Uma análise R poderosa e fácil de usar de conjuntos de dados em grande escala

Com o aumento da disponibilidade de grandes conjuntos de dados no campo científico, é importante desenvolver ferramentas fáceis de usar para permitir que os pesquisadores analisem rapidamente esses grandes conjuntos de dados com precisão e facilidade. Um tipo de grande conjunto de dados comum vem do uso do gene da luciferase como repórter, o que permitiu um exame fácil, contínuo e não invasivo da expressão gênica em células e organismos vivos. A automação no registro de luminescência transformou a medição da luminescência da luciferase e levou a uma expansão da coleta de dados, em particular, no campo do relógio circadiano ^1,2. Usando microplacas de 96 poços e um leitor automático de placas com um empilhador, milhares de amostras que expressam o gene da luciferase podem ser analisadas individualmente em séries temporais, às vezes em intervalos de uma hora por dias, em um experimento. Esses experimentos de alto rendimento resultaram na produção de grandes conjuntos de dados que os experimentos tradicionais de expressão gênica usando coleta de amostras manuais, seguida de processamento de RNA, não poderiam alcançar. Analisar conjuntos de dados tão grandes em tempo hábil é importante, mas pode ser um desafio.

Embora exista uma infinidade de ferramentas para analisar dados de ritmicicidade, muitas das ferramentas analisam ensaios baseados no comportamento animal em vez da expressão do repórter de luminescência 3,4,5,6,7 (Tabela Suplementar S1). Algumas ferramentas exigem que os pesquisadores tenham habilidades anteriores de programação de computadores, como habilidades em Python ou acesso ao MATLAB. Outras ferramentas exigem a compra de software, o que pode ser caro. Algumas soluções viáveis gratuitas estão disponíveis online. Uma dessas ferramentas é o BioDare2⁸, que oferece uma variedade de métodos diferentes para analisar dados de ritmicida. O BioDare2 é uma ferramenta on-line fácil de usar e requer conhecimento computacional mínimo. Os usuários precisam fazer upload de entrada de dados on-line e baixar a saída de dados da interface on-line para processamento posterior.

Aqui, apresentamos scripts R fáceis de usar com vários recursos para analisar conjuntos de dados em grande escala com facilidade. Usamos o software livre e de código aberto RStudio⁹, uma interface para R e Python, para executar os scripts. O RStudio pode ser usado em vários sistemas de computador, incluindo Windows, Mac e Linux. Neste relatório, instruções detalhadas passo a passo são fornecidas para orientar os usuários sobre como usar os scripts R, especificamente nas seções de protocolo 1 e 2. Esse método requer uma entrada mínima do usuário. Um iniciante que não tenha conhecimento prévio de R e que não tenha experiência em programação deve ser capaz de usar o método para analisar grandes conjuntos de dados de ensaios de luciferase ou outros tipos de conjuntos de dados com dados de séries temporais. Todos os dados de entrada e saída são armazenados em um computador local e, portanto, uma análise pode ser feita em qualquer lugar sem a restrição de acesso à Internet, uma vez que todos os pacotes R relevantes são baixados pela primeira vez. Os dados de saída são classificados em pastas bem organizadas com resultados prontos para serem processados para publicações. As análises estatísticas também são incluídas como parte do resultado para fornecer uma avaliação rápida das diferenças entre as amostras. Assim, o método R pode fornecer uma solução fácil e poderosa para pesquisadores na análise de grandes conjuntos de dados.

