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Artigo de método

Uma análise R poderosa e fácil de usar de conjuntos de dados em grande escala

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⸱

DOI:

10.3791/68868

⸱

4 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

Neste artigo

Resumo

Este relatório descreve um método envolvendo um script R no software de código aberto RStudio para analisar conjuntos de dados em larga escala obtidos de experimentos de séries temporais.

Resumo

Grandes conjuntos de dados são cada vez mais comuns no campo científico. É importante desenvolver ferramentas fáceis de usar para permitir que os pesquisadores analisem esses grandes conjuntos de dados com facilidade. Aqui, apresentamos um método envolvendo um script R no software de código aberto RStudio para analisar conjuntos de dados em larga escala obtidos de experimentos de séries temporais. Esse método requer entrada mínima de um usuário, permitindo que um iniciante que não tenha conhecimento prévio de R ou experiência em programação o use. As instruções detalhadas descritas aqui e no script R devem orientar ainda mais os usuários sobre como usar o método. Os dados de entrada e os resultados de saída são armazenados na mesma pasta de um computador local, tornando possível fazer a análise em qualquer lugar e a qualquer hora. Os resultados de saída são organizados em pastas para facilitar a interpretação e podem ser convenientemente processados para gerar figuras para publicações. Este método tem sido usado com sucesso para analisar dados de relógio circadiano e dados de explosão de espécies reativas de oxigênio, ambos contendo conjuntos de dados em larga escala de experimentos de séries temporais em um formato de placa de 96 poços. Acreditamos que este método fornece uma solução fácil e poderosa para pesquisadores na análise de grandes conjuntos de dados semelhantes obtidos por meio de experimentos de séries temporais.

Introdução

Com o aumento da disponibilidade de grandes conjuntos de dados no campo científico, é importante desenvolver ferramentas fáceis de usar para permitir que os pesquisadores analisem rapidamente esses grandes conjuntos de dados com precisão e facilidade. Um tipo de grande conjunto de dados comum vem do uso do gene da luciferase como repórter, o que permitiu um exame fácil, contínuo e não invasivo da expressão gênica em células e organismos vivos. A automação no registro de luminescência transformou a medição da luminescência da luciferase e levou a uma expansão da coleta de dados, em particular, no campo do relógio circadiano 1,2. Usando microplacas de 96 poços e um leitor automático de placas com um empilhador, milhares de amostras que expressam o gene da luciferase podem ser analisadas individualmente em séries temporais, às vezes em intervalos de uma hora por dias, em um experimento. Esses experimentos de alto rendimento resultaram na produção de grandes conjuntos de dados que os experimentos tradicionais de expressão gênica usando coleta de amostras manuais, seguida de processamento de RNA, não poderiam alcançar. Analisar conjuntos de dados tão grandes em tempo hábil é importante, mas pode ser um desafio.

Embora exista uma infinidade de ferramentas para analisar dados de ritmicicidade, muitas das ferramentas analisam ensaios baseados no comportamento animal em vez da expressão do repórter de luminescência 3,4,5,6,7 (Tabela Suplementar S1). Algumas ferramentas exigem que os pesquisadores tenham habilidades anteriores de programação de computadores, como habilidades em Python ou acesso ao MATLAB. Outras ferramentas exigem a compra de software, o que pode ser caro. Algumas soluções viáveis gratuitas estão disponíveis online. Uma dessas ferramentas é o BioDare28, que oferece uma variedade de métodos diferentes para analisar dados de ritmicida. O BioDare2 é uma ferramenta on-line fácil de usar e requer conhecimento computacional mínimo. Os usuários precisam fazer upload de entrada de dados on-line e baixar a saída de dados da interface on-line para processamento posterior.

