Method Article

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Abstract

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As células eucarióticas seguem um ciclo celular conservado que regula diversos processos, incluindo a manutenção do DNA e a homeostase das organelas. Estudar os processos celulares de maneira dependente do ciclo celular é frequentemente necessário para interpretar adequadamente os resultados experimentais. Existem métodos químicos e genéticos disponíveis para produzir a sincronização do ciclo celular em células cultivadas em uma ampla faixa de organismos, incluindo modelos de vertebrados, permitindo o estudo de processos dependentes do ciclo celular. No entanto, entre os organismos modelo, a levedura em brotamento continua sendo uma potência para a análise do ciclo celular devido aos seus métodos de sincronização particularmente robustos, curto tempo de geração e tratabilidade genética. A levedura compartilha a maquinaria central do ciclo celular com outros eucariotos, o que permitiu descobertas marcantes na regulação do ciclo celular. Este protocolo detalha métodos para análise do ciclo celular em leveduras, com foco em experimentos de liberação de parada G1 e liberação de parada mitótica, incluindo construção de cepas, preparação de cultura e microscopia. São apresentados métodos de marcação por PCR para a produção de cepas adequadas para paradas do ciclo celular e microscopia de fluorescência. Uma parada G1 é obtida usando o fator de α de feromônio peptídico, e breves lavagens resultam em liberação síncrona e progressão do ciclo celular. As amostras são coletadas em diferentes momentos após a liberação no ciclo celular e fixadas para microscopia. Um segundo método interrompe as células de levedura na mitose, esgotando o regulador do ciclo celular Cdc20 para atingir uma população parada por metáfase, bem como a liberação opcional na anáfase. As amostras são fixadas e preparadas para imagens pré e pós-liberação, e são fotografadas e analisadas. A análise de imagens se concentra na catalogação da localização dinâmica e nas mudanças na abundância populacional de proteínas no ciclo celular. Esses métodos de sincronização são adequados para diversas manipulações do ciclo celular e, embora seu uso na imagem de células fixas seja destacado aqui, eles podem ser adaptados para muitas outras análises, incluindo imagens de células vivas, bem como ensaios bioquímicos e moleculares.

Introduction

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A divisão celular eucariótica é altamente regulada por meio de um programa chamado ciclo celular. Os processos altamente conservados e dinâmicos que ocorrem no ciclo celular tornam interessante o estudo por si só, mas também têm implicações generalizadas que informam as investigações de outros processos biológicos celulares - por exemplo, muitas organelas sofrem remodelação dramática durante a divisão celular, e a abundância e localização de muitas proteínas é altamente reguladaao longo 1,2,3. Embora existam algumas camadas adicionais de complexidade presentes nos sistemas de metazoários em comparação com a levedura, incluindo mais variedade de quinases e proteínas reguladoras, bem como entrada adicional de sinalização externa em metazoários, a divisão celular é em geral muito bem conservada em todos os eucariotos 4,5. Muito trabalho fundamental estabelecendo insights importantes sobre a progressão do ciclo celular e etapas regulatórias cruciais foi feito em leveduras, e continua sendo um organismo extremamente atraente para estudar questões relacionadas ao ciclo celular por uma infinidade de razões 6,7. O principal deles é a ampla gama de métodos disponíveis para manipular o ciclo celular, permitindo a parada em vários estágios e a sincronização das células. As vantagens adicionais incluem o ciclo celular curto da levedura (~ 90-150 min, dependendo da temperatura e das condições do meio), a facilidade de manipulação genética e a grande variedade de alelos condicionais que permitem o estudo em um contexto de tipo selvagem.

