivo de dados. Para registrar o torque médio, amplie o traço de torque durante a fase de encurtamento. Clique para abrir a janela Análise muscular . A partir dos valores fornecidos na coluna de torque, registre o torque médio como: Torque médio = Integração/Tempo total.
    3. Na mesma janela Análise muscular, registre o pico de torque como o valor indicado na caixa Torque máximo .

8. Curva-ajustando os dados do torque e da velocidade angular

  1. Em uma planilha, crie uma planilha separada para os dados isotônicos e isocinéticos para cada rato. Em cada planilha, organize os dados em duas colunas: força e velocidade. Inclua o torque máximo a 70° nesses dados, correspondendo a uma velocidade de 0°/s. Rotule cada folha como [Nome do rato] seguido de [ISOT] ou [ISOK], correspondendo a dados isotônicos ou isocinéticos, respectivamente (por exemplo, "C1BLACK ISOT" ou "C1BLACK AVG ISOK", onde C1BLACK é o nome do rato; veja a Figura 4 para mais exemplos).
    NOTA: Essas convenções de nomenclatura são necessárias para o código Python empregado na próxima etapa. Essas convenções de nomenclatura específicas são necessárias apenas neste arquivo de planilha.
  2. Siga o link no Arquivo Suplementar 3 para executar o Código Python personalizado, usando as instruções adicionais relacionadas ao código fornecidas no Arquivo Suplementar 3. Uma vez executado o código, aparecerá uma janela solicitando que o pesquisador selecione a planilha contendo as planilhas individuais para os dados isotônicos e isocinéticos de cada rato que foram feitos na etapa 8.1. Se organizado corretamente com base na descrição na etapa 8.1 e na Figura 4, esse código exibirá uma janela mostrando uma curva de torque-velocidade-potência ajustada para cada conjunto de dados (exemplos na Figura 4). Neste código, todos os dados são ajustados à seguinte equação1:
    figure-protocol-1
    Com Fmax sendo o torque isométrico máximo de 100 Hz a 70 °, F e V representando o torque da pinça de carga isotônica e a velocidade angular, respectivamente, e a e b representando as constantes termodinâmicas de Hill com as unidades de torque (N • m) e velocidade (° / s), respectivamente.
    NOTA: Depois que o código tiver escolhido cada conjunto de dados de força e velocidade, ele produzirá um novo arquivo Excel contendo, para cada curva ajustada, os seguintes dados: velocidade máxima de encurtamento (Vmax), Fmax, os coeficientes a e b, a curvatura da curva torque-velocidade (a / Fmax), potência de pico, o valor de torque que corresponde à potência de pico, o valor da velocidade angular que corresponde à potência de pico e o valor R2 representando o quão bem os dados coletados se ajustam à equação (Figura 4).

9. Comparação dos perfis de torque-velocidade-potência isotônicos e isocinéticos

  1. Para eliminar o risco de vieses relacionados à ordem de teste, 1) alterne entre executar os testes isotônicos primeiro e executar os testes isocinéticos primeiro; e 2) randomizar a ordem de contração dentro de cada conjunto de contrações isotônicas (grampos de carga de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80% do torque máximo) e isocinéticas (velocidades angulares de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000 ° / s). Selecione a faixa de velocidades angulares isocinéticas de acordo com estudos anteriores sobre os flexores plantares de ratos in vivo 23.
  2. Use uma ANOVA de medidas repetidas bidirecionais para avaliar semelhanças e diferenças entre as curvas de torque-velocidade-potência produzidas a partir dos três métodos empregados aqui (isotônico, isocinético com torque médio durante o encurtamento e isocinético com pico de torque durante o encurtamento) para as seguintes variáveis: Vmax, os coeficientes a e b , curvatura, potência de pico, torque na potência de pico, velocidade angular na potência de pico, e R2. Aplique uma correção de Bonferroni a todas as comparações de pares. Defina o nível alfa como α = 0,05.

Resultados

A Figura 5A mostra as relações torque-velocidade geradas a partir dos pontos de dados brutos, e a Figura 5B usa os coeficientes Fmax e a e b médios para plotar esses dados ajustados à equação1 de Hill junto com as curvas de torque-potência, nas quais o torque e a velocidade foram multiplicados para calcular a potência. Todos os métodos (isotônico, isocinético usando torque médio, isocinético usando torque de pico) mostram a forma esperada da relação torque-velocidade, com a velocidade de encurtamento angular diminuindo hiperbolicamente com o aumento do torque, e vice-versa, e com a potência de pico produzida em níveis submáximos de torque e velocidade.

