Artigo de método

Quantificação da captação de ácidos graxos endoteliais usando análogos de ácidos graxos fluorescentes

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 de agosto de 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalha um ensaio in vitro para medir a captação de lipídios celulares em células endoteliais após estimulação com análogos fluorescentes BODIPY-C12 e BODIPY-C16 de ácidos graxos saturados de cadeia longa e muito longa. Este método é eficiente e adaptável a outros tipos de células, oferecendo uma abordagem útil para estudar o metabolismo lipídico.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células endoteliais (CEs) desempenham um papel central na regulação do transporte de ácidos graxos (AG) da corrente sanguínea para os tecidos metabólicos, mas as ferramentas para quantificar a captação de AG da CE de maneira confiável e escalável permanecem limitadas. Aqui, apresentamos um ensaio rápido, quantitativo e econômico para medir a captação de FA em CEs usando análogos fluorescentes de FA (BODIPY-C12 e BODIPY-C16), que permitem a investigação da dinâmica de captação específica do comprimento da cadeia em um formato de placa de 96 poços. O protocolo incorpora controles positivos (3-hidroxiisobutirato, lactato) e negativos (niclosamida) e é validado em linhas CE primárias (HUVECs) e imortalizadas (EA.hy926). O ensaio detecta a captação de FA dependente do tempo e da dose, com resultados normalizados para o número de células usando coloração nuclear de Hoechst e corrigidos para o fundo usando controles apropriados. Ele pode ser adaptado a uma variedade de tipos de células, modalidades de imagem e condições experimentais, incluindo imagens de células vivas e formatos de busca de pulso. Em comparação com a coloração lipídica tradicional ou traçadores radiomarcados, esse método oferece maior segurança, velocidade e versatilidade ao capturar a captação dinâmica de FA em células vivas. Este ensaio fornece uma plataforma robusta para estudar a regulação do transporte lipídico endotelial e sua contribuição para doenças metabólicas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para que os nutrientes transportados pelo sangue, como os lipídios, entrem no tecido metabólico, como o músculo esquelético, eles devem primeiro atravessar a barreira das células endoteliais (CE) que compreende as paredes dos vasos sanguíneos capilares. Embora se acreditasse por muito tempo que os ácidos graxos (FAs) simplesmente se difundiam através dessa barreira para atingir o tecido subjacente, evidências emergentes sugerem que os CEs regulam ativamente esse processo por meio de mecanismos de transporte especializados evoluídos para mover moléculas hidrofóbicas através de mundos aquosos extracelulares e intracelulares1.

Na corrente sanguínea, os AGs existem como ácidos graxos livres ligados à albumina (AGLs) ou são empacotados em lipoproteínas ricas em triglicerídeos (TRLs), como quilomícrons e lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDLs)2. Na superfície luminal dos CEs, a lipoproteína lipase (LPL) hidrolisa os TRLs para liberar AGLs para absorção. Uma variedade de proteínas está envolvida no transporte de FA, incluindo CD36, que realiza a captação real do FA na célula; proteínas transportadoras de ácidos graxos (FATPs) e acil-CoA sintetases (ACSLs), que medeiam o transporte vetorial; proteínas de ligação gordurosa (FABPs), que atuam como chaperonas lipofílicas, e inúmeras outras, algumas ainda não descobertas e categorizadas 2,3. O tecido subjacente também usa mecanismos semelhantes para absorver a gordura transportada, embora as isoformas específicas presentes muitas vezes difiram com base no tipo de célula.

Estudos recentes mostraram que os CEs se coordenam com as células vizinhas por meio de sinalização parácrina para modular o transporte de FA para os tecidos-alvo. Por exemplo, os miócitos esqueléticos secretam uma coleção de fatores parácrinos como 3-hidroxiisobutirato (3-HIB), fator de crescimento endotelial vascular B (VEGFB) e apelina para promover o transporte de FA pelo endotélio próximo 4,5,6. Curiosamente, o sistema endócrino também pode estar envolvido, como é o caso quando a insulina estimula os adipócitos a liberar lactato, o que também estimula os CEs a absorver AGs7.

