Artigo de método

Avaliando o efeito dos fatores SASP na proliferação de células cancerígenas usando uma análise comparativa de três metodologias distintas

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo avalia os efeitos proliferativos dos fatores do fenótipo secretor associado à senescência (SASP) de células HeLa senescentes em células HeLa não senescentes usando três modelos in vitro com monitoramento em tempo real. As vantagens e limitações de cada método foram sistematicamente comparadas para entender melhor as interações célula-célula no câncer.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células cancerígenas senescentes induzidas por quimioterapia também secretam vários fatores, chamados fenótipo secretor associado à senescência, para regular seu microambiente extracelular. Estudos anteriores relataram que esses fatores SASP exercem efeitos parácrinos prejudiciais nas células circundantes, incluindo a promoção da proliferação, transição epitelial-mesenquimal (EMT), angiogênese e migração. Várias técnicas de co-cultura in vitro são amplamente utilizadas para entender os processos celulares resultantes da interação, cultivando os mesmos e diferentes tipos de células juntas. Aqui, os potenciais efeitos proliferativos dos fatores SASP secretados por células HeLa senescentes em células HeLa não senescentes foram investigados usando três abordagens in vitro complementares. A primeira abordagem envolveu a co-cultura de células senescentes e não senescentes para investigar a sinalização parácrina mediada pelo SASP. Na segunda abordagem, os meios condicionados coletados de células cancerígenas senescentes foram concentrados e posteriormente usados para examinar o impacto dos meios condicionados com monitoramento em tempo real da proliferação. No terceiro método, células senescentes e não senescentes foram cultivadas lado a lado para avaliar os efeitos justacrinos do SASP por meio do contato direto célula a célula. Todos os três modelos experimentais demonstraram consistentemente que os fatores SASP aumentaram significativamente a proliferação de células cancerígenas não senescentes. Notavelmente, a co-cultura de células senescentes aumentou a taxa de proliferação em 64,6%, e o meio condicionado por SASP 3x concentrado aumentou a proliferação em mais de 50% em comparação com os controles. A imagem baseada em fluorescência mostrou um aumento de 49,3% no número de células positivas para GFP em condições justacrinas. Esses métodos permitiram coletivamente a avaliação quantitativa e qualitativa das mudanças proliferativas induzidas pelo SASP. A análise comparativa dessas abordagens destaca seus respectivos pontos fortes e limitações, fornecendo informações valiosas sobre os efeitos parácrinos das células senescentes.

Introdução

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Em organismos multicelulares, as células se comunicam por meio de sinalização parácrina e justacrina, trocando mensagens com seu microambiente, influenciando assim o comportamento umas das outras. Essa comunicação pode ocorrer diretamente, por meio de nanotubos de tunelamento e junções comunicantes, ou indiretamente por meio da secreção de moléculas químicas solúveis, como citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas na matriz extracelular. Esses mecanismos de sinalização desempenham papéis essenciais na regulação de vários processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento de tecidos e as respostas das células imunes, e também estão implicados na patogênese de inúmeras doenças, como câncer, HIV, hipertensão e Alzheimer1.

Na década de 1960, Leonard Hayflick descobriu que os fibroblastos humanos normais têm uma capacidade limitada de se replicar in vitro2. Esse estado limitado de proliferação celular que se desenvolve devido ao encurtamento da telomerase é chamado de senescência replicativa. Estudos subsequentes revelaram que várias formas de estresse celular também podem desencadear a senescência celular. Foi determinado que os tratamentos comuns contra o câncer, como quimioterapia e radioterapia, também induzem senescência celular nas células cancerígenas e estromais, chamada senescência induzida por terapia 3,4. A senescência celular e o envelhecimento são processos hierarquicamente relacionados; eles representam processos biológicos distintos. O acúmulo de células senescentes no organismo contribui para o envelhecimento, promovendo inflamação, disfunção tecidual e desenvolvimento de doenças relacionadas à idade. No entanto, o envelhecimento abrange uma gama muito mais ampla de eventos e mecanismos sistêmicos em comparação com a senescência5.