A Figura 6 mostra os dados obtidos a partir do ajuste da curva dos dados de torque e velocidade angular. A curva obtida nos testes isotônicos prevê um Vmax maior do que ambas as curvas isocinéticas (P = 0,002 em comparação com ambas; Figura 6A). A curva isotônica também produziu uma potência de pico maior do que a curva isocinética usando torque médio (P = 0,006), mas essa discrepância foi superada usando o pico de torque dos testes isocinéticos, produzindo uma potência de pico que não diferiu daquela da curva isotônica (P = 1,00) (Figura 6B). Esse aumento na potência de pico usando o pico de torque na curva isocinética foi realizado matematicamente pela redução da curvatura da curva torque-velocidade em comparação com o uso do torque médio (P < 0,001) (Figura 6G), apesar de manter o mesmo Vmax (P = 1,00) (Figura 6A). Essa redução na curvatura devido ao uso do torque de pico dos testes isocinéticos também resultou em uma superestimação do torque na potência de pico em comparação com a curva isotônica (P < 0,001), enquanto a curva isocinética usando torque médio correspondeu melhor ao torque na potência de pico da curva isotônica (P = 1,00) (Figura 6C). Com isso dito, a curva isocinética usando torque médio subestimou a velocidade na potência de pico em comparação com a curva isotônica (P < 0,001) (Figura 6D). O uso do pico de torque para a curva isocinética aproximou a velocidade na potência de pico da curva isotônica, mas ainda com uma ligeira subestimação (P = 0,043) (Figura 6D). Por fim, embora todos os conjuntos de dados se ajustassem fortemente à equação de Hill (todos R2 > 0,98), a curva isotônica foi um ajuste ligeiramente mais fraco do que as outras duas (P = 0,015-0,029). Coletivamente, essas descobertas demonstram como as contrações dinâmicas de carga constante, que se assemelham melhor aos movimentos do mundo real, produzem resultados diferentes em comparação com as contrações dinâmicas de velocidade constante mais comumente usadas na avaliação da relação torque-velocidade-potência.

Todos os dados individuais estão disponíveis publicamente em: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2