Os CEs, portanto, atuam como guardiões moduladores da gordura, sugerindo que desempenham um papel fundamental em distúrbios metabólicos lipídicos, como doenças cardiovasculares ou diabetes tipo 2. Evidências recentes mostraram que os próprios CEs acumulam gotículas lipídicas (LDs) em resposta à sobrecarga de gordura, potencialmente atuando como um tampão que regula a entrega de ácidos graxos aos tecidos subjacentes 8,9. No caso de alto consumo de gordura, como é o caso das dietas modernas, o acúmulo excessivo desses LDs pode contribuir para disfunção vascular e doenças, incluindo hipertensão10. Ao todo, uma melhor compreensão de como os CEs absorvem e transportam AFs pode nos fornecer novas alças terapêuticas para lidar com doenças transmitidas por lipídios.

Neste estudo, descrevemos um ensaio simples, rápido e econômico para medir a captação endotelial de FA usando análogos fluorescentes de FA de cadeia longa BODIPY-C12 e BODIPY-C16. Esses reagentes são bastante baratos e bastante seguros, especialmente em comparação com os AGs marcados com isótopos radioativos ou pesados, que têm sido tradicionalmente usados para medir a absorção de gordura celular11,12. É importante notar que esses reagentes são distintos do corante BODIPY "livre" não conjugado, que se acumula passivamente em regiões hidrofóbicas da célula, principalmente em LDs13. Em contraste, a conjugação de BODIPY a uma cadeia de FA alifática (por exemplo, C12 ou C16) produz uma molécula que imita estruturalmente os FAs nativos de cadeia longa. Essa modificação permite a medição específica da absorção dinâmica de ácidos graxos nas células, em vez de refletir o armazenamento de lipídios intracelulares ou a formação de gotículas.

Um dos principais pontos fortes dessa abordagem é sua flexibilidade. Os pesquisadores podem usar outros tipos de células, tempos de incubação variáveis e uma variedade de análogos de FA conjugados com BODIPY para estudar a captação dependente do comprimento da cadeia, ou mesmo lipídios naturalmente fluorescentes, como o ácido graxo cis-parinárico14. No geral, este protocolo fornecerá aos pesquisadores uma maneira fácil de testar a captação celular de FA sob várias condições e abrir caminho para responder a questões fundamentais no metabolismo lipídico, biologia endotelial e doenças metabólicas (Figura 1).

Protocolo

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Todas as células endoteliais derivadas de humanos (HUVECs) usadas neste estudo foram obtidas de fontes não identificadas disponíveis comercialmente, de acordo com as diretrizes institucionais e de fornecedores para o uso ético de materiais biológicos humanos. Execute todas as etapas em um ambiente estéril sob uma coifa de fluxo laminar. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os reagentes e equipamentos.

1. Revestimento de gelatina de placa de 96 poços

  1. Prepare uma solução de gelatina a 0,1% diluindo 25 mL de estoque de gelatina a 2% em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1x.
  2. Misture bem e esterilize com filtro usando um filtro a vácuo de 0,2 μm (ou autoclave).
  3. Adicione 100 μL por poço de gelatina a 0,1% a uma placa preta de fundo transparente de 96 poços.
  4. Incubar a 37 °C durante pelo menos 30 min ou, de preferência, durante a noite.

2. Semeadura celular

  1. Preparar uma suspensão unicelular de CEs em meio completo.
    1. Prepare o meio completo suplementando o meio basal apropriado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina (v/v para ambos).
      NOTA: O meio basal será diferente com base no tipo de célula específico; neste estudo, o meio de crescimento endotelial (EGM-2) e o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) foram usados para células HUVECs e EA.hy926, respectivamente.
  2. Pipete 100 μL da suspensão celular em cada poço com uma densidade de semeadura que permita que as células atinjam a confluência no dia seguinte.

3. Preparação e aplicação do reagente de tratamento

  1. Preparar todos os reagentes em PBS divalente (com Ca2+ e Mg2+) e pré-aquecer a 37 °C.
    1. Preparar o 3-HIB (controlo positivo) como uma solução de trabalho de 20 mM. Dissolver a solução-mãe a 1 M em água bidestilada e conservar a 4 °C.
    2. Preparar o lactato (controlo positivo) como uma solução de trabalho a 20 mM. Dissolver a solução-mãe a 1 M em água bidestilada e conservar a 4 °C.
    3. Preparar niclosamida (controlo negativo) a uma concentração final de 1 μM. Dissolver a solução-mãe a 10 mM em DMSO. Alíquota em volumes menores para evitar ciclos de congelamento e descongelamento e armazenar a -20 °C.
  2. Lave as células uma vez com PBS divalente pré-aquecido.
  3. Adicione 50 μL por alvéolo do reagente de tratamento apropriado (3-HIB, lactato ou niclosamida) e incube a 37 ° C por 30 min (para niclosamida) ou 60 min (para 3-HIB e lactato).