1. Análise do relógio circadiano baseada em luciferase

1. Configuração experimental para o ensaio de luciferase
   NOTA: O ensaio de luciferase é um método comum usado para medir a atividade do relógio circadiano em tempo real. A luminescência, emitida pelo repórter de luciferase transportada por organismos e/ou células transgênicas vivas, pode ser registrada automaticamente, levando à produção de conjuntos de dados de séries temporais em larga escala. Nosso laboratório usa principalmente mudas de Arabidopsis thaliana que expressam o gene da luciferase como repórter. A Figura 1 e a Figura 2 mostram um fluxograma da configuração experimental típica para o ensaio de luciferase com mudas em um formato de 96 poços em nosso laboratório, modificado com base em uma descrição anterior².
   1. Esterilize as sementes com vapor de água sanitária gerado pela adição de 3 mL de HCl a 36% (p/p) de HCl a 100 mL de água sanitária em um béquer por 3 h. Coloque o copo em uma campânula com tampa selada, colocada em uma capela de exaustão química. Após a esterilização, plaquear as sementes em placas 1/2MS contendo 0,5% de sacarose e 0,8% de ágar (pH 5,7), utilizando uma pipeta Pasteur de vidro estéril, em um gabinete de fluxo laminar. Colete os resíduos químicos em um frasco com tampa e descarte-os trabalhando com o departamento de serviços de saúde ambiental da instituição.
   2. Colocar as placas a 4 °C durante 2 dias antes de as transportar para uma câmara de cultura de tecidos com um ciclo de 12 h de luz e 12 h de luz escura (LD).
   3. Deixe as mudas crescerem por 4 d em LD.
   4. Transfira as mudas para uma placa de 96 poços; cada poço contendo 180 μL de meio de ensaio (1/2MS, 0,5% de sacarose, 0,4% de ágar, 0,25 mM de luciferina). Coloque as placas por 1 dia em LD seguido de 1 dia em 24 h de luz constante (LL).
   5. Adicione tratamentos ou solução simulada aos poços e registre a luminescência em intervalos de 1 h por 5-7 dias em LL. Defina a lente do filtro de emissão em 3.600 para ganho e o tempo do intervalo de medição em 1 s.
      NOTA: A hora de início da gravação pode ser a qualquer momento. No entanto, como o script R usa apenas números inteiros (números inteiros), os intervalos de gravação devem ser um número inteiro. Por exemplo, um intervalo de 1 h é permitido, mas um intervalo de 15 minutos não é permitido para o script R.
   6. No final da gravação, tire uma foto da placa para registrar o crescimento das mudas.
   7. Salve dados brutos como um arquivo CSV para análise R, usando a função salvar como com o software de análise de dados para o leitor de placas.
2. Explicação passo a passo da análise R de dados circadianos baseados em luciferase
   NOTA: Esta análise R usa o script RArquivo Suplementar 1(LUC_2025.R), desenvolvido para análise de dados circadianos, e o arquivo de entradaArquivo suplementar 2(NO7.csv). O script R junto com o arquivo de entrada está disponível publicamente por meio da plataforma de repositório online Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Baixe o software RStudio compatível com o sistema de computador ^9,10.
   2. Baixe os pacotes algorítmicos RStudio exigidos pelo Supplemental File 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: algoritmo ARSER¹² do pacote MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ e broom²⁰.
      OBSERVAÇÃO: consulte também a parte superior do script R para obter a lista de pacotes.
   3. Alterar Entrada do Usuário I (de acordo com um conjunto de dados específico em um computador local, incluindo o diretório de trabalho, o nome do arquivo de entrada, rótulos para os tratamentos e a hora de início relativa do ensaio.
      NOTA: As etapas 1.2.1 e 1.2.2 só precisam ser concluídas uma vez; após o qual o console da interface RStudio está pronto para receber a entrada do usuário, com modificações para cada nova análise. Há duas partes na seção Entrada do Usuário (Figura Suplementar S1).
      1. Selecione o diretório de trabalho. Indique onde reside o arquivo de entrada. A mesma pasta será o local para os arquivos de saída.
      2. Selecione o arquivo de entrada, um arquivo CSV formatado corretamente para o script R (Figura 2B). Especificamente, a linha superior tem a série temporal e a primeira coluna contém posições de amostra individuais em uma placa de 96 poços.
         NOTA: Um exemplo desse arquivo CSV de entrada pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2 (NO7.csv).