Aqui, apresentamos scripts R fáceis de usar com vários recursos para analisar conjuntos de dados em grande escala com facilidade. Usamos o software livre e de código aberto RStudio9, uma interface para R e Python, para executar os scripts. O RStudio pode ser usado em vários sistemas de computador, incluindo Windows, Mac e Linux. Neste relatório, instruções detalhadas passo a passo são fornecidas para orientar os usuários sobre como usar os scripts R, especificamente nas seções de protocolo 1 e 2. Esse método requer uma entrada mínima do usuário. Um iniciante que não tenha conhecimento prévio de R e que não tenha experiência em programação deve ser capaz de usar o método para analisar grandes conjuntos de dados de ensaios de luciferase ou outros tipos de conjuntos de dados com dados de séries temporais. Todos os dados de entrada e saída são armazenados em um computador local e, portanto, uma análise pode ser feita em qualquer lugar sem a restrição de acesso à Internet, uma vez que todos os pacotes R relevantes são baixados pela primeira vez. Os dados de saída são classificados em pastas bem organizadas com resultados prontos para serem processados para publicações. As análises estatísticas também são incluídas como parte do resultado para fornecer uma avaliação rápida das diferenças entre as amostras. Assim, o método R pode fornecer uma solução fácil e poderosa para pesquisadores na análise de grandes conjuntos de dados.