4. BODIPY-FA: Preparação e aplicação do complexo BSA

  1. Prepare complexos BODIPY-FA: BSA em concentrações finais de 0,5 μM, 1 μM ou 2 μM em PBS, usando uma razão molar de 2:1 FA: BSA. Para uma solução BODIPY-FA de 2 μM, incubar com BSA livre de FA de 1 μM em PBS. Para 1 μM BODIPY-FA, use 0,5 μM BSA e assim por diante. Sempre proteja os complexos da luz durante a incubação.
  2. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos antes de usar.
  3. Adicione 50 μL do complexo aos poços tratados.
    NOTA: Use apenas as 10 colunas do meio para evitar efeitos de borda. Reserve as colunas externas como controles de autofluorescência, adicionando apenas PBS a esses poços.
  4. Incubar a placa a 37 °C durante 1 min, 5 min ou 10 min.

5. Extinção de fluorescência e detecção de sinal intracelular

  1. Prepare 1 μM de BSA livre de FA em PBS como tampão de lavagem e pré-aqueça a 37 °C.
  2. Remova BODIPY-FA: BSA e lave toda a placa duas vezes com 50 μL de BSA livre de FA de 1 μM pré-aquecido em PBS. Realize cada lavagem por 1,5 min.
  3. Adicione 50 μL de azul de tripano a 0,08% para extinguir a fluorescência extracelular.
  4. Meça imediatamente a fluorescência intracelular usando um leitor de microplacas com as seguintes configurações: Excitação: 488 nm, Emissão: 515 nm, Corte: 495 nm, Modo: Leitura inferior.
    NOTA: Subtraia o fundo de autofluorescência usando poços de coluna externa contendo células que não foram tratadas com BODIPY-FA na etapa 4.

6. Coloração nuclear de Hoechst para normalização celular

  1. Remova a solução de Trypan Blue e lave suavemente com PBS.
    NOTA: As células podem ser um pouco frágeis e propensas a descamação. Tenha cuidado ao lavar.
  2. Adicionar 4 μg/ml de Hoechst em 10% de meio e incubar 30 min a 37 °C.
    NOTA: O tempo de incubação da Hoechst pode exigir otimização. Dependendo do tipo de célula, podem ser necessários 5 minutos a 60 minutos para obter uma marcação nuclear uniforme e intensidade de sinal suficiente. Não adicione Hoechst a colunas externas.
  3. Lave o prato uma vez com PBS.
  4. Adicione PBS novo e meça a fluorescência Hoechst usando as seguintes configurações: Excitação: 350 nm, Emissão: 461 nm, Corte: 455 nm, Modo: Leitura inferior.
    NOTA: Subtraia o fundo de autofluorescência de Hoechst usando poços de coluna externos.
  5. Normalize a fluorescência BODIPY-FA para o número de células dividindo os valores corrigidos por autofluorescência da etapa 5.3 pelos valores Hoechst correspondentes obtidos na etapa 6.4. Use valores corrigidos em segundo plano para os sinais BODIPY e Hoechst.
    NOTA: Os valores finais representam a captação de BODIPY-FA normalizada para o número de células, corrigida para autofluorescência nos canais BODIPY e Hoechst.

7. Análise estatística

  1. Realize a análise estatística da Figura 2 usando ANOVA bidirecional para avaliar os efeitos do tempo, concentração e sua interação. Aplique o teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas.
  2. Para a Figura 3 e a Figura 4, use o teste t bicaudal não pareado de Student ao comparar duas condições. Para experimentos envolvendo três ou mais condições, use ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett para comparações múltiplas.