      3. Nomeie as amostras e/ou tratamentos. Como essa análise é usada para dados obtidos de configurações de 96 poços com um curso de tempo, projete os experimentos como 8 repetições por tratamento para um total de até 12 tratamentos por placa, ou como 12 repetições por tratamento para um total de até 8 tratamentos por placa. Certifique-se de inserir o número correto de amostras, 8 ou 12, porque o número da amostra conta; Se a contagem de amostra não for 8 ou 12, o código não será executado. No entanto, se houver linhas de poços vazios, basta listá-los como tal no espaço para nomes de tratamento, por exemplo, nomeando como vazio 1, vazio 2 ...
         NOTA: Para nomes de amostra, deve-se evitar o uso de barras invertidas ou símbolos semelhantes, pois podem causar problemas de nome de arquivo. Além disso, deve-se também evitar o uso de "NA" como rótulo ao selecionar o uso de ANOVA na entrada do usuário II. Quaisquer tratamentos com exatamente o mesmo nome serão combinados em um grande grupo de tratamento.
      4. Indique a hora de início relativa do ensaio. Para um determinado dia de 24 horas, o amanhecer subjetivo é quando a luz da câmara é acesa durante um ciclo normal de luz / escuridão. Por exemplo, se a luz estiver acesa às 7h, considere esse horário o horário circadiano 0. Se um ensaio de luciferase começar às 9h, o tempo de ensaio é no horário circadiano 2; insira 2 como a hora de início relativa.
         NOTA: A hora de início relativa deve ser um número inteiro e não pode ser negativa. Isso afetará a leitura de fase das amostras.
   4. Altere as opções de Entrada do Usuário II de acordo com necessidades específicas.
      NOTA: As instruções abaixo fornecem uma explicação mais detalhada das seções de entrada do usuário e um guia passo a passo para fazer as alterações.
      1. Incluir gráficos: curvas de luminescência, gráficos para o período, fase e amplitude por genótipo e tratamento.
      2. Use o teste ANOVA com o Tukey HSD para comparar os tratamentos em seu período, fase e amplitude. Escolha um controle para a saída do teste ANOVA; especifique o controle para o teste ANOVA ou deixe a opção vazia para usar cada tratamento como um controle na comparação de pares. Como alternativa, escolha se deseja numerar os arquivos de saída ANOVA para referência e organização mais rápidas.
      3. Use um teste t para comparar os tratamentos em seu período, fase e amplitude. Escolha se o teste t deve ser uma comparação de pares; Se um teste t em pares for selecionado, selecione se os dados estão emparelhados. Escolha um controle para o teste t; Especifique o controle para o teste t ou deixe a opção vazia para usar cada tratamento como controle. Escolha se deseja numerar os arquivos de saída do teste t para referência e organização mais rápidas.
         NOTA: Isso só deve ser usado para comparar dois tratamentos ao mesmo tempo, como duas linhagens do mesmo genótipo com SA ou Mock adicionado. Os valores de p mostrados não são ajustados para levar em conta comparações múltiplas com a mesma linha.
      4. Escolha se deseja arredondar os pontos de tempo. Se os pontos de tempo estiverem errados em apenas um ou dois minutos, arredonde para a hora mais próxima e use esta análise.
         NOTA: Este código calcula o período, a fase e a amplitude usando o método ARS¹². Esse método requer uma série temporal consistente em horas para ser executado.
      5. Dependendo de como o leitor de placas registra os poços, altere a forma como a entrada é lida. Escolha a lista de dados padrão de poços por A1, A2, A3... ou aquele para poços listados por A1, B1, C1...
   5. Execute a análise simplesmente clicando no botão Origem no canto superior direito do console.
      NOTA: A análise leva menos de 1 min para ser concluída. A saída da análise R aparecerá automaticamente na mesma pasta de arquivos que o conjunto de dados de entrada.
   6. Exibir saída: A pasta de saída possui vários documentos e subpastas para fornecer uma análise abrangente, incluindo informações estatísticas do período, fase e amplitude médios para réplicas de cada genótipo e/ou tratamento.
      NOTA: Para o arquivo de entrada Supplemental File 2 (NO7.csv), uma lista dos documentos de saída gerados pelo script do Supplemental File 1 (LUC_2025.R) na seção de protocolo 1 é descrita na Tabela 1 e pode ser convenientemente visualizada com a estrutura de árvore na Figura Suplementar S2.