As células senescentes são caracterizadas por seu citoplasma expandido ser significativamente maior e ter uma morfologia achatada em comparação com as células normais6. Essas células senescentes têm atividade lisossômica aumentada e são positivas para a atividade da β-galactosidase (SA-β-gal) associada à senescência, uma enzima lisossômica que permanece ativa mesmo em pH ácido 6,0. A coloração SA-β-gal é o biomarcador mais amplamente utilizado para detectar células senescentes7. O aumento e a morfologia irregular dos núcleos são comumente observados em células em senescência. Além disso, essas células são caracterizadas por rearranjos únicos da cromatina chamados focos heterocromáticos associados à senescência (SAHF) que medeiam a parada irreversível do ciclo celular 8,9.

Embora as células cancerígenas senescentes tenham perdido sua capacidade de proliferar, elas permaneceram viáveis e metabolicamente ativas. Sabe-se que as células senescentes também secretam vários fatores para regular seu microambiente tumoral extracelular, denominado fenótipo secretor associado à senescência (SASP)10,11. Esses fatores SASP incluem fatores de sinalização solúveis (interleucinas, quimiocinas e fatores de crescimento), proteases secretadas e proteínas insolúveis/componentes da matriz extracelular (MEC) secretados. Coletivamente, esses fatores exercem efeitos parácrinos prejudiciais, incluindo a promoção da proliferação de células cancerígenas, migração, invasão e indução de transição epitelial-mesenquimal (EMT)4,12. Além disso, os efeitos adversos induzidos pela quimioterapia foram parcialmente atribuídos ao acúmulo de células senescentes13. Portanto, investigar a interação entre células senescentes e não senescentes tornou-se uma importante área de pesquisa no contexto da terapia do câncer. Especialmente a análise dos fatores SASP, particularmente suas composições e os efeitos no microambiente do câncer, é considerada uma estratégia promissora para identificar novas moléculas-alvo para a terapia do câncer e descobrir novos medicamentos para essas moléculas.

Técnicas de co-cultura in vitro têm sido usadas há muito tempo para estudar a compreensão das interações célula a célula14. Neste artigo metodológico, o objetivo foi avaliar a possível atividade proliferativa de fatores secretados por células senescentes em células cancerígenas não senescentes usando três métodos diferentes. Além disso, os resultados obtidos com os três diferentes métodos foram comparados e as respectivas vantagens e desvantagens de cada abordagem foram avaliadas criticamente.

Primeiro, um modelo de co-cultura foi estabelecido entre células HeLa senescentes e HeLa não senescentes para monitorar as possíveis mudanças na proliferação de células cancerígenas em tempo real usando o sistema de análise celular em tempo real12. Este sistema consiste em duas placas para avaliar as interações célula-célula. A visão da placa eletrônica, que forma a camada inferior, tem uma superfície onde as células-alvo são semeadas, com microeletrodos posicionados na parte inferior da placa. A resistência elétrica criada pela adesão das células-alvo a esta superfície é expressa pelo parâmetro mensurável Cell Index (IC). O valor do IC é proporcional ao número de células e ao grau de adesão à superfície15. Além disso, a visualização da placa eletrônica permite o exame morfológico das células sob um microscópio de contraste de fase. A inserção da placa eletrônica, que forma a camada superior, é a área onde as células efetoras são semeadas. A parte inferior desta placa é coberta com uma membrana semipermeável de tamanho de poro de 0,4 μm. Os fatores secretados pelas células efetoras podem passar pela membrana e afetar as células-alvo na visualização da placa eletrônica. Se essa interação estimular a proliferação celular, isso é observado como um aumento no valor do IC. Assim, as interações entre as células podem ser avaliadas quantitativamente.

No segundo método, os meios condicionados coletados de células HeLa senescentes foram concentrados e adicionados às células HeLa não senescentes. O potencial efeito proliferativo sobre essas células foi monitorado usando o sistema de análise celular em tempo real.

No terceiro método, foi planejado co-cultivar as células HeLa senescentes e as células GFP-HeLa não senescentes diretamente em 2D e monitorar as possíveis alterações proliferativas em células cancerígenas em tempo real sob um microscópio.

O objetivo deste experimento é montar três modelos para estudar a interação entre células HeLa senescentes e HeLa não senescentes e monitorar possíveis mudanças na proliferação de células cancerígenas em tempo real. Assim, o efeito dos fatores SASP secretados por células cancerígenas senescentes nas outras células cancerígenas pode ser facilmente investigado. Assim, as vantagens e limitações das três abordagens foram sistematicamente avaliadas.