Resultados

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Conforme ilustrado na Figura 1, este ensaio usa um formato de placa de 96 poços onde os ECs são semeados diretamente nos poços. Os AGs marcados com BODIPY são conjugados à albumina sérica bovina (BSA) e aplicados a poços experimentais e controle. Antes do tratamento com AF, os ECs podem ser manipulados por meio de tratamentos farmacológicos ou distúrbios genéticos, como transfecção de siRNA ou edição de genes CRISPR. Crucialmente, essas manipulações também permitem a inclusão de controles positivos e negativos apropriados para garantir a confiabilidade do ensaio.

Um claro aumento dependente da dose e do tempo no sinal intracelular de BODIPY-C12 foi observado após a incubação de BODIPY-C12 a 0,5 μM, 1 μM e 2 μM por 1 min, 5 min e 10 min em células HUVECs e EA.hy926 (Figura 2). Para levar em conta as variações potenciais no número de células por poço, os valores de BODIPY-C12 foram normalizados para coloração nuclear de Hoechst e medidos fluorescentemente. A autofluorescência de fundo foi corrigida usando poços de controle sem BODIPY e sem Hoechst.

Para validar a reprodutibilidade e o intervalo do ensaio, moduladores conhecidos do metabolismo de ácidos graxos foram testados em EA.hy926 ECs usando BODIPY-C12 (Figura 3). O tratamento de 1 h com concentrações crescentes de lactato (0 mM, 5 mM, 20 mM) ou 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) aumentou a captação de BODIPY-C12 de maneira dose-dependente, confirmando seus papéis como reguladores positivos da captação de AG. Por outro lado, foi demonstrado anteriormente que a niclosamida química pode inibir a captação de ácidos graxos por meio do desacoplamento mitocondrial15. De fato, resultados semelhantes foram reproduzidos aqui, pois 30 min de tratamento com niclosamida (1 μM) reduziram significativamente o sinal BODIPY-C12 em relação ao controle do veículo, validando sua utilidade como controle negativo. Embora esses dados sejam normalizados para Hoechst para levar em conta quaisquer diferenças no número de células, nenhum desses tratamentos alterou a viabilidade celular ou os valores de fluorescência de Hoechst.

Para avaliar a adaptabilidade do ensaio a diferentes análogos de ácidos graxos, o BODIPY-C16, que pode ser considerado um proxy para um ácido graxo de cadeia muito longa, foi administrado aos HUVECs, e sua absorção foi medida após incubações de 5 minutos (Figura 4). Observou-se que o tratamento com lactato (0 mM, 10 mM, 20 mM) aumentou o sinal BODIPY-C16 de maneira dose-dependente, enquanto a niclosamida (1 μM) reduziu o sinal, espelhando os resultados observados com BODIPY-C12.

Em suma, este ensaio permitiu uma quantificação robusta e reprodutível da captação de FA em CEs primários (HUVEC) e imortalizados (EA.hy926). Além disso, esses achados demonstram a versatilidade do ensaio em FAs de diferentes comprimentos de cadeia, além de mostrar a validade dos controles positivos e negativos.