A progressão através das diferentes fases do ciclo celular é impulsionada pela atividade de várias quinases importantes, incluindo a onipresente quinase dependente de ciclina (Cdk), a quinase semelhante à Polo e as quinases Aurora. Os pontos de verificação do ciclo celular regulam a progressão ao longo do ciclo celular, garantindo que as células não progridam para o próximo estágio de divisão, a menos que condições específicas sejam atendidas 8,9. Esses pontos de verificação e as transições que eles regulam podem ser sequestrados pelos pesquisadores para obter uma parada de longo prazo ou uma parada transitória e liberação para sincronizar uma população de células (Figura 1). Por exemplo, o ponto de verificação de compromisso do ciclo celular (ponto de restrição ou início em levedura) garante que a célula tenha nutrientes suficientes para se comprometer com a divisão antes de iniciar a replicação do DNA10. Este ponto de verificação pode ser manipulado em levedura haploide para obter uma parada G1, aproveitando o programa de acasalamento de levedura que interage com o ciclo celular. Na levedura de padeiro (Saccharomyces cerevisiae), as células haplóides têm um dos dois tipos de acasalamento, MATa ou MATα, que é geneticamente determinado por um locus do tipo de acasalamento. A levedura de um tipo de acasalamento é sensível ao feromônio de acasalamento do outro tipo de acasalamento e responde ativando uma cascata de sinalização MAP quinase que, em última análise, fosforila e estabiliza o inibidor de Cdk Far1, que impede a entrada no ciclo celular ligando-se ao complexo Cln1/2-Cdk e bloqueando sua atividade 11,12,13. As células que respondem aos feromônios de acasalamento podem ser determinadas visualmente pela presença de uma projeção de acasalamento ou shmoo (Figura 1). Assim, o fator α sintetizado quimicamente pode ser adicionado a culturas de células MATa para obter uma parada G1. Outra transição do ciclo celular que os pesquisadores podem direcionar para sincronizar as células de levedura é a transição de metáfase para anáfase. Durante a mitose, o Spindle Assembly Checkpoint (SAC) monitora a ligação dos cinetocoros aos microtúbulos e inibe o complexo promotor de anáfase/ciclossomo (APC/C) sequestrando seu ativador, Cdc20, quando cinetocoros não ligados são detectados. O APC/C é um complexo E3 ligase essencial para a entrada na anáfase. Quando o SAC é satisfeito, o Cdc20 liga-se ao APC/C, e o APC/C ubiquitina várias proteínas, principalmente a securina e a ciclina B, que as direcionam para degradação, e promove a segregação cromossômica e a saída mitótica14,15. Embora o próprio Cdc20 não seja um componente do SAC, sua inibição é o alvo da ativação do SAC; portanto, a depleção induzível de Cdc20 pode ser aproveitada para interromper uma cultura de levedura em metáfase (Figura 1)16.

Este protocolo engloba dois métodos de manipulação do ciclo celular de levedura, bem como um exemplo de aplicação de cada método. No primeiro, o fator α é usado para prender as células em G1, seguido por uma etapa de lavagem para liberar as células da parada, resultando na reentrada síncrona do ciclo celular. As células sincronizadas continuarão durante todo o ciclo celular, permitindo que os pesquisadores rastreiem e estudem as células em cada estágio do ciclo celular. Neste método, a localização dinâmica de uma proteína de interesse marcada com GFP, Stu2, é monitorada por toda parte, e sua associação com o fuso mitótico é rastreada. Este método também aproveita um componente do corpo do pólo do fuso marcado (SPB), Spc110-mCherry, que permite medições do comprimento do fuso mitótico e é um excelente proxy para a progressão do ciclo celular17. Este método demonstra como a parada e liberação do ciclo celular permitem a sincronização de populações celulares, facilitando o estudo de uma proteína ou outro componente de interesse ao longo do ciclo celular.