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Protocolo

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NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células foram conduzidos em condições de nível de biossegurança II+ (BSL2+) dentro de um gabinete de segurança certificado. A doxorrubicina é um agente quimioterápico perigoso. Todos os procedimentos devem ser realizados em um gabinete certificado de nível de biossegurança II+ (BSL2+) usando equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, incluindo jalecos e luvas de laboratório. Todos os resíduos contendo doxorrubicina, incluindo meios e fixadores, devem ser coletados em recipientes de resíduos perigosos designados e claramente rotulados e descartados por meio do sistema institucional de gerenciamento de resíduos perigosos.

1. Modelo 1: Cocultura usando o sistema de análise celular em tempo real

  1. Cultura de células e indução de senescência (Dia 1-2)
    1. Semeie 8 x 105 células HeLa em um frasco de cultura T25 contendo 5 mL de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e incube as células a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
    2. No dia seguinte, substitua o meio das células por 5 mL de meio completo fresco. Trate as células com doxorrubicina 300 nM diretamente, adicionando ao meio para induzir a senescência celular. Manter o balão T25 numa incubadora com 5% de CO2 a 37 °C durante 72 h.
  2. Semeadura de células não senescentes (Dia 4)
    1. Semear 8 x 105 células HeLa não tratadas (controle não senescente) em um novo frasco T25 em 5 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e manter em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Confirmando a indução de senescência (Dia 5)
    1. Para determinar se 72 h de tratamento com doxorrubicina induziram senescência, faça a coloração SA-β-gal6. Realizar este ensaio num conjunto separado de células não utilizadas nas experiências principais. Para os resultados obtidos, ver Figura 1A,B.
    2. Meça a IL-6 no meio condicionado de células HeLa senescentes de câncer para avaliar sua atividade secretora. Trate as células com doxorrubicina por 72 h, seguida de incubação em meio sem soro e sem vermelho de fenol por mais 2 dias. Normalize o meio condicionado coletado para o número de células e meça os níveis de IL-6.
      NOTA: A IL-6 é uma citocina característica do SASP12. Os resultados da dosagem de IL-6 são apresentados na Figura 1C.
  4. Configuração do sistema de análise celular em tempo real (Dia 5)
    1. Ligue o sistema de análise de células em tempo real antes da semeadura de células. Inicie o software RTCA 2.0. Clique no botão Exp Notes (Figura 2) e insira os detalhes experimentais.
    2. Clique no botão Agendar e adicione duas etapas. O primeiro passo é para o plano de fundo. O segundo passo é monitorar a proliferação celular a cada 15 minutos por 72 h.
    3. Escolha o Primeiro Passo e clique em Reproduzir para gravar a impedância de fundo adicionando 50 μL de meio completo a cada poço da visualização da placa eletrônica.
  5. Semeando células na visualização da placa eletrônica (Dia 5)
    1. Verifique as células HeLa tratadas com doxorrubicina (senescentes) e não tratadas (não senescentes) sob um microscópio de contraste de fase usando ampliação de 10x antes de semear as células. Sob o microscópio, as células senescentes têm uma morfologia muito mais aumentada do que as células normais.
    2. Lave as células HeLa senescentes e não senescentes com 5 mL de PBS pré-aquecido estéril e, em seguida, aspire.
    3. Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% pré-aquecida e mantenha os frascos a 37 ° C por 2 min para separar as células. Neutralize a tripsina com 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    4. Centrifugue as células a 500 x g à temperatura ambiente por 10 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL).
    5. Conte as células viáveis usando o método de exclusão do corante azul de tripano usando um hemocitômetro.