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Figura 1: Representação de como o rato está configurado para testes in vivo da função mecânica dos flexores plantares. O rato é posicionado em uma plataforma aquecida sob anestesia isoflurano. O pé é preso firmemente ao pedal com o calcanhar seguro e uma braçadeira é empurrada para dentro da tíbia para fixar a perna no lugar. Os botões de ajuste 1, 2 e 3 auxiliam no posicionamento ideal da perna na posição estendida do joelho e no alinhamento anatômico com o eixo do pedal. O gel condutor é espalhado sobre os locais proximal e distal do grupo muscular flexor plantar. O suporte do eletrodo prende os eletrodos no lugar para estimulação transcutânea. A engrenagem no dispositivo de fixação de eletrodos personalizado empurrou os eletrodos contra a pele que recobre os músculos flexores plantares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Exemplo de torque bruto, posição e traços de estimulação para uma estimulação isométrica de 100 Hz em um ângulo de tornozelo de 70 °, que foi então usado para determinar o pico de torque em contrações isotônicas com cargas definidas em 10% a 80% do pico de torque. Está incluído um exemplo de cálculo e configuração da carga isotônica para uma contração isotônica de 30%. Observe que, ao definir o grampo de carga ("Força de deslocamento"), a carga calculada representa uma porcentagem do pico de torque ativo de 100 Hz (ou seja, torque total menos o torque passivo da linha de base), mas o torque passivo da linha de base é adicionado novamente porque o sistema não consegue distinguir entre torque total e torque ativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exemplo de torque bruto e traços de posição de contrações isocinéticas, a partir dos quais o torque de pico e médio foram medidos durante o encurtamento. Os testes apresentados são em velocidades de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000°/s (indicados nos painéis de rastreamento de posição). Linhas verticais tracejadas na leitura "Estimulação" indicam o início e o fim da estimulação elétrica (a estimulação real não é visível nessas fotografias das leituras de dados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Representação das etapas necessárias para ajustar a curva dos dados de torque (rotulados como "força" aqui) e velocidade. Depois de organizar cada conjunto individual de dados de torque e velocidade em sua própria folha rotulada como [Nome do rato] [ISOK ou ISOT] (ISOT = isotônico, ISOK = isocinético), o código é executado. Uma janela aparecerá solicitando que um arquivo Excel seja selecionado. Depois de selecionar o arquivo que contém todas as folhas rotuladas, cada curva aparecerá uma de cada vez, permitindo que sejam inspecionadas visualmente para garantir que não haja erros nos dados inseridos. Cada curva mostra a velocidade máxima de encurtamento (Vmáx.), o valor máximo de torque (Fmáx) que teria sido inserido a partir dos dados medidos, os coeficientes a e b da curva, a curvatura da curva torque-velocidade (a / Fmáx.), potência de pico, o valor de torque que corresponde à potência de pico ("Opt Force"), o valor da velocidade angular que corresponde à potência de pico ("Opt Vel"), e o valor R2 representando o quão bem os dados coletados se encaixam na equação. Depois de clicar em cada curva, um arquivo Excel será gerado automaticamente contendo todos os dados produzidos a partir do ajuste de curva para cada curva que acabou de ser clicada. Lembre-se de salvar este arquivo antes de fechar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Curvas de torque-angular-velocidade-potência. (A) As curvas de velocidade torque-angular construídas a partir de dados brutos para os testes isotônicos (verde), os testes isocinéticos usando torque médio durante o encurtamento (azul) e os testes isocinéticos usando o torque de pico durante o encurtamento (laranja). (B) As curvas médias geradas a partir do ajuste desses dados à equação1 de Hill, juntamente com as curvas de torque-potência criadas a partir da multiplicação de torque e velocidade angular. Os dados do painel A são apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Dados obtidos a partir do ajuste da curva dos dados de torque e velocidade angular. Comparação de (A) Vmax, (B) potência de pico, (C) torque na potência de pico, (D) velocidade na potência de pico, (E) o coeficiente a, (F) o coeficiente b, (G) curvatura e (H) R2 entre as curvas geradas a partir dos testes isotônicos (ISOT), testes isocinéticos usando torque médio (ISOK AVG) e testes isocinéticos usando torque de pico (ISOK PEAK). *Diferença significativa (P < 0,05). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Instruções de construção do suporte do eletrodo e arquivos de impressão 3D (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28574951.v1)

Arquivo suplementar 2: arquivos de protocolo .dpf para o sistema 3 em 1 da Aurora Scientific (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2)

Arquivo Suplementar 3: Código Python para dados de velocidade angular de torque de ajuste de curva (https://github.com/ahinks192/Torque-Velocity-Curve)

Discussão

O presente estudo apresenta uma nova configuração para testes in vivo da função mecânica dos flexores plantares de ratos usando estimulação elétrica transcutânea. Especificamente, o presente estudo demonstra como avaliar a relação torque-velocidade angular-potência usando contrações isotônicas, que se alinham melhor com as condições dependentes da velocidade e carga constante dos movimentos que ocorrem fora do laboratório do que as contrações isocinéticas. No entanto, como as medições de uma relação ciclo-velocidade angular-potência isocinética podem ser otimizadas para imitar os resultados das contrações isotônicas também são apresentadas. Devido à natureza repetível dessa configuração experimental, essas avaliações do desempenho dinâmico em nível articular têm o potencial de melhorar muito a compreensão de como a idade, a doença, a imobilização e várias intervenções de exercícios afetam a função contrátil muscular em modelos de roedores. De fato, essa configuração já foi usada anteriormente para comparar a função mecânica dos flexores plantares entre ratos jovens e velhos, e antes e depois das intervenções de gesso e treinamento 35,36,37,38,28.

Uma vantagem importante de empregar os protocolos isotônicos sobre os protocolos isocinéticos é que os protocolos isotônicos podem ser mais individualizados para um determinado rato. Os protocolos isotônicos começam com a determinação da capacidade máxima de produção de torque, em seguida, os grampos de carga são normalizados para esse valor específico (ou seja, a curva isotônica tem variação nos eixos de torque e velocidade na Figura 5A). Com os protocolos isocinéticos, Vmax não pode ser determinado antecipadamente, portanto, não é possível normalizar a faixa de velocidades angulares submáximas para um valor de velocidade máxima e, em vez disso, usar uma faixa padronizada de velocidades angulares (ou seja, a curva isocinética tem variação apenas no eixo de torque). Essa faixa padronizada pode se tornar um problema para ratos que intrinsecamente têm uma capacidade de produção de velocidade mais lenta (por exemplo, com envelhecimento16,40), pois os testes capturariam apenas uma faixa menor de sua curva de velocidade torque-angular, com algumas das velocidades padronizadas potencialmente caindo perto ou além de V max. As contrações isotônicas, portanto, permitem melhor confiança na captura de uma representação completa da curva de velocidade torque-angular e, portanto, na produção de energia, a qualquer momento para qualquer estado de saúde. Em outras palavras, como observado recentemente por Thompson18, os testes isocinéticos não fornecem distinção entre medições de pico de torque e potência porque as velocidades são restritas em todos os participantes, enquanto os testes isotônicos desacoplam as medições de torque e potência individualizando as cargas para a capacidade máxima de torque de um determinado participante e capturando melhor o trade-off entre torque e velocidade.