2. Ensaio ROS baseado em luminol

1. Configuração experimental para ensaio ROS
   1. Corte discos foliares de 4 mm de diâmetro da quarta à sétima folhas de plantas de 25 dias com um perfurador de biópsia.
   2. Flutue os discos das folhas com o lado peludo para cima sobre 100 μL de água estéril em uma placa de 96 poços.
   3. Cubra o prato com papel alumínio limpo e coloque-o em uma câmara de crescimento LD durante a noite.
   4. Substitua a água por 100 μL de solução de luminol (300 μM em tampão MOPS 10 mM com pH 7,4 e 1 μM flg22 ou outro elicitor). Use a solução simulada no lugar de flg22 como controle.
   5. Comece imediatamente a registrar leituras de luminescência a cada minuto por 40-60 min.
2. Explicação passo a passo da análise R dos dados ROS
   OBSERVAÇÃO: essa análise do R usa o Rstudio, o script R,  o Arquivo Suplementar 3 (ROS_2025.R) e os arquivos de entrada Arquivo Suplementar 4 (ROS_flg22.csv) ou Arquivo Suplementar 5 (ROS_elf26.csv). O script R junto com o arquivo de entrada Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) está disponível publicamente por meio da plataforma de repositório online Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Baixe os pacotes RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ e filesstrings¹⁷.
      NOTA: As etapas 2.2.1 só precisam ser concluídas uma vez. Para ajudar os usuários a adaptar cada análise a um conjunto específico de dados no computador, uma seção chamada "Entrada do usuário" foi criada para permitir que os usuários indiquem parâmetros específicos para seus experimentos (Figura S3 suplementar).
   2. Altere a Entrada do Usuário I de acordo com um conjunto de dados específico em um computador local, incluindo o diretório de trabalho, o nome do arquivo de entrada, rótulos para os tratamentos e a hora de início relativa do ensaio.
      1. Selecione o diretório de trabalho. Indique onde reside o arquivo de entrada. A mesma pasta será o local para os arquivos de saída.
      2. Selecione o arquivo de entrada, um arquivo CSV formatado corretamente para o script R (Figura 2B). Especificamente, a linha superior tem a série temporal e a primeira coluna contém posições de amostra individuais em uma placa de 96 poços.
         NOTA: Um exemplo desse arquivo CSV de entrada pode ser encontrado no material suplementar, Arquivo Suplementar 4 (ROS_flg22.csv) ou Arquivo Suplementar 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Nomeie as amostras e/ou tratamentos. Como essa análise é usada para dados obtidos de configurações de 96 poços com um curso de tempo, projete os experimentos como 8 repetições por tratamento para um total de até 12 tratamentos por placa, ou como 12 repetições por tratamento para um total de até 8 tratamentos por placa. Se houver linhas de poços vazios, basta listá-los como tal no espaço para nomes de tratamento, por exemplo, nomeando como vazio 1, vazio 2 ...
         NOTA: É importante inserir o número correto de amostras, 8 ou 12, porque o número da amostra conta. Se a contagem de amostra não for 8 ou 12, o código não será executado. Para nomes de exemplo, evite usar barras invertidas ou símbolos semelhantes, pois eles podem causar problemas de nome de arquivo. Evite também usar "NA" como um rótulo ao selecionar o uso de ANOVA na Entrada do Usuário II. Ao contrário do script do Arquivo Suplementar 1 (LUC_2025.R), os tratamentos com o mesmo nome não são combinados em um único grupo neste script do Arquivo Complementar 3 (ROS_2025.R).
   3. Altere as opções de Entrada do Usuário II de acordo com as necessidades específicas do usuário.
      NOTA: Exemplo de entrada do usuário pode ser visto na Figura Suplementar S3.
      1. Use o teste ANOVA com o Tukey HSD para comparar as somas de luminescência do tratamento.
      2. Use um teste t bilateral para comparar os dados de apenas dois tratamentos ao mesmo tempo.
         NOTA: Os valores de p mostrados não são ajustados para levar em conta várias comparações com a mesma linha.
      3. Faça um gráfico das curvas de fluorescência e um gráfico de barras comparando a soma total da fluorescência. Adicione desvio padrão ou erro padrão da média aos gráficos.
      4. Dependendo de como o leitor de placas registra os poços, altere a forma como a entrada é lida. Use a lista de dados padrão de poços por A1, A2, A3 ... ou aquele para poços listados por A1, B1, C1...
3. Execute a análise simplesmente clicando no botão Source no canto superior direito do console.
   NOTA: A análise leva menos de 1 min para ser concluída. A saída da análise R aparecerá automaticamente na mesma pasta de arquivos que o conjunto de dados de entrada.
4. Exibir saída: A pasta de saída possui vários documentos e subpastas para fornecer uma análise abrangente.
   NOTA: Para o arquivo de entrada Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv), uma estrutura de árvore dos documentos de saída gerados pelo script do Supplemental File 3 (ROS_2025.R) descrito na seção 2 do protocolo é mostrada na Figura Suplementar S4.