    6. Semeie células HeLa não senescentes a uma densidade de 5 x 103 células/poço em cada poço de uma placa eletrônica em 100 μL completos de DMEM suplementados com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    7. Coloque a visualização da placa eletrônica no berço do sistema de análise de células em tempo real para permitir que as células se fixem à superfície da placa na incubadora.
    8. Escolha a segunda etapa no botão de programação e clique no botão Play para iniciar a medição de impedância usando o software RTCA 2.0 por 72 h (Figura 2).
  6. Semeando células no inserto da placa eletrônica
    1. As células de sementes em uma placa eletrônica inserem poços em 60 μL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    2. Células semeadas na inserção da placa eletrônica em três configurações experimentais diferentes: Grupo 1 (Controle Negativo): Nenhuma célula semeada (somente mídia)
      Grupo 2: 2 × 104 células HeLa não senescentes
      Grupo 3: 1 × 105 células HeLa senescentes
    3. Mantenha o inserto da placa eletrônica a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 por 6 h para fixação.
  7. Co-cultura de células
    1. Clique em Pausar após 6 h de propagação de células. Aspire suavemente o meio de cultura de cada poço da placa eletrônica para remover o soro e as células não aderentes.
    2. Lave os poços 2x com PBS pré-aquecido a 37 °C.Adicione 140 μL de DMEM sem soro a cada poço da visualização da placa eletrônica.
    3. Pegue o inserto da placa eletrônica e aspire o meio de cultura. Lave os poços suavemente com PBS a 37 °C 2x e adicione 60 μL de DMEM sem soro.
    4. Posicione o inserto da placa eletrônica na visualização da placa eletrônica e pressione suavemente para baixo até que o inserto esteja totalmente encaixado no poço.
    5. Insira a placa combinada no sistema de análise de células em tempo real e clique em Reproduzir para retomar o monitoramento em tempo real dos valores do índice de células em intervalos de 15 minutos usando o software (Figura 2).
    6. Desligue o sistema de análise celular em tempo real quando o tempo do experimento terminar (Figura 3A).
  8. Células de imagem no inserto da placa eletrônica
    NOTA: Como há uma membrana no poço de inserção da placa eletrônica, as células semeadas aqui não podem ser visualizadas na membrana usando microscopia de contraste de fase. Portanto, para testar se as células mantinham a viabilidade até o final do experimento e se as células senescentes preservavam sua integridade estrutural, elas foram coradas com DAPI (Figura 3B).
    1. Remova a inserção da placa de origem da vista da placa de identificação. Pinte as células no inserto da placa eletrônica com DAPI e verifique a presença de células em um microscópio fluorescente16. Sabe-se que os núcleos das células senescentes são maiores do que os das células normais. Portanto, com base nos tamanhos nucleares das células coradas com DAPI, determine qual poço foi semeado com células não senescentes e qual com células senescentes.
  9. Células de imagem na visualização da placa eletrônica
    1. Examine diretamente a visualização da placa eletrônica sob um microscópio de contraste de fase usando ampliação de 10x (Figura 3B). Como quatro fileiras de sensores de microeletrodos foram removidas do centro de cada poço na visualização da placa eletrônica, o espaço 6 foi criado para permitir o monitoramento celular por microscopia.
  10. Análise de dados
    1. Normalize os valores de IC no momento em que a visualização da placa eletrônica e a inserção da placa eletrônica são combinadas e inseridas no sistema de análise de células em tempo real.
    2. Clique no botão Análise de dados para calcular a taxa de proliferação e a quantidade usando o índice máximo de células e os dados de inclinação obtidos do sistema de análise de células em tempo real (Figura 2). Em seguida, analise os dados usando um programa estatístico apropriado (Figura 3C,D).