No segundo método, uma parada mitótica é realizada por meio da depleção de Cdc20 usando um sistema de degron induzível por auxina (AID)18. Em células que expressam TIR1 (uma proteína F-box de origem vegetal), qualquer proteína com uma marca AID será ubiquitinada e degradada após a adição de auxina. Aqui, usamos um Cdc20 marcado com AID para permitir a degradação induzível de Cdc20, causando assim uma parada na metáfase. Esta população de células é então monitorada quanto ao recrutamento do componente SAC marcado Bub1-GFP para cinetocoros, usando a proteína cinetocoro marcada Mtw1-mCherry como marcador fiducial. Embora Bub1 desempenhe papéis independentes de SAC nos cinetocoros e se localize em cinetocoros no início da mitose, sua localização persistente do cinetócoro nas células presas sinaliza ligações inadequadas de cinetócoro-microtúbulo19. Mostramos isso tratando as células com o veneno dos microtúbulos, nocodazol, que interrompe as ligações cinetócoro-microtúbulos. Este experimento destaca como os processos específicos de uma fase distinta do ciclo celular podem ser estudados usando métodos de parada altamente ajustáveis. Demonstramos ainda que a auxina pode ser lavada das culturas cdc20-AID, permitindo a liberação na anáfase e a entrada em um novo ciclo celular, embora, em nossa experiência, essas culturas não sejam liberadas de forma tão síncrona quanto uma parada-liberação de α fatores. Esses dois métodos de liberação de parada são eficazes e fáceis de implementar, mas muitos outros métodos estão disponíveis para pesquisadores em leveduras para prender células em diferentes estágios do ciclo celular 20,21,22,23. Mais detalhes sobre esses métodos podem ser encontrados na Discussão.

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Protocol

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1. Construção de estirpes para análise e imagem do ciclo celular