Estudo de caso 1. Ensaio de luminescência para atividade do relógio circadiano com mudas de Arabidopsis

Mostramos anteriormente que o gene da PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO RNA 7 rico em glicina (GRP7) foi controlado pela proteína do relógio mestre CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) e a expressão circadiana de GRP7 é importante por seu papel na defesa da planta, usando plantas transgênicas Col-0 expressando o repórter de luciferase sob o controle do promotor GRP7 de tipo selvagem (pGRP7wt: LUC)21. Analisamos as atividades do relógio circadiano dessas plantas transgênicas junto com a planta controle CCA1:LUC/Col-0, usando o script R denominado LUC_2025.R (Arquivo Suplementar 1 na seção 1 do protocolo).

O arquivo de entrada chamado NO7.csv (Arquivo Suplementar 2) tem leituras de luminescência para sete linhas pGRP7wt:LUC independentes e o controle CCA1:LUC/Col-0 ( Arquivo Suplementar 2 (NO7.csv)). Depois de executar o script, a subpasta de saída chamada saída NO7 será gerada na mesma pasta que o arquivo de entrada NO7.csv (Supplemental File 2 (NO7.csv)). Os arquivos da pasta de saída NO7 são descritos na Tabela 1 e podem ser convenientemente visualizados com a estrutura em árvore na Figura Suplementar S2. Os valores na pasta de saída NO7 foram processados posteriormente para fazer a Figura 3 e a Figura 4. A Figura 3 mostra que o repórter CCA1:LUC exibiu uma amplitude de 3.000 RLU, um período de 23,5 h e uma fase de 3,5 h. Esses parâmetros de clock são amplamente consistentes com relatórios anteriores22,23. Um padrão de expressão diferente foi observado para as linhagens pGRP7wt:Luc. Embora todas as linhagens pGRP7wt:LUC parecessem semelhantes em período e fase, houve diferenças nos valores de amplitude dessas linhagens, provavelmente devido ao efeito posicional dos transgenes nos cromossomos. Essas observações foram confirmadas quando os parâmetros de período, amplitude e fase foram calculados por meio do script R (Figura 4). Para validar essa análise, o mesmo conjunto de dados foi reanalisado usando BioDare2, uma plataforma online gratuita para análise de dados circadianos8. Os resultados da análise R foram comparáveis aos obtidos pelo algoritmo BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8,24 (Figura 4).

Estudo de caso 2. O ensaio de luminescência para a atividade do relógio circadiano com células de mamíferos
O script R LUC_2025.R (Arquivo Suplementar 1 foi usado para analisar a atividade do relógio circadiano exibida por células de mamíferos25. A linhagem celular U2 OS que expressa um repórter do relógio circadiano é uma linhagem celular modelo comumente usada para medir as atividades do relógio circadiano de mamíferos26,27. Reanalisamos os dados de séries temporais gerados com células U2 OS expressando o repórter Per2d:Luc cultivado em uma placa de 96 poços. As células foram tratadas com moléculas de siRNA direcionadas a genes específicos. A Figura 5 mostra que as células controle negativo, que não foram tratadas com siRNA, apresentaram um período de 23,3 h, uma fase de 2,8 h e uma amplitude de 184,8 RLU. Como esperado, o siRNA direcionado ao gene CRY2 amorteceu significativamente a amplitude e afetou o período e a fase do repórter. Os genes PSMD4 e PSMD7 codificam proteínas que fazem parte do componente da tampa do proteassoma 26S para degradação de proteínas. Consistente com o relatório anterior25, a análise R mostra que a derrubada de PSMD4 ou PSMD7 por seus respectivos siRNA não afeta os parâmetros de clock. Assim, este script R é prontamente aplicável a diferentes sistemas experimentais para estudos do relógio circadiano.