A capacidade de melhor individualização das contrações isotônicas pode explicar por que a relação torque-velocidade-potência construída a partir das contrações isotônicas produziu um Vmax mais alto do que qualquer um dos métodos isocinéticos (Figura 6A). Portanto, se o objetivo principal de um estudo é avaliar as mudanças no Vmax (por exemplo, antes em comparação com depois de uma intervenção de treinamento), as contrações isotônicas devem ser usadas porque as contrações isocinéticas podem subestimar esse valor. No entanto, se um estudo estiver interessado em elucidar as mudanças na potência de pico, os valores de potência produzidos pelas contrações isocinéticas podem ser semelhantes às contrações isotônicas, registrando o pico de torque (em oposição ao torque médio) durante o encurtamento isocinético (Figura 6B).

Medir o torque na potência de pico e a velocidade na potência de pico também pode ser valioso para avaliar se a produção de torque ou velocidade é mais confiável para o desempenho dinâmico. Por exemplo, se uma doença não apresenta alteração na potência de pico, mas um aumento no torque na potência de pico e uma diminuição na velocidade na potência de pico, essa doença afeta desproporcionalmente a velocidade e a produção de torque compensa a preservação da potência. Se tentar obter valores de torque na potência de pico e velocidade na potência de pico de contrações isocinéticas semelhantes aos valores obtidos de contrações isotônicas, ambos os métodos isocinéticos apresentados no presente estudo devem ser empregados. Para torque na potência de pico, o registro do torque médio das contrações isocinéticas corresponde ao obtido da relação torque-velocidade isotônica (Figura 6C). Por outro lado, para a velocidade na potência de pico, o registro do pico de torque das contrações isocinéticas corresponde mais ao obtido da relação torque-velocidade isotônica, porém, ainda com uma subestimação de 15% (Figura 6D). Um comentário recente18 observou que, se o objetivo é descrever de forma abrangente as capacidades funcionais de um músculo, pode ser desejável registrar testes isotônicos e isocinéticos independentemente, com testes isotônicos recomendados para avaliar o pico de potência e testes isocinéticos necessários para avaliar o pico de produção de torque durante o encurtamento muscular.

A configuração experimental apresentada no presente estudo também tem vantagens para melhorar o fluxo de trabalho do laboratório em comparação com os métodos tradicionais (por exemplo, eletrodos de demora, manguitos de nervos periféricos) de avaliação do desempenho mecânico in vivo em roedores. O suporte de eletrodo personalizado permite o ajuste rápido da altura dos eletrodos e o ajuste da distância entre os eletrodos (através dos orifícios na peça vermelha do suporte do eletrodo; Figura 1) para se adequar ao comprimento da perna de qualquer rato individual. Esses recursos também facilitam a correspondência entre a colocação/localização do eletrodo no mesmo rato entre sessões de teste separadas, o que é especialmente útil para estudos de treinamento longitudinal. De fato, uma sessão típica de treinamento de resistência (4 séries de 8 a 10 repetições) nesta configuração foi concluída a uma taxa de ~ 15 min por rato, ou 10 ratos em ~ 2,5 h com testes contínuos 35,36,37. Além disso, embora não seja o foco aqui, o presente grupo de pesquisa desenvolveu uma peça menor de suporte de eletrodo para testar a função mecânica do flexor plantar do camundongo in vivo 41.