  1. Projete primers para marcar C-terminalmente o gene de interesse usando plasmídeos de marcação Pringle (plasmídeos pFA6a) 24 . Em suma, projete primers F2 e R1 que, quando usados com um plasmídeo da série pFA6a, produzem um produto de PCR que pode ser transformado diretamente em levedura para gerar uma versão 'marcada' do gene de interesse. Use os pares de primers e plasmídeos contidos na Tabela 1 para marcar os genes de interesse neste protocolo. As estratégias de design de plasmídeo e primer para marcação C-terminal de genes de levedura são descritas em detalhes por Longtine et al.24.
    NOTA: Este método pode ser usado para produzir proteínas marcadas com fluorescência para imagens ou proteínas marcadas com Auxin Inducible Degron (AID) para facilitar a parada do ciclo celular e outros experimentos possibilitados pela degradação de uma proteína-alvo18. Por exemplo, para marcar CDC20 com a marca AID (IAA7), o primer de marcação direta consiste em 25-40 bases do gene CDC20 imediatamente antes do códon de parada, excluindo o códon STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), e também a sequência do adaptador Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') anexada à extremidade 3' para produzir a sequência final do primer (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). O primer de marcação CDC20 reverso contém o complemento reverso dos 25-40 pares de bases imediatamente após o códon STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTA 3') e a sequência do adaptador Pringle Plasmid R1 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') para produzir a sequência final do primer (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Também é importante observar que o uso de primers de PCR com menos de 40 pares de bases reduzirá a eficiência da integração no genoma da levedura.
  2. Diluir os primers em água de grau de biologia molecular a 10 μM.
  3. Realizar a PCR com o par de plasmídeos F2 e R1 e o plasmídeo de marcação adequado utilizando métodos normalizados, seguindo o programa termociclador contido no quadro 2, e confirmar a dimensão do produto da PCR por electroforese em gel de agarose.
  4. Inocule a cepa de levedura para transformar em 25 mL de cultura de extrato de levedura Peptona Adenina Dextrose (YPAD) e cresça durante a noite a 23 ° C. Para a construção de levedura cdc20-AID (que degradará Cdc20 após o tratamento com auxina), a cepa transformada pode já conter OsTIR1 expresso a partir de um locus ectópico, ou OsTIR1 pode ser cruzado em 18 posteriores.
  5. Na manhã seguinte, verifique o OD600 da cultura noturna. Se a cultura OD <2.0, prossiga para a etapa 1.6. Se OD > 2,0, dilua para ~ 0,2-0,4 e permita 2-3 ciclos de crescimento.
  6. Colha células em OD600 = ~ 0,4-2,0 para garantir que estejam na fase de crescimento logarítmico. Colha 5 ODs de células por transformação (por exemplo, 5 mL de OD600 = 1,0). Se estiver fazendo mais de uma transformação da mesma cepa, as células podem ser combinadas neste estágio. Colha as células centrifugando a 3.000 x g por 5 min a 23 °C.
  7. Rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento celular com 25 ml de água, seguido de centrifugação a 3.000 x g durante 5 min a 23 °C.
  8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de acetato de lítio (LiAc) 0,1 M e transfira para o(s) tubo(s) de 1,6 mL. Se estiver fazendo mais de uma transformação, divida a ressuspensão de 1 mL em vários tubos (por exemplo, para 2 transformações divididas 2x 500 μL; para 3 transformações divididas 3x 333 μL, etc.).
  9. Centrifugue as células a 1.000 x g por 2 min a 23 ° C e descarte o sobrenadante.
  10. Adicione o seguinte ao pellet celular (nesta ordem): i) 240 μL de PEG (50%), ii) 36 μL de 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg de DNA de esperma de salmão pré-fervido por 5 min, iv) 54 μL de água.
  11. Adicione 10 μL de produto de PCR (obtido na etapa 1.3) às células e vórtice por 1 min, garantindo que tudo esteja bem misturado.
  12. Incubar as células a 30 °C durante 30 minutos num tambor de rolos numa sala quente ou num termoagitador a 1000 rpm.
  13. Aquecer as células de choque a 42 °C durante 15 minutos em banho-maria.
    NOTA: O tempo ideal de choque térmico pode diferir dependendo do fundo da cepa de levedura. Este protocolo é otimizado para o fundo da cepa W303.
  14. Centrifugue as células a 1.000 x g por 2 min a 23 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente em 100 μL de água.
  15. Para transformações usando KanMX ou outra seleção de medicamentos, coloque as células em placas no YPAD e incube as placas a 23 ° C e, em seguida, repita a placa do medicamento no dia seguinte.
    NOTA: Permitir um dia de crescimento no YPAD é fundamental para permitir a expressão de genes de resistência a medicamentos em células transformadas.
  16. Para transformações usando marcadores auxotróficos (URA, HIS, etc.), células da placa diretamente em meio seletivo.
  17. Incubar as placas a 23 °C durante 3 dias para permitir o crescimento das colónias transformadoras de leveduras.
  18. Verificar a marcação correcta do gene por PCR genómica ou por western blotting. Esses métodos são descritos em detalhes por Burnette25 e Chu et al26.
    NOTA: Para a produção de cepas com vários alelos marcados, a transformação repetida não é recomendada sem retrocruzamento, pois a transformação pode ser um processo mutagênico. Para produzir a cepa contendo Stu2-GFP e Spc110-mCherry, por exemplo, recomendamos transformar as cepas separadamente para produzir Stu2-GFP e Spc110-mCherry e, em seguida, combinar esses alelos em uma cepa haplóide por cruzamento de levedura, esporulação, dissecção de tétrade e análise genotípica. Mais informações sobre cruzamentos de leveduras estão disponíveis em Stansfield e Stark27 e Morin et al.28. Para realizar uma parada-liberação de α fatores, a cepa haplóide utilizada deve ser MATa.

