Este protocolo descreve procedimentos para detectar alterações nas modificações de fosforilação de proteínas-alvo usando eletroforese em gel Phos-tag em amostras clínicas e ensaios de quinase in vitro .
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Artigo de método
Este protocolo descreve procedimentos para detectar alterações nas modificações de fosforilação de proteínas-alvo usando eletroforese em gel Phos-tag em amostras clínicas e ensaios de quinase in vitro .
A fosforilação é uma modificação pós-traducional clássica que regula a função da proteína. As proteínas normalmente contêm vários locais potenciais de fosforilação, que podem ser modificados por várias quinases em diferentes locais. O estudo das alterações de fosforilação de proteínas-alvo na doença geralmente requer anticorpos fosfo-específicos. No entanto, as opções comerciais podem ser limitadas a um único local ou totalmente indisponíveis. Aqui, é descrito um método para detectar alterações nas modificações de fosforilação de proteínas-alvo em amostras clínicas usando a eletroforese em gel Phos-tag e para identificar locais de fosforilação detalhados por meio de ensaios de quinase in vitro . As proteínas fosforiladas ligadas ao Phos-tag exibem taxas de migração mais lentas na eletroforese em gel SDS-PAGE, permitindo a análise semiquantitativa das alterações de fosforilação nos tecidos da doença com base na intensidade média de pixels das bandas de migração lenta. Ao combinar Phos-tag SDS-PAGE com immunoblotting usando anticorpos pan-específicos contra várias proteínas candidatas, os pesquisadores podem identificar eficientemente proteínas-alvo com alterações de fosforilação. Após a triagem de quinases candidatas, ensaios de quinase in vitro são realizados com a proteína alvo e os produtos fosforilados resultantes são submetidos a espectrometria de massa para identificação precisa do local. Este método não requer anticorpos específicos de proteínas fosforiladas, permitindo a triagem em larga escala de amostras de tecido para identificar estados de fosforilação alterados na doença. Além disso, os locais de fosforilação identificados podem ser usados para desenvolver anticorpos específicos para análise quantitativa e de localização em tecidos patológicos, fornecendo insights mais profundos sobre seus papéis funcionais.
A fosforilação é uma modificação pós-traducional chave para modular a localização subcelular, a atividade da quinase e a atividade transcricional das proteínas. Mais de 500 genes de proteína quinase foram encontrados no genoma humano, que estão envolvidos na transdução de sinal, expressão gênica e interação proteína-proteína1. A fosforilação e a desfosforilação estão sob o controle de várias quinases, que são rapidamente reversíveis para regular a adesão celular, a proliferação celular e a diferenciação celular2. No entanto, modificações anormais de fosforilação de proteínas são responsá....
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Os Conselhos de Revisão Institucional do Nanjing Drum Tower Hospital aprovaram a pesquisa em humanos (2013-408081-01). O protocolo atual é estabelecido usando o tecido endometrial como modelo representativo. Com a otimização adequada, essa metodologia pode ser estendida a outras amostras clínicas, incluindo, mas não se limitando a tecidos tumorais para extração de proteínas e análises subsequentes. A biópsia endometrial é realizada na fase secretora média de mulheres férteis (grupo controle) e mulheres com falha recorrente na implantação de embriões submetidas a fertilizaçãoin vitro-transferência de embriões (grupo doença). T....
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O perfil fosfoproteômico preliminar de amostras humanas do grupo controle e do grupo da doença identificou Nur77 como uma proteína fosforilada diferencialmente candidata. Para avaliar a eficácia do Phos-tag SDS-PAGE na detecção da fosforilação da proteína Nur77, foi realizado um experimento Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE. Após a extração total da proteína das amostras de tecido, 30 μg de proteína foram carregados e separados por eletroforese em gel de Mn2+-Phos-tag, seguida de transferência para a membrana .......
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A abordagem baseada em Phos-tag para detectar alterações de fosforilação de proteínas-alvo em tecidos clínicos oferece vantagens significativas para a pesquisa de fosforilação de proteínas. As proteínas fosforiladas exibem mobilidade eletroforética reduzida devido à ligação Phos-tag, permitindo a triagem de alto rendimento do status de fosforilação de proteínas candidatas sem a necessidade de anticorpos fosfo-específicos. Isso é particularmente valioso para o perfil inicial em larga esca.......
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Os autores declaram não haver potenciais conflitos de interesse.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82271698) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (BK20231117).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução SDS 10% | Sangon Biotech | B548118 | |
| 10x Tris/Glicina/SDS | BIO-RAD | ||
| 4&vezes; Tampão de amostra de proteína Laemmli | BIO-RAD | 1610747 | |
| Acrilamida | Sangon Biotech | A601032 | |
| Persulfato de amônio | Sangon Biotech | A100486 | |
| Anti-FLAG M2 gel de afinidade | Millipore | A2220 | |
| Kit de quimioluminescência aprimorada | ThermoFisher | 32106 | |
| FLAG anticorpo | CST | 14793 | |
| BANDEIRA Peptídeo | Millipore | F3290 | |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP | Bioworld Technology | BS13278 | |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BIO-RAD | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 1658005 | |
| Mst1 anticorpo | CST | 3682 | |
| N, N'-metileno-bisacrilamida | Sangon Biotech | A600025 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina(TEMED) | Sangon Biotech | A610508 | |
| Nur77 anticorpo | CST | 3960 | |
| Inibidor de Fosfatase Coquetel 2 | Sigma | P5726 | Para a inibição de proteínas tirosina fosfatases, ácido e fosfatases alcalinas |
| Coquetel de inibidor de fosfatase 3 | Sigma | P0044 | Para a inibição da proteína fosfatase 2A, fosfatases alcalinas, fosfatases proteicas 1 e 2A |
| Anticorpo de fosfosserina | Sigma | P5747 | |
| Anticorpo de fosfotreonina | Sigma | P6623 | |
| Fos-tag, Acrilamida | Wako | 304-93526 | Para a preparação de Phos-tag Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce da SDS PAGE |
| gel Thermo | 23227 | ||
| Inibidor de Protease Cocktail | Sigma | S8830 | Livre de EDTA, comprimido, para a inibição de serina, cisteína, aspártico e metaloproteases |
| membrana PVDF | Dispersor | ||
| ThermoMixer | Eppendorf | 2231001127 | |
| IKA | T 10 | Para obter homogeneizado de tecido | |
| Tampão Tris-HCl (0,5M, pH 6,8) | Tampão Sangon Biotech | B546020 | |
| Tris-HCl (1,5M, pH 8,8) | Sangon Biotech | B546019 | |
| ThermoFisher | 5311-0250 | Para desgaseificar a solução em gel | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma | M3148 |
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