Estudo de caso 3. O ensaio ROS para uma resposta de defesa
Além de grandes conjuntos de dados de ensaios de relógio circadiano luminescente, o script R pode ser adaptado para analisar outros tipos de dados. Aqui apresentamos uma dessas aplicações para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS). Sabe-se que as plantas desenvolveram várias estratégias para lutar contra a invasão de patógenos. Uma das estratégias é reconhecer moléculas não próprias de um patógeno e, posteriormente, ativar respostas imunes inatas. Uma dessas respostas imunes iniciais é uma explosão de ROS, ocorrendo em minutos quando um hospedeiro encontra uma molécula não própria. Um ensaio típico de ROS foi realizado com uma placa de 96 poços, contendo 12 discos foliares por genótipo por tratamento (seção 2 do protocolo). Aqui, duas moléculas elicitadoras comuns, flg22, um peptídeo de 22 aminoácidos derivado da região conservada das proteínas de flagelina bacteriana28, e elf26, um peptídeo de 26 aminoácidos da proteína Tu do fator de alongamento29, foram usadas para induzir a explosão de ROS. O script, Supplemental File 3 (ROS_2025.R), foi desenvolvido para análise de dados ROS. Dois arquivos CVS de ensaios ROS, Arquivo Suplementar 4 (ROS_flg22.csv) e Arquivo Suplementar 5 (ROS_elf26.csv), que foram convertidos para o formato da análise R, podem ser baixados da seção Material Suplementar. Após a análise R, as pastas de saída devem ser geradas na mesma pasta que cada arquivo de entrada no próprio computador, contendo as curvas de ruptura de ROS e os valores totais de ROS durante o tempo de ensaio, juntamente com análises estatísticas (Figura Suplementar S4). Os dados foram posteriormente processados para fazer a Figura 6. Os resultados aqui apresentados são semelhantes aos publicados, que foram processados manualmente30.

Figura 1: Fluxograma do ensaio de luciferase para análise de R. Mudas expressando um repórter de luciferase acionada por um promotor de relógio foram esterilizadas e cultivadas em meio 1/2 MS em LD por 4 dias. As plântulas foram transferidas para placas de 96 poços contendo 180 μL de meio 1/2 MS contendo D-luciferina. Cada poço continha uma muda. Após 1 dia em LD seguido de 1 dia em LL, a luminescência foi registrada com um leitor de placas. As plântulas em uma placa foram tipicamente registradas para luminescência em LL em intervalos de 1 h por 5-7 dias. Após o registro, as placas foram fotografadas para avaliar o crescimento das plântulas e os dados brutos foram salvos como um arquivo CSV para análise de R. Abreviaturas: LD = 12 h claro/12 h escuro; LL = luz constante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxograma de aquisição de dados de luminescência e análise R. (A) Um procedimento de cinco etapas é descrito para a análise do relógio circadiano usando o script R. Passo 1. Estabelecer experimentos como 8 ou 12 mudas por genótipo e/ou por tratamento; Etapa 2. Registre a luminescência em LL em intervalos de 1 h por 5-7 dias; Etapa 3. Obter e formatar dados em um arquivo CSV; Etapa 4. Analisar dados usando R; e Etapa 5. Exibir dados de saída. A hora de início da gravação pode ser a qualquer momento. No entanto, como o script R usa apenas números inteiros (números inteiros), os intervalos de gravação devem ser um número inteiro. (B) Captura de tela de um arquivo CSV de entrada formatado corretamente para o script R. O arquivo de entrada original, NO7.csv, pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Expressão circadiana de pGRP7wt:LUC em plantas transgênicas. Traços de luminescência de pGRP7wt:LUC são mostrados. As barras sob o eixo x indicam dia (barras abertas) e noite (barras cinza) subjetivos. O traço de luminescência de cada genótipo é uma média de 12 repetições. As barras de erro não foram mostradas devido ao grande número de curvas. Abreviatura: RLU = Unidades de luminescência relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Uma comparação dos dados de saída do script R e do BioDare2. O mesmo conjunto de dados mostrado na Figura 3 foi analisado pelo script R e pelo BioDare2 para os parâmetros do relógio circadiano, amplitude, período e fase. Os dados representam a média ± EPM (n=12). Letras diferentes indicam diferença significativa entre as amostras (P < 0,05; ANOVA de uma via com teste HSD de Tukey post hoc). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise da atividade do relógio circadiano com células de mamíferos. Os dados de séries temporais gerados com células U2 OS expressando o repórter Per2dLuc cultivado em uma placa de 96 poços em DD foram descritos anteriormente 25. Moléculas de siRNA direcionadas a CRY2, PSMD4 ou PSMD7 foram usadas para tratar as células. (A) Traços de luminescência. (b) Amplitude, período e fase de Per2d: Luc. Os dados representam a média ± EPM (n = 3). Letras diferentes no painel (B) indicam diferença significativa entre o controle negativo e uma amostra tratada com siRNA (P<0,05; ANOVA de uma via com teste HSD de Tukey post hoc). Abreviatura: RLU = unidade de luminescência relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise de ruptura de ROS por R. As plântulas foram registradas para unidade de luminescência relativa imediatamente após serem tratadas com 1 μM flg22 (esquerda) ou 1 μM elf26 (direita). (A) Traços de luminescência em média de 12 mudas por genótipo (n = 12) em um curso de tempo pós-elicitação. Os valores médios por genótipo por tratamento fazem parte da produção de R. (B) Contagem média de luminescência total para cada genótipo com tratamento flg22 ou elf26. Os dados representam a média ± EPM (n = 12). Letras diferentes indicam diferença significativa entre as amostras (P < 0,05; ANOVA de uma via com teste HSD de Tukey post hoc). Abreviatura: RLU = unidade de luminescência relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Uma lista dos documentos de saída da análise R. Esta é uma lista dos documentos de saída gerados pelo script LUC_2025.R (Arquivo Suplementar 1) e o arquivo de entrada NO7.csv (Arquivo Complementar 2).