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Protocolo

1. Análise do relógio circadiano baseada em luciferase

  1. Configuração experimental para o ensaio de luciferase
    NOTA: O ensaio de luciferase é um método comum usado para medir a atividade do relógio circadiano em tempo real. A luminescência, emitida pelo repórter de luciferase transportada por organismos e/ou células transgênicas vivas, pode ser registrada automaticamente, levando à produção de conjuntos de dados de séries temporais em larga escala. Nosso laboratório usa principalmente mudas de Arabidopsis thaliana que expressam o gene da luciferase como repórter. A Figura 1 e a Figura 2 mostram um fluxograma da configuração experimental típica para o ensaio de luciferase com mudas em um formato de 96 poços em nosso laboratório, modificado com base em uma descrição anterior2.
    1. Esterilize as sementes com vapor de água sanitária gerado pela adição de 3 mL de HCl a 36% (p/p) de HCl a 100 mL de água sanitária em um béquer por 3 h. Coloque o copo em uma campânula com tampa selada, colocada em uma capela de exaustão química. Após a esterilização, plaquear as sementes em placas 1/2MS contendo 0,5% de sacarose e 0,8% de ágar (pH 5,7), utilizando uma pipeta Pasteur de vidro estéril, em um gabinete de fluxo laminar. Colete os resíduos químicos em um frasco com tampa e descarte-os trabalhando com o departamento de serviços de saúde ambiental da instituição.
    2. Colocar as placas a 4 °C durante 2 dias antes de as transportar para uma câmara de cultura de tecidos com um ciclo de 12 h de luz e 12 h de luz escura (LD).
    3. Deixe as mudas crescerem por 4 d em LD.
    4. Transfira as mudas para uma placa de 96 poços; cada poço contendo 180 μL de meio de ensaio (1/2MS, 0,5% de sacarose, 0,4% de ágar, 0,25 mM de luciferina). Coloque as placas por 1 dia em LD seguido de 1 dia em 24 h de luz constante (LL).
    5. Adicione tratamentos ou solução simulada aos poços e registre a luminescência em intervalos de 1 h por 5-7 dias em LL. Defina a lente do filtro de emissão em 3.600 para ganho e o tempo do intervalo de medição em 1 s.
      NOTA: A hora de início da gravação pode ser a qualquer momento. No entanto, como o script R usa apenas números inteiros (números inteiros), os intervalos de gravação devem ser um número inteiro. Por exemplo, um intervalo de 1 h é permitido, mas um intervalo de 15 minutos não é permitido para o script R.
    6. No final da gravação, tire uma foto da placa para registrar o crescimento das mudas.
    7. Salve dados brutos como um arquivo CSV para análise R, usando a função salvar como com o software de análise de dados para o leitor de placas.
  2. Explicação passo a passo da análise R de dados circadianos baseados em luciferase
    NOTA: Esta análise R usa o script RArquivo Suplementar 1(LUC_2025.R), desenvolvido para análise de dados circadianos, e o arquivo de entradaArquivo suplementar 2(NO7.csv). O script R junto com o arquivo de entrada está disponível publicamente por meio da plataforma de repositório online Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
    1. Baixe o software RStudio compatível com o sistema de computador 9,10.
    2. Baixe os pacotes algorítmicos RStudio exigidos pelo Supplemental File 1 (LUC_2025.R): MetaCycle11: algoritmo ARSER12 do pacote MetaCycle, ggplot213, dplyr14, magrittr15, stringr16, filesstrings17, circular18, AICcmodavg19 e broom20.
      OBSERVAÇÃO: consulte também a parte superior do script R para obter a lista de pacotes.
    3. Alterar Entrada do Usuário I (de acordo com um conjunto de dados específico em um computador local, incluindo o diretório de trabalho, o nome do arquivo de entrada, rótulos para os tratamentos e a hora de início relativa do ensaio.
      NOTA: As etapas 1.2.1 e 1.2.2 só precisam ser concluídas uma vez; após o qual o console da interface RStudio está pronto para receber a entrada do usuário, com modificações para cada nova análise. Há duas partes na seção Entrada do Usuário (Figura Suplementar S1).
      1. Selecione o diretório de trabalho. Indique onde reside o arquivo de entrada. A mesma pasta será o local para os arquivos de saída.
      2. Selecione o arquivo de entrada, um arquivo CSV formatado corretamente para o script R (Figura 2B). Especificamente, a linha superior tem a série temporal e a primeira coluna contém posições de amostra individuais em uma placa de 96 poços.