2. Cultura de levedura e sincronização do ciclo celular: parada-liberação do fator de α

  1. Inocular a levedura em 25 mL de cultura YPAD durante a noite a 23 °C, para estar em OD600 = 0,5-2,0 na manhã seguinte.
    1. Se as células estiverem acima de OD600 = 2,0 pela manhã, dilua de volta para OD600 = 0,2-0,4 e deixe-as crescer por pelo menos 1 ciclo celular (2-3 h a 23 ° C).
  2. Dilua as células de volta para OD600 = 0,5 e adicione fator α a uma concentração final de 1 μg / mL (estoque de 10 mg / mL em DMSO). Idealmente, as células teriam uma mutação bar1 (por exemplo, bar1-1), o que as torna mais sensíveis ao fator α. As células do tipo selvagem BAR1 são menos sensíveis ao fator α e requerem uma concentração de fator α que é pelo menos uma ordem de magnitude maior para serem detidas adequadamente, o que é menos econômico.
  3. Às 2,5-3,5 h após a parada, verifique o grau de parada contando a porcentagem de células shmooed sem brotamento. Quando 90-95% das celas forem removidas (presas no G1), prossiga para a liberação. O tempo será diferente dependendo da cepa de levedura, meio de crescimento e temperatura.
  4. Libere as células da parada do fator de α girando na centrífuga a 3.000 x g por 3-5 min a 23 ° C e, em seguida, despejando o sobrenadante.
  5. Lave as células ressuspendendo o pellet em 25 mL de YPAD + 1% de DMSO.
  6. Repita as etapas 2.4-2.5 duas vezes para um total de três lavagens, trocando o tubo usado uma vez após a primeira lavagem.
  7. Adicione YPAD às células para trazer o volume final para 25 mL e transfira as células para um novo frasco.
    NOTA: O uso de um novo frasco é fundamental para eliminar vestígios de fator de α restante que podem impedir a liberação.
  8. Pegue o ponto de tempo (0 min) sample e corrija (consulte as instruções de fixação nas etapas 4.1 a 4.4).
  9. Continue coletando amostras pontuais a cada 15 minutos se o crescimento ocorrer a 23 ° C. Esse tempo mudará em outras temperaturas com base na rapidez com que as células crescem.
  10. No ponto de tempo 60 min, julgue a sincronia da liberação verificando se há pequenos botões uniformes (tamanho do botão < 25% do tamanho da célula-mãe) sob um microscópio óptico.
  11. Opcional) 60 min após a liberação, adicione α fator novamente a uma concentração final de 1 μg / mL para evitar a progressão para o próximo ciclo celular. Confirme a liberação celular síncrona verificando a morfologia uniforme de pequenos brotos antes da adição.
  12. Continue coletando amostras de pontos de tempo por até 180 min, ou pelo tempo que desejar. A 23 °C, a metáfase ocorre ~ 45-60 min após a liberação, a anáfase ocorre ~ 60-90 min após a liberação e a maioria das células estará no novo G1 120 min após a liberação.

3. Cultura de levedura e sincronização do ciclo celular: Liberação de parada de depleção Cdc20

  1. Inocular uma cultura de levedura durante a noite a 23 °C para obter um OD600 = 0,5-2,0 na manhã seguinte.
    1. Se as células estiverem acima de OD600 = 2,0 na manhã seguinte, dilua de volta para OD600 = 0,2-0,4 e deixe-as crescer por pelo menos 1 ciclo celular (2-3 h a 23 ° C).
  2. Diluir de volta para OD600 = 0,5 e adicionar auxina a uma concentração final de 500 μM de estoque 1 M (500x) para todas as culturas. Para culturas que recebem outros medicamentos (nocodazol), adicione-os simultaneamente com auxina na concentração apropriada (por exemplo,., ~ 10 μg / mL de nocodazol).
  3. 2 h após a parada, verifique o grau de parada contando a porcentagem de células com botões grandes (botões grandes é determinado como a presença de botões > 25% do tamanho da célula-mãe). Quando 90-95% das células são interrompidas na mitose, prossiga para coletar amostras ou liberar células da parada, dependendo da aplicação experimental. Se 90% das células não forem interrompidas, permita que a cultura continue crescendo e verifique-a a cada 15-30 minutos. O tempo será diferente dependendo da cepa de levedura, meio de crescimento e temperatura.
    NOTA: Não é aconselhável permitir que as paradas prossigam por muito tempo (mais de 4 h) se forem liberadas, pois paradas prolongadas podem reduzir a viabilidade celular.
  4. Para liberar da parada de depleção de Cdc20, colha a cultura por centrifugação a 3000 x g por 3-5 min a 23 °C.
  5. Lave as células ressuspendendo o pellet em 25 mL de YPAD + 1% de DMSO e, em seguida, colhendo por centrifugação a 3.000 x g por 3-5 min a 23 ° C.
  6. Repita as etapas 3.4-3.5 para um total de 2 lavagens.
  7. Adicione YPAD às células para trazer o volume final para 25 mL e transfira as células para um novo frasco.
    NOTA: O uso de um novo frasco é fundamental para remover vestígios de auxina que podem impedir uma liberação.
  8. Pegue o ponto de tempo 0 e corrija (consulte as instruções de fixação nas etapas 4.1 a 4.4).
  9. Continue tomando pontos de tempo a cada 10-15 minutos para o comprimento desejado do curso de tempo. A 23 °C, a maioria das células teria se liberado da parada após 50-70 min.
    NOTA: As células não são liberadas de forma tão síncrona a partir desta parada de depleção Cdc20 quanto com a parada de fator α. No entanto, pode ser útil estudar anáfase ou eventos de saída mitóticos. Além disso, uma limitação técnica dessa parada-liberação é que, em momentos posteriores após a liberação, é mais difícil diferenciar entre células metafásicas que ainda não foram liberadas e as células que foram liberadas anteriormente e atingiram a metáfase de seu próximo ciclo celular. Se necessário, isso pode ser superado fazendo imagens de células vivas para rastrear células individuais à medida que elas se liberam da parada ou adicionando fator de α à cultura (supondo que as células sejam MATa) para prender as células em G1 após a saída mitótica.