2. Modelo 2: Ensaio de tratamento de meios condicionados usando o sistema de análise celular em tempo real

  1. Cultura de células e indução de senescência (Dia 1-2)
    1. Semear 35 x 104 células HeLa em cada poço de 6 placas contendo 2,5 mL de Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e incubar células a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
    2. No dia seguinte, substitua o meio das células por 2,5 mL de meio completo fresco. Trate as células com doxorrubicina 300 nM diretamente, adicionando-a ao meio para induzir a senescência celular. Mantenha a placa de 6 poços em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 ° C por 72 h.
  2. Semeadura de células não senescentes (Dia 4)
    1. Semear 35 x 104 células HeLa não tratadas (controle não senescente) em cada poço de uma nova placa de 6 poços em 2,5 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e manter em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Efectuar a confirmação da indução da senescência conforme descrito no passo 1.3.
  4. Preparação de meio condicionado a partir de células HeLa senescentes e não senescentes
    1. Verifique as células tratadas com doxorrubicina (células senescentes) e as células HeLa não tratadas (células não senescentes) sob um microscópio de contraste de fase. Sob o microscópio, as células senescentes têm uma morfologia muito mais aumentada do que as células normais.
    2. Aspire o meio de cultura de ambas as placas de 6 poços (células HeLa senescentes e não senescentes). Lave as células 2x com PBS pré-aquecido a 37 °C para remover o soro residual e os detritos celulares.
    3. Adicione 2 mL de DMEM sem soro suplementado com penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) em cada poço. Incubar as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 por 48 h.
  5. Coleta e concentração de meios condicionados (Dia 7)
    1. Colete o meio condicionado de cada poço em tubos estéreis em uma cabine de segurança laminar.
    2. Tripsinize as células e conte as células usando o método de exclusão de corante azul de tripano usando um hemocitômetro para normalizar o meio condicionado para o número de células.
    3. Ajuste o meio condicionado, normalizado de acordo com o número de células, para um volume final de 2 mL com DMEM sem soro suplementado com penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) em tubos estéreis de 2 mL.
    4. Centrifugue o meio condicionado coletado a 1.000 x g por 10 min a 4 ° C para remover os detritos celulares, seguido de centrifugação a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C para obter o sobrenadante clarificado.
    5. Centrifugue o meio condicionado usando unidades de filtro ultracentrífugo de 2 mL a 4 ° C por 60 min a 3.000 x g para concentrá-lo. Este procedimento concentra os 2 mL de meio condicionado em 5x os 400 μL concentrados de meio condicionado.
    6. Diluir os 40 μL obtidos de meio condicionado com meio fresco sem soro para preparar 1x, 2x e 3x meio condicionado concentrado em tubos estéreis em uma cabine de segurança laminar.
      NOTA: Como o meio que permanece nas células por 48 h se esgota devido ao consumo celular, o meio condicionado coletado e concentrado é posteriormente diluído com um novo meio.
  6. Semeando células para a visualização da placa eletrônica
    1. Configure o sistema de análise celular em tempo real conforme descrito nas etapas 1.1-1.4.Lave as células HeLa não senescentes com PBS pré-aquecido e, em seguida, aspire.
    2. Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% pré-aquecida e mantenha os frascos a 37 ° C por 2 min para separar as células. Neutralize a tripsina com 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    3. Centrifugue as células a 500 x g à temperatura ambiente por 10 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL).
    4. Conte as células viáveis usando o método de exclusão do corante azul de tripano usando um hemocitômetro.
    5. Semeie células HeLa não senescentes a uma densidade de 5 x 103 células/poço em cada poço de uma placa eletrônica em 200 μL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Coloque a visualização da placa eletrônica no berço do sistema de análise de células em tempo real para permitir que as células se fixem à superfície da placa na incubadora.
    7. Escolha a segunda etapa no botão de programação e clique no botão Play para iniciar a medição de impedância usando o software RTCA 2.0 (Figura 2). Clique no botão Pausar no software após 6 h de plaqueamento de células HeLa não senescentes (Figura 2).
    8. Aspire suavemente o meio de cultura de cada poço da placa eletrônica para remover o soro e as células não aderentes. Lave os poços 2x com PBS pré-aquecido a 37 °C.
    9. Adicionar os meios condicionados pré-aquecidos a 37 °C nos grupos adequados:
      Grupo 1: Mídia fresca
      Grupo 2: 1x meio condicionado de célula HeLa não senescente
      Grupo 3: 2x meios condicionados de células HeLa não senescentes
      Grupo 4: 3x meios condicionados de células HeLa não senescentes
      Grupo 5: 1x meio condicionado de célula HeLa senescente
      Grupo 6: 2x meios condicionados por células HeLa senescentes
      Grupo 7: 3x meios condicionados por células HeLa senescentes
    10. Insira a placa eletrônica view no sistema de análise de células em tempo real e clique em Reproduzir para retomar o monitoramento em tempo real dos valores do índice de células em intervalos de 15 minutos por 48 h (Figura 2).
    11. Desligue o sistema de análise celular em tempo real quando o tempo do experimento terminar (Figura 4A).
  7. Células de imagem na visualização da placa eletrônica
    1. Examine diretamente a visualização da placa eletrônica sob um microscópio de contraste de fase com ampliação de 10x (Figura 4B). Como quatro fileiras de sensores de microeletrodos foram removidas do centro de cada poço na visualização da placa eletrônica, foi criado um espaço para permitir o monitoramento celular por microscopia.
  8. Análise de dados
    1. Normalize os valores de IC no momento em que o meio condicionado concentrado foi administrado às células HeLa não senescentes.
    2. Clique no botão Análise de dados para calcular a taxa e a quantidade de proliferação usando o índice máximo de células e os dados de inclinação obtidos do sistema de análise de células em tempo real (Figura 2). Em seguida, analise os dados usando um programa estatístico apropriado (Figura 4C,D).

