Revelando a modificação da fosforilação usando eletroforese em gel Phos-tag SDS-PAGE e ensaio de quinase in vitro

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos para detectar alterações nas modificações de fosforilação de proteínas-alvo usando eletroforese em gel Phos-tag em amostras clínicas e ensaios de quinase in vitro .

Resumo

A fosforilação é uma modificação pós-traducional clássica que regula a função da proteína. As proteínas normalmente contêm vários locais potenciais de fosforilação, que podem ser modificados por várias quinases em diferentes locais. O estudo das alterações de fosforilação de proteínas-alvo na doença geralmente requer anticorpos fosfo-específicos. No entanto, as opções comerciais podem ser limitadas a um único local ou totalmente indisponíveis. Aqui, é descrito um método para detectar alterações nas modificações de fosforilação de proteínas-alvo em amostras clínicas usando a eletroforese em gel Phos-tag e para identificar locais de fosforilação detalhados por meio de ensaios de quinase in vitro . As proteínas fosforiladas ligadas ao Phos-tag exibem taxas de migração mais lentas na eletroforese em gel SDS-PAGE, permitindo a análise semiquantitativa das alterações de fosforilação nos tecidos da doença com base na intensidade média de pixels das bandas de migração lenta. Ao combinar Phos-tag SDS-PAGE com immunoblotting usando anticorpos pan-específicos contra várias proteínas candidatas, os pesquisadores podem identificar eficientemente proteínas-alvo com alterações de fosforilação. Após a triagem de quinases candidatas, ensaios de quinase in vitro são realizados com a proteína alvo e os produtos fosforilados resultantes são submetidos a espectrometria de massa para identificação precisa do local. Este método não requer anticorpos específicos de proteínas fosforiladas, permitindo a triagem em larga escala de amostras de tecido para identificar estados de fosforilação alterados na doença. Além disso, os locais de fosforilação identificados podem ser usados para desenvolver anticorpos específicos para análise quantitativa e de localização em tecidos patológicos, fornecendo insights mais profundos sobre seus papéis funcionais.

Introdução

A fosforilação é uma modificação pós-traducional chave para modular a localização subcelular, a atividade da quinase e a atividade transcricional das proteínas. Mais de 500 genes de proteína quinase foram encontrados no genoma humano, que estão envolvidos na transdução de sinal, expressão gênica e interação proteína-proteína¹. A fosforilação e a desfosforilação estão sob o controle de várias quinases, que são rapidamente reversíveis para regular a adesão celular, a proliferação celular e a diferenciação celular². No entanto, modificações anormais de fosforilação de proteínas são responsáveis por muitas doenças humanas, incluindo tumorigênese, distúrbios autoimunes, neurodegeneração e subfertilidade ^3,4,5.

O perfil fosfoproteômico de amostras clínicas produz múltiplas proteínas candidatas diferencialmente fosforiladas⁶. Para revelar as principais modificações de fosforilação em doenças humanas, é necessário um método fácil e eficiente para detectar o status de fosforilação de proteínas-alvo específicas. A fosforilação em diferentes locais pode levar a alterações funcionais distintas na proteína. Portanto, o uso de anticorpos específicos de fosforilação direcionados a locais específicos de aminoácidos é, sem dúvida, o melhor método para detectar alterações na fosforilação de proteínas. No entanto, anticorpos fosfo-específicos bem caracterizados estão ausentes para muitas proteínas. Além disso, é necessária uma abordagem mais adequada para identificar novos locais potenciais de fosforilação. A fosforilação em resíduos específicos de aminoácidos geralmente altera a taxa de migração de uma proteína na eletroforese em gel, e bandas de migração mais lenta podem refletir mudanças no status de fosforilação⁷. No entanto, essas mudanças de mobilidade geralmente são sutis, tornando-as difíceis de distinguir. Phos-tag é um composto químico sintetizado projetado a partir de um domínio catalítico de fosfatase alcalina como modelo, que pode capturar resíduos fosforilados de Ser/Thr/Tyr e His/Asp/Lys. Portanto, a conjugação fosforada amplifica efetivamente as diferenças de taxa de migração entre proteínas fosforiladas e não fosforiladas, ao mesmo tempo em que distingue variações no número de locais de fosforilação⁸.