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Figura 1: Esquema do ensaio de captação de ácidos graxos usando ácidos graxos marcados com BODIPY. As células endoteliais são semeadas em uma placa preta de 96 poços de fundo transparente e incubadas com BODIPI Após a incubação, a fluorescência extracelular é extinta com Trypan Blue e o sinal intracelular é medido usando um leitor de microplacas de fluorescência de leitura inferior. A coloração nuclear de Hoechst é aplicada após a medição de fluorescência para quantificar o número de células para normalização. O tratamento farmacológico ou as perturbações genéticas podem ser aplicados antes da incubação do BODIPY-FA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Quantificação da captação de BODIPY-C12 em células endoteliais primárias e imortalizadas. (A) Aumento dependente do tempo e da concentração na captação de BODIPY-C12 em HUVECs após incubações de 1 min, 5 min e 10 min a 0,5 μM, 1 μM e 2 μM BODIPY-C12 complexado a 0,25 μM, 0,5 μM e 1 μM de BSA livre de FA, respectivamente. (B) As células EA.hy926 exibiram captação semelhante de BODIPY-C12 dependente do tempo e da dose em condições idênticas. A intensidade média de fluorescência foi normalizada para núcleos corados por Hoechst (número de células) e controles sem BODIPY. Os dados são apresentados como média ± DP. A análise estatística foi realizada por meio de ANOVA de duas vias para avaliar os efeitos do tempo, concentração e sua interação, seguida do teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Foram observados efeitos principais significativos para o tempo (p < 0,0001), concentração (p < 0,0001) e sua interação (p = 0,0443). As comparações pareadas estatisticamente significativas identificadas pelo teste de Tukey são indicadas no gráfico de barras da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Validação do ensaio usando controles positivos e negativos em EA.hy926. (A) O tratamento com lactato de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) aumentou a captação de BODIPY-C12 de maneira dose-dependente. (B) O tratamento com 3-HIB de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) aumentou de forma semelhante a captação de FA. (C) O tratamento com niclosamida de 30 minutos (1 μM) suprimiu significativamente a captação de BODIPY-C12 em relação ao controle do veículo (DMSO). A intensidade média de fluorescência foi normalizada para núcleos corados por Hoechst (número de células) e controles sem BODIPY. Os dados são mostrados como ± média SD. 2 μM BODIPY-C12 (complexado a 1 μM de BSA livre de ácidos graxos) foi incubado por 5 min para todos os experimentos. As estatísticas para (A) e (B) foram determinadas usando ANOVA de uma via com teste de Dunnett para comparações múltiplas, e para C usando o teste T bicaudal não pareado de Student. p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Validação do ensaio usando BODIPY-C16 em HUVECs. (A) O tratamento com lactato (0 mM, 10 mM, 20 mM por 1 h) aumentou a captação de BODIPY-C16 de maneira dose-dependente. (B) O tratamento com niclosamida (1 μM por 1 h) reduziu significativamente o sinal BODIPY-C16 em comparação com o controle tratado com veículo. A intensidade média de fluorescência foi normalizada para núcleos corados por Hoechst (número de células) e controles sem BODIPY. Os dados são mostrados como ± média DP. 2 μM BODIPY-C16 (complexado a 1 μM de BSA livre de ácidos graxos) foi incubado por 5 min para todos os experimentos. As estatísticas para (A) foram determinadas usando ANOVA de uma via com teste de Dunnett para comparações múltiplas, e para B usando o teste T bicaudal não pareado de Student. *p < 0,05, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Este ensaio oferece um método rápido, quantitativo e econômico para medir a captação de FA em CEs usando um formato baseado em placa de 96 poços e análogos fluorescentes de FA de cadeia longa. Ao incorporar controles positivos e negativos e validar em ECs primários (HUVECs) e imortalizados (EA.hy926), este protocolo demonstra robustez, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade.

As análises baseadas em fluorescência têm sido fundamentais na descoberta de reguladores parácrinos do transporte lipídico endotelial, como mencionado anteriormente 4,5,7. Esses exemplos destacam como um sistema padronizado pode continuar a elucidar de forma confiável a regulação do transporte lipídico orientada por metabólitos em um ambiente in vitro controlado. O protocolo descrito aqui estabelece parâmetros-chave para medições confiáveis de captação de AG, incluindo o uso de BODIPY-C12 e BODIPY-C16 em múltiplas concentrações (0,5-2 μM) e tempos de incubação (1 min, 5 min e 10 min). Ele também detectou efetivamente aumento da captação em resposta ao 3-HIB e lactato e redução da captação após o tratamento com niclosamida, confirmando sua sensibilidade e faixa dinâmica. Embora otimizado aqui para CEs, este ensaio pode ser prontamente adaptado a outros tipos de células, como adipócitos, miotubos ou hepatócitos, com ajustes nas proporções BODIPY: BSA e condições de tratamento. Ele também pode ser modificado para imagens de células vivas usando placas compatíveis ou adaptado em um formato de busca de pulso para avaliar a retenção, o metabolismo ou o efluxo de AF intracelular.

Comparado a outras abordagens, este método oferece vantagens distintas: é escalável, quantitativo e adaptável a vários comprimentos de cadeia de FA. Além disso, é econômico, envolve apenas algumas etapas e requer instrumentos não mais complexos do que um leitor de microplacas comum, permitindo que novos usuários, incluindo estudantes, dominem rapidamente esse protocolo. Finalmente, ao contrário dos métodos baseados em microscopia qualitativa ou colorações de ponto final como Oil Red O, que refletem o conteúdo lipídico cumulativo, este protocolo captura a captação de FA em tempo real sem exigir fixação ou lise.