3. Modelo 3: Monitoramento em tempo real da interação célula-célula

  1. Cultura de células e indução de senescência (Dia 1-2)
    1. Semeie 8 x 105 células HeLa em um frasco de cultura T25 contendo 5 mL de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e incube as células a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
    2. No dia seguinte, substitua o meio das células por 5 mL de meio completo fresco. Trate as células com doxorrubicina 300 nM diretamente, adicionando ao meio para induzir a senescência celular. Manter o balão T25 numa incubadora com 5% de CO2 a 37 °C durante 72 h.
  2. Semeadura de células não senescentes (Dia 4)
    1. Semear 8 x 105 células GFP-HeLa (controle não senescente) em um novo frasco T25 em 5 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e manter em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
    2. Semear 8 x 105 células HeLa (controle não senescente) em um novo frasco T25 em 5 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) e manter em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Realize a confirmação da indução de senescência conforme descrito na etapa 1.3 (dia 5).
  4. Co-cultura de células
    1. Verifique as células tratadas com doxorrubicina, GFP-HeLa não tratadas e células HeLa não tratadas sob um microscópio de contraste de fase antes de semear as células. Sob o microscópio, as células senescentes têm uma morfologia muito mais aumentada do que as células normais.
    2. Lave todos os três frascos T25 com 5 mL de PBS pré-aquecido estéril e, em seguida, aspire. Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% pré-aquecida e mantenha os frascos a 37 ° C por 2 min para separar as células.
    3. Neutralize a tripsina com 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    4. Centrifugue as células a 500 x g à temperatura ambiente por 10 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 5 mL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL).
    5. Conte as células viáveis usando o método de exclusão do corante azul de tripano usando um hemocitômetro. Células-semente em 200 μL de DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Células de sementes em μ lâminas de 8 poços de altura em três configurações experimentais diferentes:
      Grupo 1: 7 x 103 células GFP-HeLa
      Grupo 2: 18 x 103 células HeLa não senescentes + 7 x 103 células GFP-HeLa
      Grupo 3: 18 x 103 células HeLa senescentes + 7 x 103 células GFP-HeLa
    7. Mantenha a lâmina de μ por 8 h para fixação a 37 ° C em uma incubadora com 5% de CO2. Após 8 h, lave as células com PBS pré-aquecido (37 °C) 2x para eliminar o efeito do soro nas células.
    8. Adicione 200 μL de DMEM sem soro contendo penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (0,1 μg / mL) a cada poço.
  5. Configuração do microscópio
    1. Ligue o controlador de temperatura e o controlador de CO2 e deixe o sistema de incubação no topo do estágio estabilizar por 30 min.
    2. Verifique manualmente as configurações de concentração e temperatura de CO2 e certifique-se de que as condições fisiológicas (5% CO2, 37 °C) sejam atingidas.
    3. Ligue o microscópio de fluorescência invertida e permita que o sistema conclua a autocalibração. Ligue a fonte de luz de fluorescência. Inicie o software de imagem e análise para controlar os parâmetros de imagem e a aquisição de imagens.
  6. Imagem de lapso de tempo
    1. Coloque a lâmina na câmara de incubação do topo do palco da microscopia de fluorescência invertida com uma câmera digital de alta resolução. Abra o software e selecione os modos Parte X, Y, Z e T e prepare experimentos em configurações de aquisição (Figura 5A).
    2. Selecione uma objetiva de 20x com alto contraste para imagens de fluorescência e contraste de fase (Figura 5A). Adicione os canais de contraste de fase e fluorescência (filtro FITC) para permitir a imagem em ambos os modos (Figura 5A).
    3. Clique no botão Live para iniciar a imagem de células vivas e, em seguida, coloque as células em foco sob contraste de fase (Figura 5A). Abra a janela z-stack e marque a posição das células de interesse (contendo células HeLa senescentes/não senescentes e células HeLa GFP). Navegue pelo estágio entre os poços usando o controlador automático do estágio, permitindo a localização precisa das áreas selecionadas para marcação de posição (Figura 5A).
      NOTA: Desta forma, mais de uma área pode ser selecionada no mesmo poço de um slide.
    4. Mude o canal para o canal de fluorescência para iniciar a imagem de fluorescência. Defina as configurações apropriadas de exposição (89,506 ms), ganho (10) e intensidade (136) (Figura 5A).
      NOTA: Esses parâmetros variam dependendo da intensidade de fluorescência das células que expressam a proteína fluorescente.
    5. Selecione um intervalo de pilha z de μm, defina as posições superior e inferior e configure a pilha z sob contraste de fase (Figura 5A). Clique em Parar para fechar a opção Ao vivo.
    6. Defina a duração (48 h) e o intervalo de tempo (30 min) usando os campos Duração e Intervalo de tempo para imagens de lapso de tempo.
    7. Clique em Iniciar para iniciar a geração de imagens por 48 h (Figura 5A). Salve o projeto após 48 h (Figura 5A).
    8. Em cada ponto de tempo (0 h e 48 h), selecione o melhor quadro da pilha z e exporte a imagem (Figura 5A).
    9. Conte as células GFP-positivas em 0 h e 48 h, calcule o aumento percentual nas células GFP-positivas e analise os dados usando um programa de software apropriado (Figura 1D, E).
  7. Gerando filme
    1. Clique em Mostrar Galeria para exibir todas as imagens capturadas organizadas por pontos de tempo e camadas de pilha z (Figura 5B).
    2. Para cada ponto de tempo, clique com o botão direito do mouse na imagem com melhor foco da pilha z correspondente e selecione Selecionar miniaturas em uma linha. Salve os quadros selecionados (Figura 5B).
    3. Repita esse processo individualmente para cada posição. Para ajudar na seleção das imagens mais focadas, use a função Localizar melhores quadros focados. Salve as imagens selecionadas por meio da opção Salvar quadros selecionados. As imagens salvas são carregadas automaticamente na seção Abrir projeto.
    4. Clique com o botão direito do mouse no filme e selecione Exportar imagem quando as sequências de imagens estiverem totalmente carregadas.
    5. Navegue até a guia Filme na janela de exportação, defina a taxa de quadros desejada (quadros por segundo), selecione opções adicionais, como barra de escala, carimbo de data/hora, etc., se necessário, e finalize a exportação escolhendo um destino usando a opção Procurar (Figura 5B, Vídeo 1, Vídeo 2 e Vídeo 3).