Figura S1 suplementar: Capturas de tela para Entrada I e Entrada II na seção 1 do protocolo. A Entrada do Usuário I deve ser alterada para adaptar a análise a um conjunto de dados específico em um computador local. As alterações na Entrada do Usuário II são opcionais, dependendo da configuração experimental. É importante observar que o script do Arquivo Suplementar 1 (LUC_2025.R) espera que todos os poços estejam presentes no arquivo e não apenas os poços selecionados ou usados. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura S2 suplementar: Estrutura em árvore para os documentos de saída. Essa saída foi gerada usando o script LUC_2025.R (Arquivo Suplementar 1) e o arquivo de entrada NO7.csv (Arquivo Suplementar 2). O script LUC_2025.R gera uma pasta de saída com base no nome do arquivo de entrada. Para obter mais detalhes sobre os arquivos de saída, consulte a Tabela 1. As caixas representam pastas de arquivos. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura S3 suplementar: Capturas de tela para Entrada do Usuário I e Entrada do Usuário II na seção 2 do protocolo. O script do Arquivo Complementar 3 (ROS_2025.R) usa o mesmo formato de entrada geral que o script do Arquivo Complementar 1 (LUC_2025.R). A Entrada do Usuário I deve ser alterada para adaptar a análise a um conjunto de dados específico em um computador local. As alterações na Entrada do Usuário II são opcionais, dependendo da configuração experimental. É importante observar que o script do Supplemental File 3 (ROS_2025.R) espera que todos os poços estejam presentes no arquivo e não apenas os poços selecionados ou usados. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura S4 suplementar: Estrutura em árvore para os documentos de saída. Essa saída foi gerada usando o script ROS_2025.R (Arquivo Suplementar 3) e o arquivo de entrada ROS_flg22.csv (Arquivo Suplementar 4). O script ROS_2025.R gera uma pasta de saída com base no nome do arquivo de entrada. Dentro dessa pasta há um arquivo para Contagens Totais de ROS e um arquivo para gráficos. Há também subpastas para PRISM e dados gráficos, o teste ANOVA e os testes t. As caixas representam pastas de arquivos. Clique aqui para baixar esta figura.

Tabela Suplementar S1: Uma lista de ferramentas de bioinformática disponíveis para análise de dados circadianos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: LUC_2025.R. Este é o script R usado para analisar os dados do relógio circadiano. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: NO7.csv. Este é o arquivo de entrada que contém um exemplo de dados do relógio circadiano. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: ROS_2025.R. Este é o script R usado para analisar os dados do ROS. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: ROS_fig22.csv. Este é o arquivo de entrada que contém um exemplo de dados ROS. As ERO foram induzidas pelo tratamento com flg22 1 μM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: ROS_elf26.csv. Este é o arquivo de entrada que contém um exemplo de dados ROS. ROS foi induzido pelo tratamento com elf26 1 μM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.