        NOTA: Um exemplo desse arquivo CSV de entrada pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2 (NO7.csv).
      3. Nomeie as amostras e/ou tratamentos. Como essa análise é usada para dados obtidos de configurações de 96 poços com um curso de tempo, projete os experimentos como 8 repetições por tratamento para um total de até 12 tratamentos por placa, ou como 12 repetições por tratamento para um total de até 8 tratamentos por placa. Certifique-se de inserir o número correto de amostras, 8 ou 12, porque o número da amostra conta; Se a contagem de amostra não for 8 ou 12, o código não será executado. No entanto, se houver linhas de poços vazios, basta listá-los como tal no espaço para nomes de tratamento, por exemplo, nomeando como vazio 1, vazio 2 ...
        NOTA: Para nomes de amostra, deve-se evitar o uso de barras invertidas ou símbolos semelhantes, pois podem causar problemas de nome de arquivo. Além disso, deve-se também evitar o uso de "NA" como rótulo ao selecionar o uso de ANOVA na entrada do usuário II. Quaisquer tratamentos com exatamente o mesmo nome serão combinados em um grande grupo de tratamento.
      4. Indique a hora de início relativa do ensaio. Para um determinado dia de 24 horas, o amanhecer subjetivo é quando a luz da câmara é acesa durante um ciclo normal de luz / escuridão. Por exemplo, se a luz estiver acesa às 7h, considere esse horário o horário circadiano 0. Se um ensaio de luciferase começar às 9h, o tempo de ensaio é no horário circadiano 2; insira 2 como a hora de início relativa.
        NOTA: A hora de início relativa deve ser um número inteiro e não pode ser negativa. Isso afetará a leitura de fase das amostras.
    4. Altere as opções de Entrada do Usuário II de acordo com necessidades específicas.
      NOTA: As instruções abaixo fornecem uma explicação mais detalhada das seções de entrada do usuário e um guia passo a passo para fazer as alterações.
      1. Incluir gráficos: curvas de luminescência, gráficos para o período, fase e amplitude por genótipo e tratamento.
      2. Use o teste ANOVA com o Tukey HSD para comparar os tratamentos em seu período, fase e amplitude. Escolha um controle para a saída do teste ANOVA; especifique o controle para o teste ANOVA ou deixe a opção vazia para usar cada tratamento como um controle na comparação de pares. Como alternativa, escolha se deseja numerar os arquivos de saída ANOVA para referência e organização mais rápidas.
      3. Use um teste t para comparar os tratamentos em seu período, fase e amplitude. Escolha se o teste t deve ser uma comparação de pares; Se um teste t em pares for selecionado, selecione se os dados estão emparelhados. Escolha um controle para o teste t; Especifique o controle para o teste t ou deixe a opção vazia para usar cada tratamento como controle. Escolha se deseja numerar os arquivos de saída do teste t para referência e organização mais rápidas.
        NOTA: Isso só deve ser usado para comparar dois tratamentos ao mesmo tempo, como duas linhagens do mesmo genótipo com SA ou Mock adicionado. Os valores de p mostrados não são ajustados para levar em conta comparações múltiplas com a mesma linha.
      4. Escolha se deseja arredondar os pontos de tempo. Se os pontos de tempo estiverem errados em apenas um ou dois minutos, arredonde para a hora mais próxima e use esta análise.
        NOTA: Este código calcula o período, a fase e a amplitude usando o método ARS12. Esse método requer uma série temporal consistente em horas para ser executado.
      5. Dependendo de como o leitor de placas registra os poços, altere a forma como a entrada é lida. Escolha a lista de dados padrão de poços por A1, A2, A3... ou aquele para poços listados por A1, B1, C1...
    5. Execute a análise simplesmente clicando no botão Origem no canto superior direito do console.
      NOTA: A análise leva menos de 1 min para ser concluída. A saída da análise R aparecerá automaticamente na mesma pasta de arquivos que o conjunto de dados de entrada.
    6. Exibir saída: A pasta de saída possui vários documentos e subpastas para fornecer uma análise abrangente, incluindo informações estatísticas do período, fase e amplitude médios para réplicas de cada genótipo e/ou tratamento.
      NOTA: Para o arquivo de entrada Supplemental File 2 (NO7.csv), uma lista dos documentos de saída gerados pelo script do Supplemental File 1 (LUC_2025.R) na seção de protocolo 1 é descrita na Tabela 1 e pode ser convenientemente visualizada com a estrutura de árvore na Figura Suplementar S2.