Esta metodologia baseada em Phos-tag para detectar alterações de fosforilação de proteínas-alvo em amostras de tecido oferece vantagens distintas em relação às abordagens convencionais. Crucialmente, ele elimina a necessidade de anticorpos fosfo-específicos, em vez disso, utiliza anticorpos específicos de proteína de grau WB padrão para detecção. As formas fosforilada e não fosforilada das proteínas-alvo são resolvidas como bandas distintas durante o Phos-tag SDS-PAGE, permitindo a avaliação semiquantitativa das alterações do nível de fosforilação nos estados da doença por meio da análise comparativa da intensidade da banda. O fluxo de trabalho neste protocolo inclui: (1) separação Phos-tag SDS-PAGE de amostras de proteínas, (2) triagem imunoblot para alvos fosforilados, (3) ensaios de quinase in vitro com quinases candidatas verificadas por anticorpos fosfo-Ser/Thr. A análise subsequente de espectrometria de massa (conduzida por uma plataforma de serviço externa) identifica locais de fosforilação para permitir o desenvolvimento de anticorpos específicos do local; A metodologia detalhada não está incluída no protocolo atual. Notavelmente, esta abordagem foi aplicada com sucesso para detectar alterações de fosforilação de Nur77 em amostras clínicas, identificando Mst1 quinase como o regulador a montante da fosforilação de Nur77 e desenvolvendo um fosfo-anticorpo específico do local para detecção clínica de fosforilação na treonina 366 de Nur77⁹. Portanto, essa abordagem se mostra particularmente valiosa durante as fases preliminares de pesquisa ao investigar várias proteínas candidatas, pois permite a triagem em larga escala das alterações do status de fosforilação em vários alvos usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Protocolo

Os Conselhos de Revisão Institucional do Nanjing Drum Tower Hospital aprovaram a pesquisa em humanos (2013-408081-01). O protocolo atual é estabelecido usando o tecido endometrial como modelo representativo. Com a otimização adequada, essa metodologia pode ser estendida a outras amostras clínicas, incluindo, mas não se limitando a tecidos tumorais para extração de proteínas e análises subsequentes. A biópsia endometrial é realizada na fase secretora média de mulheres férteis (grupo controle) e mulheres com falha recorrente na implantação de embriões submetidas a fertilizaçãoin vitro-transferência de embriões (grupo doença). Todos os pacientes forneceram consentimento informado antes do procedimento de amostragem. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de amostras

1. Enxágue as amostras de tecido fresco obtidas duas vezes com PBS pré-resfriado para remover as células sanguíneas e separe aproximadamente 100 mg de tecido em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
2. Coloque o tecido em um tubo de moagem de fundo redondo de 2 mL contendo 1 mL de tampão de lise de proteína tecidual (150,0 mmol / L NaCl, 1,0% NP-40, 50,0 mmol / L Tris pH 8,0, 0,5% de desoxicolato de sódio, coquetel inibidor de protease e coquetel inibidor de fosfatase 2 e 3).
3. Defina a velocidade do dispersor de tecido de alta velocidade para o nível 5 (de 6 níveis) e triture o tecido por 10 s, seguido de 30 s de incubação no gelo. Repita este processo 5 vezes para obter o homogeneizado do tecido.
4. Lisar o homogenato por rotação lenta num agitador a 4 °C durante 30 min, centrifugar a 4 °C e 13 000 × g durante 10 min e recolher o sobrenadante.
5. Determine a concentração de proteína usando o método BCA.
6. Pegue um total de 300 μg de proteína, ajuste para um volume igual e misture com 4× Tampão de amostra de proteína Laemmli. Desnature a mistura aquecendo-a a 95 °C por 8 min, resfriando-a à temperatura ambiente e carregando-a para análise posterior.
   NOTA: Antes da etapa 2, as análises convencionais de Western blotting são recomendadas para detectar a proteína de interesse usando anticorpos totais para avaliar os níveis de expressão.