No entanto, várias limitações devem ser observadas. O uso de um sistema de cultura estática 2D não recapitula totalmente a complexidade fisiológica do ambiente vascular. Fatores-chave, como tensão de cisalhamento ou lipólise mediada por LPL, bem como interações endotelial-parenquimatosas, estão ausentes deste modelo simplificado. Sistemas avançados, como co-culturas 3D baseadas em microfluídica ou organoide, imitam melhor a arquitetura e a sinalização in vivo, embora exijam maior conhecimento técnico e infraestrutura16,17. Por exemplo, os biorreatores microfluídicos fornecem um ambiente no qual os CEs podem imitar a formação de microvasculaturas e interagir com outros tipos de tecidos, permitindo que os pesquisadores modelem a dinâmica parácrina em um ambiente mais fisiológico18. Além disso, trabalhos recentes mostraram que sistemas especializados podem ser desenvolvidos para realizar imagens fluorescentes ao vivo em culturas de hidrogel 3D19. Tais avanços fornecem confiança de que este ensaio poderia um dia ser adaptado a sistemas de cultura de células que são mais fisiologicamente representativos, mas a otimização precisaria ser realizada.

Em resumo, este ensaio representa uma plataforma flexível, acessível e reprodutível para investigar a captação de FA celular sob diversas condições. Embora mais adequado para estudos mecanísticos in vitro , os insights obtidos com esse sistema podem informar trabalhos futuros usando modelos fisiologicamente mais relevantes de transporte lipídico endotelial.

Divulgações

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Os autores declararam que não existe conflito de interesses.

Agradecimentos

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Tanisha Choudhury foi financiada por uma bolsa de pesquisa de graduação de verão do Escritório de Pesquisa de Graduação da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. Boa Kim foi apoiada pelo NHLBI (R56HL162660) e AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa do Corpo Docente do Union College.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-Hidroxiisobutirato (3-HIB)Cayman Chemicals26105Controle positivo, concentração final de 5 ou 20 mM
Microplaca de poliestireno preta de 96 poços, fundo transparenteSigma-AldrichCLS3603-48EAPara que as células de chapa sejam analisadas
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Ácido graxo fluorescente verde de cadeia longa
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Ácido graxo de cadeia muito longa fluorescente verde
Solução de Albumina Sérica BovinaSigma-AldrichA9205-50MLUsado para preparar o complexo Bodipy:BSA
Dimetil sulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Solvente para ações farmacêuticas
Reservatórios de Pipetagem DescartáveisVWR89094-680Contém as várias soluções a serem pipetadas nas células
Dulbecco' s Modified Eagle' s MédioCiências da Vida Corning10-013-CVMídia para células EA.hy926
Células EA.hy926ATCCCRL-2922 Linha híbrida de células endoteliais imortalizadas
BulletKit EGM-2 Meio de Crescimento de Células Endoteliais-2LonzaCC-3162Mídia para HUVECs
Soro Fetal Bovino (FBS) VWR97068-085Suplemento de 10% em EGM-2 e DMEM
Leitor de microplacas de fluorescênciaVáriosN/AQualquer leitor de microplacas capaz de medições de fluorescência
Solução gelatinosaSigma-AldrichG1393-100mlUsado para revestir placas com 0,1% de concentração de trabalho
Solução Hoechst 33342Ciências da Vida62249Coloração nuclear para normalização celular (4 & mu; M)
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)LonzaC2519ACélulas endoteliais humanas primárias
Pipeta MulticanalVWR76627-768Para pipetear em uma placa de 96 poços
Niclosamida  Millipore SigmaN3510-50GControle negativo, 1 & mu; M  Concentração final
PBS, com cálcio e magnésioFisher Scientific21031CVUsado para preparar tratamentos e como tampão de lavagem (com BSA)
PBS, sem cálcio e magnésioGenesee Scientific25-508Para diluição de gelatina, manchas Hoechst e lavagens gerais
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122suplemento de 1% em EGM-2 e DMEM
L-lactato de sódioSigma-AldrichL7022-5GControle positivo, concentração final de 5 ou 20 mM
Solução Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUsado a 0,08% para extinguir a fluorescência extracelular
Sistemas de Filtro a Vácuo, 500ml de membrana PES, 0,45 e micro; mGenClone25-227Para esterilizar a solução de gelatina

Referências

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