2. Ensaio ROS baseado em luminol

  1. Configuração experimental para ensaio ROS
    1. Corte discos foliares de 4 mm de diâmetro da quarta à sétima folhas de plantas de 25 dias com um perfurador de biópsia.
    2. Flutue os discos das folhas com o lado peludo para cima sobre 100 μL de água estéril em uma placa de 96 poços.
    3. Cubra o prato com papel alumínio limpo e coloque-o em uma câmara de crescimento LD durante a noite.
    4. Substitua a água por 100 μL de solução de luminol (300 μM em tampão MOPS 10 mM com pH 7,4 e 1 μM flg22 ou outro elicitor). Use a solução simulada no lugar de flg22 como controle.
    5. Comece imediatamente a registrar leituras de luminescência a cada minuto por 40-60 min.
  2. Explicação passo a passo da análise R dos dados ROS
    OBSERVAÇÃO: essa análise do R usa o Rstudio, o script R,  o Arquivo Suplementar 3 (ROS_2025.R) e os arquivos de entrada Arquivo Suplementar 4 (ROS_flg22.csv) ou Arquivo Suplementar 5 (ROS_elf26.csv). O script R junto com o arquivo de entrada Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) está disponível publicamente por meio da plataforma de repositório online Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
    1. Baixe os pacotes RStudio: gplot213, dplyr14, magrittr15, stringr16 e filesstrings17.
      NOTA: As etapas 2.2.1 só precisam ser concluídas uma vez. Para ajudar os usuários a adaptar cada análise a um conjunto específico de dados no computador, uma seção chamada "Entrada do usuário" foi criada para permitir que os usuários indiquem parâmetros específicos para seus experimentos (Figura S3 suplementar).
    2. Altere a Entrada do Usuário I de acordo com um conjunto de dados específico em um computador local, incluindo o diretório de trabalho, o nome do arquivo de entrada, rótulos para os tratamentos e a hora de início relativa do ensaio.
      1. Selecione o diretório de trabalho. Indique onde reside o arquivo de entrada. A mesma pasta será o local para os arquivos de saída.
      2. Selecione o arquivo de entrada, um arquivo CSV formatado corretamente para o script R (Figura 2B). Especificamente, a linha superior tem a série temporal e a primeira coluna contém posições de amostra individuais em uma placa de 96 poços.
        NOTA: Um exemplo desse arquivo CSV de entrada pode ser encontrado no material suplementar, Arquivo Suplementar 4 (ROS_flg22.csv) ou Arquivo Suplementar 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Nomeie as amostras e/ou tratamentos. Como essa análise é usada para dados obtidos de configurações de 96 poços com um curso de tempo, projete os experimentos como 8 repetições por tratamento para um total de até 12 tratamentos por placa, ou como 12 repetições por tratamento para um total de até 8 tratamentos por placa. Se houver linhas de poços vazios, basta listá-los como tal no espaço para nomes de tratamento, por exemplo, nomeando como vazio 1, vazio 2 ...
        NOTA: É importante inserir o número correto de amostras, 8 ou 12, porque o número da amostra conta. Se a contagem de amostra não for 8 ou 12, o código não será executado. Para nomes de exemplo, evite usar barras invertidas ou símbolos semelhantes, pois eles podem causar problemas de nome de arquivo. Evite também usar "NA" como um rótulo ao selecionar o uso de ANOVA na Entrada do Usuário II. Ao contrário do script do Arquivo Suplementar 1 (LUC_2025.R), os tratamentos com o mesmo nome não são combinados em um único grupo neste script do Arquivo Complementar 3 (ROS_2025.R).
    3. Altere as opções de Entrada do Usuário II de acordo com as necessidades específicas do usuário.
      NOTA: Exemplo de entrada do usuário pode ser visto na Figura Suplementar S3.
      1. Use o teste ANOVA com o Tukey HSD para comparar as somas de luminescência do tratamento.
      2. Use um teste t bilateral para comparar os dados de apenas dois tratamentos ao mesmo tempo.
        NOTA: Os valores de p mostrados não são ajustados para levar em conta várias comparações com a mesma linha.
      3. Faça um gráfico das curvas de fluorescência e um gráfico de barras comparando a soma total da fluorescência. Adicione desvio padrão ou erro padrão da média aos gráficos.
      4. Dependendo de como o leitor de placas registra os poços, altere a forma como a entrada é lida. Use a lista de dados padrão de poços por A1, A2, A3 ... ou aquele para poços listados por A1, B1, C1...
  3. Execute a análise simplesmente clicando no botão Source no canto superior direito do console.
    NOTA: A análise leva menos de 1 min para ser concluída. A saída da análise R aparecerá automaticamente na mesma pasta de arquivos que o conjunto de dados de entrada.
  4. Exibir saída: A pasta de saída possui vários documentos e subpastas para fornecer uma análise abrangente.
    NOTA: Para o arquivo de entrada Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv), uma estrutura de árvore dos documentos de saída gerados pelo script do Supplemental File 3 (ROS_2025.R) descrito na seção 2 do protocolo é mostrada na Figura Suplementar S4.

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Resultados

Estudo de caso 1. Ensaio de luminescência para atividade do relógio circadiano com mudas de Arabidopsis

Mostramos anteriormente que o gene da PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO RNA 7 rico em glicina (GRP7) foi controlado pela proteína do relógio mestre CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) e a expressão circadiana de GRP7 é importante por seu papel na defesa da planta, usando plantas transgênicas Col-0 expressando o repórter de lu...

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Discussão

Apresentamos aqui o uso de scripts R no RStudio para fornecer um método amigável para analisar dados em larga escala obtidos de experimentos de séries temporais no formato de 96 poços. Este método nos permitiu analisar de forma rápida e fácil os dados de registro de luminescência obtidos de milhares de amostras em experimentos de séries temporais para medir a atividade do relógio circadiano de mudas de plantas a culturas de células de mamíferos, além de dados de ensaios de ROS.