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Resultados

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Este conjunto representativo de experimentos investigou os efeitos potenciais do fenótipo secretor associado à senescência derivado de células cancerígenas senescentes em outras células cancerígenas. Portanto, foi confirmado pela primeira vez se o tratamento com doxorrubicina por 72 h poderia induzir senescência em células HeLa usando a coloração SA-β-Gal. Em células senescentes, a enzima lisossômica β-galactosidase permanece ativa mesmo em pH baixo e cliva o substrato cromogênico X-gal, formando um precipitado azul

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Discussão

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As interações dinâmicas das células cancerígenas em seu microambiente são cruciais para a progressão do tumor, o que influencia a indução de metástases e o desenvolvimento de um tumor secundário. Também é relatado que o câncer senescente e as células estromais regulam os microambientes tumorais por meio dos fatores secretados pelas células senescentes4. Esses fatores estimulam a proliferação, migração, invasão, diferenciação celular e aumentam a resistência a múlt...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pela Unidade de Projetos Científicos da Universidade de Gazi (código de concessão: TOA-2021-7321) e TUBITAK (código de concessão: 122S564 e 223S969).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
µ-Slide 8 Bem altofigure-materials-1bidi80806
0,05% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25300-054
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
Incubadora CO2 (37° C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controlador 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorrubicinaTocris2252
E-plate INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Células HeLafigure-materials-2AP Institute, Ancara, TurquiaHÜ KÜ K Nº: 90061901 
Microscópio de fluorescência invertida Leica DMi8  Leica
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco70011-044
kit de coloração β-galactosidase (SA-β-gal) associada à senescência  Sinalização de Celular9860S
Sistema de incubação no topo do estádioPecon 
Controlador de temperatura 2002-2 Pecon 
Corante Tripan AzulSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
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  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
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  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

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