2. Preparação em gel do gel Phos-tag SDS-PAGE

1. Prepare 100 mL de solução mista de acrilamida a 30% p/v de N, N'-metileno-bisacrilamida adicionando 29,0 g de acrilamida e 1,0 g de N, N'-metileno-bisacrilamida.
   NOTA: Manter a 4 °C no escuro.
2. Prepare a solução de Tris-HCl 1,5 mol/L (pH 8,8), a solução de Tris-HCl 0,5 mol/L (pH 6,8), a solução de SDS a 10% e a solução de persulfato de amônio a 10% como usado no SDS-PAGE convencional.
3. Prepare 5,0 mmol / L de solução de Phos-tag e 10 mmol / L de solução de MnCl₂ específica para o gel Phos-tag SDS-PAGE.
4. Preparar a solução de gel de resolução, no caso de preparação da solução de 10 ml com gel de poliacrilamida a 6 p/v% de solução de fos-tag a 50 μM e MnCl₁₀₀ μM 2, misturando 2 ml de solução mista de acrilamida/bis-acrilamida a 30% (p/v), 2,5 ml de solução de Tris/HCl a 1,5 mol/l (pH 8,8), 0,1 ml de solução de fos-tag a 5,0 mmol/l, 0,1 mL de solução de MnCl₂ a 10 mmol/L, solução de SDS a 0,1 mL a 10% (p/v), 10 μL de TEMED e 5,14 mL de água destilada.
5. Agite suavemente a solução de gel de resolução preparada para garantir a homogeneidade, depois coloque o tubo de solução de gel em um dessecador a vácuo e aplique um vácuo (0.1 MPa) por 2 min até que não haja bolhas visíveis.
6. Adicione 50 μL de persulfato de amônio a 10% e misture delicadamente, mas completamente.
7. Pipete imediatamente a solução para o de gel montado até atingir ~ 1 cm abaixo da borda superior da placa curta. Evite introduzir bolhas.
8. Coloque cuidadosamente 0,5 mL de água destilada em cima do gel para excluir o ar e garantir uma interface plana. Deixe a polimerização em temperatura ambiente por 20-30 min.
9. Ao mesmo tempo, prepare uma solução de gel de empilhamento tamponada Tris-HCl padrão (4,5% p / v gel de poliacrilamida) misturando 0,6 mL de solução mista de acrilamida / bis-acrilamida a 30% (p / v), 1 mL de solução Tris-HCl 0,5 mol / L (pH 6,8), 40 μL de solução SDS a 10% (p / v), 4 μL TEMED e 2,33 mL de água destilada. Suavemente vórtice e desgaseificação.
10. Certifique-se de que o gel esteja completamente solidificado (incline o de gel para observar a inclinação da camada líquida superior enquanto confirma a imobilidade da interface intermediária). Despeje cuidadosamente a camada de água e escorra completamente.
11. Adicione 20 μL de persulfato de amônio a 10% na solução de gel de empilhamento preparada, misture delicadamente e pipete imediatamente sobre o gel de resolução.
12. Coloque cuidadosamente um pente de 10 ou 15 poços na solução de gel de empilhamento, evitando bolhas. Deixe o gel de empilhamento polimerizar em temperatura ambiente por 10 min.
    NOTA: Sempre prepare o gel antes de usar. Por favor, otimize as concentrações de Phos-tagged e acrilamida para cada proteína de interesse.

3. Eletroforese de Phos-tag SDS-PAGE

1. Monte o equipamento de eletroforese e encha as câmaras dos eletrodos com o tampão de corrida Tris/Glicina/SDS convencional.
2. Carregar 30 μg de proteína em cada alvéolo utilizando uma micropipeta.
3. Realize eletroforese sob condições de corrente constante (30 mA/gel) até que o azul de bromofenol atinja o fundo do gel de resolução.
4. Mergulhe os géis em tampão de transferência SDS-PAGE sem metanol com 5 mM de EDTA por 10 min duas vezes para remover cátions bivalentes.
5. Transfira as proteínas para a membrana de PVDF a 90 V por 90 min usando sistemas de absorção úmida / tanque de manchas.

4. Immunoblotting e análise

1. Obstruir a membrana com uma solução a 5% de leite desnatado ou de albumina de soro bovino em pó (diluído em solução 1×Tris-Borato-Sódica Tween-20, TBST) à temperatura ambiente durante 1 h.
2. Diluir o anticorpo primário contra a proteína-alvo com uma proporção adequada e incubar com a membrana a 4 °C durante a noite.
3. Lave a membrana 3 vezes com TBST, 10 min por lavagem, em temperatura ambiente com agitação suave.
4. Incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado com HRP à temperatura ambiente durante 1 h.
5. Lave a membrana 3 vezes com TBST, 10 min por lavagem, em temperatura ambiente com agitação suave.
6. Incubar com o substrato de quimioluminescência aprimorado no escuro por 1 min, seguido de exposição.
7. Capture as imagens usando um sistema automatizado de documentação de gel e quantifique as bandas-alvo (proteína-alvo fosforilada de migração lenta e proteína-alvo não fosforilada de migração rápida) para intensidade em escala de cinza usando o software ImageJ.
   NOTA: Western blots de géis Phos-Tag não podem ser usados para fazer atribuições de peso molecular.
8. Calcule a proporção de bandas fosforiladas de migração lenta para bandas não fosforiladas de migração rápida para cada amostra e analise a diferença estatística da porcentagem de fosforilação entre os grupos.