Apesar das vantagens metodológicas dessa configuração, existem algumas limitações a serem observadas. Aqui, usamos uma amplitude de movimento do tornozelo de 70 ° a 110 ° porque esse é o limite do sistema de transdutor de força que usamos, e uma posição de perna mais estendida para otimizar a produção de torque, conforme informado por nossos experimentos anteriores 35,36,37,38,28 - no entanto, essa configuração permite a modificação dessas posições (por exemplo, posição do joelho dobrado, diferentes amplitudes de movimento do tornozelo, diferentes configurações de ativação) para atender às necessidades experimentais de um determinado pesquisador. Deve-se notar também que essa configuração não captura totalmente o comportamento dinâmico e de comprimento variável característico da função muscular in vivo durante a locomoção, pois mudanças na carga podem ocorrer durante transições entre ângulos articulares que infelizmente não podem ser implementadas nesses experimentos controlados de articulação única. Por fim, o presente protocolo utilizou a equação de Hill para ajustar os dados de torque e velocidade angular, que pressupõem uma curva hiperbólica. Embora essa forma de curva seja confiável para determinar a potência de pico (que ocorre em níveis submáximos de força e velocidade), ela pode superestimar Vmax devido à forma hiperbólica dupla frequentemente observada da relação força-velocidade 2,42. Portanto, se o objetivo de um pesquisador é avaliar principalmente Vmax usando a configuração experimental apresentada aqui, pode ser recomendado ajustar essesdados a uma curva hiperbólica dupla mais complexa 2,42.

As relações isotônicas e isocinéticas de torque-velocidade angular-potência apresentadas aqui tiveram fortes (R2 > 0,98) ajustes à equação de Hill (Figura 6H). No entanto, dadas as limitações observadas acima para relações isocinéticas torque-velocidade angular-potência, o uso de testes isotônicos é recomendado quando possível, especialmente se o objetivo é avaliar a potência de pico. Se, em vez disso, os testes isocinéticos precisarem ser usados, as descobertas deste artigo podem ser usadas como um guia para entender as limitações e maximizar a traduzibilidade para contrações de carga constante.

Divulgações

Christopher Rand e Matthew Borkowski são funcionários da Aurora Scientific, Inc.

Agradecimentos

Agradecemos à equipe de cuidados com animais de saúde humana e ciências nutricionais pela assistência no cuidado de nossos ratos. Este projeto foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), número de concessão RGPIN-2024-03782, e uma bolsa da NSERC Alliance (ALLRP 603969-25) com a Aurora Scientific inc.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-1/2" pregos de acabamento liso galvanizado em aço  The Hillman Group Canada ULC, Pickering, Ontário, Canadáhttps://shop.hillmangroup.ca/ccrz__ProductDetails?sku=461146&cclcl=en_USPara o suporte de eletrodo feito sob medida (instruções de construção fornecidas na Figura Suplementar 1)
Aparelho para RatosAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontário, Canadá)806D 
Acessório personalizado para fixação de eletrodos projetado no Tinkercad (software de código aberto) e impresso em 3DAutodesk Tinkercad www.tinkercad.comPara o suporte de eletrodo feito sob medida (instruções de construção fornecidas na Figura Suplementar 1)
Estimulador Bifásico de Alta PotênciaAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontário, Canadá)701C
Peças de LEGOBrickLink.comVeja a Figura Suplementar S1 para os códigos BrickLink.com de todos os LEGO® PartesPara o suporte de eletrodo feito sob medida (instruções de construção fornecidas na Figura Suplementar 1)
Spectra 360 Electrodo GelSpectrahttps://www.orthocanada.com/en/spectra-electrode-gel?utm_term=&utm_campaign=Canada+EN+-+Search+-+OrthoCanada&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=1971735470&hsa_cam=136169080&hsa_grp=139530010212&hsa_ad=586754644289&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-19959388920&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gad_campaignid=136169080&gbraid=0AAAAAD1V26BmzV4eR9tkH_8Truu4W7uu6&gclid=Cj0KCQjwnJfEBhCzARIsAIMtfKLpFSpoPZdXDBtyR8sRgHYCfYuELZFPs4g8U6r8t4_chBuz5KF0pBIaAoQ3EALw_wcB
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Dez fêmeas de ratos Sprague-DawleyLaboratórios Charles River (Senneville, QC, Canadá)Código de decepção: 001
Fita Cirúrgica Transpore3M (Milton, Ontário, Canadá)1527
Creme Depilante Puro VeetVeethttps://www.walmart.ca/en/ip/Veet-Pure-Hair-Removal-Cream-Legs-Body-Sensitive-Skin-400-mL/10032637
Aquecedor/Circulador de ÁguaAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontário, Canadá)827A & nbsp;

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