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório Lu por sua assistência neste trabalho. Agradecemos a Min Gao e Matthew Fabian pelo uso de seus dados não processados e a Benjamin Harris pela assistência e/ou orientação na criação deste script R. Agradecemos a John B. Hogenesch, do Cincinnati Children's Hospital Medical Center, por fornecer dados de luminescência de células de mamíferos para o estudo de caso 2. Agradecemos ainda a John B. Hogenesch, Andrew Millar, da Universidade de Edimburgo, e Mary Harrington, do Smith College, pelas discussões úteis durante o desenvolvimento deste método. Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações da National Science Foundation, NSF 1456140 e NSF 2223886, para Hua Lu.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RO Projeto Rhttps://www.r-project.org/  Uma plataforma gratuita e de código aberto que pode ser baixada online e usada para programar, especialmente para estatísticas.
RstudioPosit Softwarehttps://posit.co/download/rstudio-desktop/  Um software gratuito que pode ser baixado online para um acesso mais fácil ao R.
MetaCycleGang Wu, Xavier Li, Matthew Carlucci, Ron Anafi, Michael Hughes, Karl Kornacker e John Hogeneschhttps://cran.r-project.org/web/packages/MetaCycle/vignettes/implementation.html  O algoritmo ARSER do pacote MetaCycle é usado para avaliar parâmetros de clock, período, fase e amplitude. 
ggplot2Posit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html  Cria visualizações de dados, especialmente para gráficos estatísticos.
dplyrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html  Uma biblioteca fundamental de R para manipulação eficiente de dados.
magrittrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/magrittr/index.html  Fornece um conjunto de operadores para melhorar a legibilidade do código e facilitar um fluxo mais natural das operações de dados.
stringrPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/stringr/index.html  Fornece um conjunto consistente, simples e fácil de usar de funções para trabalhar com cadeias de caracteres.
filestringsRory Nolan e Sergi Padilla-Parrahttps://cran.r-project.org/web/packages/filesstrings/index.html  Oferece funções convenientes para manipular arquivos e strings, especialmente aqueles relacionados a nomes e caminhos de arquivos.
circularUlric Lund, Claudio Agostinelli, Hiroyoshi Arai, Alessando Gagliardi, Eduardo Garcí a-Portugué s, Dimitri Giunchi, Jean-Olivier Irisson, Matthew Pocernich e Federico Rotolohttps://cran.r-project.org/web/packages/circular/index.html  Fornece análise estatística e representação gráfica de dados circulares.
AICcmodavgMarc J. Mazerollehttps://cran.r-project.org/web/packages/AICcmodavg/index.html  Cria tabelas de seleção de modelos baseadas no critério de informação (AIC) de Akaike e informações relacionadas.
vassouraPosit Softwarehttps://cran.r-project.org/web/packages/broom/index.html  Converte a saída de vários modelos estatísticos e objetos em tibbles "limpos" (um formato moderno de data frame), facilitando o trabalho, análise e visualização dos resultados dos modelos.
Máquina de autoclaveSteris Amsco Eagle Century SG120 Scientific, Inc.8901400012Mídia autoclave
Exaustor químicoDesign de Laboratório & Suprimento & nbsp;esterilizar sementes
Leitor de Luminescência Ômega BMG LABTECH, Inc.Leitor de placas
Gabinete de fluxo laminarNuAire Nu-408FM-400Classe II/Tipo A transferir mudas para placas de 96 poços
Microplacas de 96 poçosPerkin-ElmerOptiPlate-96 Cultive mudas para ensaio de luciferase
FLG22GenScript Inc.RP19986Um elicitor da flagelina bacteriana.
Elf26Alpha Diagnostic Intl. Inc.2427Um elicitor da tradução bacteriana Fator de Elongação - Tu.
D-Luciferina Firefly, sal de potássioQuímica Biossíntese & BiologiaL-8220Substrato de luciferase
L-012 (Luminol)Fisher ScientificNC0733364Reagente de ensaio ROS

Referências

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  9. RStudio: Integrated Development for R. , Boston, MA. (2020).
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  12. Yang, R., Su, Z. Analyzing circadian expression data by harmonic regression based on autoregressive spectral estimation. Bioinformatics. 26 (12), i168-i174 (2010).
  13. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  14. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. v.1.0.2, (2020).
  15. magrittr: A Forward-Pipe Operator for R. v.2.0.3, (2022).
  16. stringr: Simple, Consistent Wrappers for Common String Operations. v.1.4.0, (2019).
  17. filesstrings: An R Package for File and String Manipulation. J Open Source Softw. , (2017).
  18. R package 'circular': Circular Statistics. v.0.4-95, (2022).
  19. Mazerolle, M. J. AICcmodavg: Model Selection and Multimodel Inference Based on (Q)AIC(c). , (2023).
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Reimpressões e permissões

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