5. Imunoprecipitação da proteína alvo

1. Construa plasmídeos de expressão que codificam marcadores de epítopos marcados com FLAG (ou marcadores de epítopos alternativos, incluindo, mas não se limitando a HA, GFP, GST ou His) fosfo-mutantes de tipo selvagem ou específicos do local da proteína-alvo.
2. Transfectar células HEK293 com plasmídeos de expressão usando Lipofectamine 3000 de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Lise as células em 1 mL de tampão de lise de proteína tecidual conforme descrito na etapa 1 para extrair o sobrenadante da proteína.
4. Incubar o sobrenadante com 20 μL de gel de afinidade Anti-FLAG M2 durante a noite a 4 °C com rotação.
5. Centrifugue (1000 × g, 3 min), colete grânulos de agarose e lave com 10 volumes de coluna de TBS para remover proteínas ligadas não especificamente.
6. Dissolver o peptídeo FLAG em TBS até uma concentração final de 100 μg/ml.
7. Eluir a proteína de fusão FLAG ligada do gel de afinidade anti-FLAG M2 por eluição competitiva com cinco volumes de uma coluna de solução de peptídeo FLAG (use 100 μL de solução para grânulos de agarose de 20 μL) por 5-10 min com mistura suave.
8. Centrifugar (1000 × g, 3 min) e recolher o sobrenadante.
   NOTA: Se a quinase for conhecida, prossiga para a etapa 6; caso contrário, primeiro identifique quinases potenciais por meio de triagem de dois híbridos de levedura ou previsão de bioinformática (por exemplo, usando PhosphositePlus ou Group-based Prediction System) antes de continuar para a etapa 6.

6. Ensaio de quinase in vitro para identificar aminoácidos fosforilados

1. Prepare tampão quinase (30 μL por reação): 40 mM HEPES pH7,6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-glicerofosfato, 200 μM ATP, 100 ng de quinase ativa, proteína de fusão FLAG imunoprecipitada.
2. Incubar a 30 °C durante 30 min num termomixer com agitação suave.
3. Pare as reações adicionando 10 μL de tampão 4× Laemmli e desnature a 95 °C por 5 min.
4. Realize eletroforese SDS-PAGE convencional usando proteína de fusão FLAG imunoprecipitada reagida com ou sem quinase ativa.
5. Sonda com anticorpo anti-fosfo-Thr e anticorpo anti-fosfo-Ser para identificar aminoácidos fosforilados. Sonda com anticorpo Anti-Flag como controle (consulte a Tabela de Materiais).
6. Conclua o immunoblotting e a análise conforme descrito na etapa 4.

Resultados

O perfil fosfoproteômico preliminar de amostras humanas do grupo controle e do grupo da doença identificou Nur77 como uma proteína fosforilada diferencialmente candidata. Para avaliar a eficácia do Phos-tag SDS-PAGE na detecção da fosforilação da proteína Nur77, foi realizado um experimento Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE. Após a extração total da proteína das amostras de tecido, 30 μg de proteína foram carregados e separados por eletroforese em gel de Mn²⁺-Phos-tag, seguida de transferência para a membrana ...

Discussão

A abordagem baseada em Phos-tag para detectar alterações de fosforilação de proteínas-alvo em tecidos clínicos oferece vantagens significativas para a pesquisa de fosforilação de proteínas. As proteínas fosforiladas exibem mobilidade eletroforética reduzida devido à ligação Phos-tag, permitindo a triagem de alto rendimento do status de fosforilação de proteínas candidatas sem a necessidade de anticorpos fosfo-específicos. Isso é particularmente valioso para o perfil inicial em larga esca...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução SDS 10%	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glicina/SDS	BIO-RAD
4&vezes;   Tampão de amostra de proteína Laemmli	BIO-RAD	1610747
Acrilamida	Sangon Biotech	A601032
Persulfato de amônio	Sangon Biotech	A100486
Anti-FLAG M2 gel de afinidade	Millipore	A2220
Kit de quimioluminescência aprimorada	ThermoFisher	32106
FLAG anticorpo	CST	14793
BANDEIRA  Peptídeo	Millipore	F3290
Anticorpo secundário conjugado com HRP	Bioworld Technology	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cell	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	BIO-RAD	1658005
Mst1 anticorpo	CST	3682
N, N'-metileno-bisacrilamida	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina(TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 anticorpo	CST	3960
Inibidor de Fosfatase Coquetel 2	Sigma	P5726	Para a inibição de proteínas tirosina fosfatases, ácido e fosfatases alcalinas
Coquetel de inibidor de fosfatase 3	Sigma	P0044	Para a inibição da proteína fosfatase 2A, fosfatases alcalinas, fosfatases proteicas 1 e 2A
Anticorpo de fosfosserina	Sigma	P5747
Anticorpo de fosfotreonina	Sigma	P6623
Fos-tag, Acrilamida	Wako	304-93526	Para a preparação de Phos-tag Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce da SDS PAGE
	gel Thermo	23227
Inibidor de Protease Cocktail	Sigma	S8830	Livre de EDTA, comprimido, para a inibição de serina, cisteína, aspártico e metaloproteases
membrana PVDF	Dispersor
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
	IKA	T 10	Para obter homogeneizado de tecido
Tampão Tris-HCl (0,5M, pH 6,8)	Tampão Sangon Biotech	B546020
Tris-HCl (1,5M, pH 8,8)	Sangon Biotech	B546019
	ThermoFisher	5311-0250	Para desgaseificar a solução em gel
β-Mercaptoetanol	Sigma	M3148