4. Fixação de levedura

  1. Centrifugue 1 mL (ou 0,5-1,5 ODs) de cultura por 1 min na velocidade máxima (~ 20.000 x g) a 23 ° C.
  2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de solução fixadora (formaldeído a 3,7% em fosfato de potássio (KPi) 0,1 M pH 6,4).
  3. Incube as células na solução fixadora por 2-15 min a
    23 °C. Para experimentos de curso de tempo, geralmente é aconselhável fixar as células por 15 minutos para alinhar o tempo de centrifugação das células ao coletar amostras.
    NOTA: O tempo de fixação deve ser otimizado para fluoróforos e proteínas de interesse específicos.
  4. Centrifugue as células por 1 min na velocidade máxima a 23 ° C, aspire o sobrenadante e ressuspenda em 500 μL de KPi 0,1 M (pH 6,4). As células em KPi podem ser armazenadas a 4 °C até que estejam prontas para a imagem.
    NOTA: O sinal de fluorescência da célula fixa pode durar até 2 semanas, dependendo do fluoróforo, no entanto, para quantificação de sinais fluorescentes, colete imagens em até 7 dias.

5. Preparando slides para imagens

  1. Quando preparado para obter imagens, centrifugue as células por 1 min na velocidade máxima a 23 ° C e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 10-100 μL de solução de Triton/DAPI/sorbitol (1,2 M de sorbitol, 1% de triton, 0,1 M de KPi, pH 7,5, 2 μg/mL de DAPI).
  2. Pipetar ~0,8 μL de células diretamente em uma lamínula limpa. Use uma ponta de pipeta para espalhar suavemente a gota celular em um círculo de aproximadamente 1 cm2 no centro da lamínula.
  3. Coloque a lamínula em uma lâmina de microscopia. Use um Kimwipe para pressionar suavemente ao redor da lâmina para distribuir a amostra.
  4. Sele as bordas da lamínula com esmalte.
  5. Opcionalmente, armazene em um local fresco e escuro por até 4-6 h antes da imagem para ajudar as células a se estabelecerem e evitar o excesso de movimento.

6. Exames de imagem

  1. Leve a lâmina para um microscópio equipado com uma objetiva de óleo 60x/1,42 e um conjunto de laser e filtro vermelho, verde, azul, vermelho distante. Objetivas de maior ampliação (até 100x) também podem ser usadas.
  2. Concentre o microscópio nas células de levedura aderidas à lamínula.
    NOTA: Se as células de levedura estiverem se movendo demais, as lâminas podem ser deixadas em um local fresco e escuro por 20 a 60 minutos para assentar.
  3. Quando o fermento estiver em foco, ajuste as configurações de exposição de cada canal para produzir uma relação sinal-ruído de pelo menos 3:1, garantindo que nenhum ponto fluorescente seja superexposto.
    NOTA: Por exemplo, em um sistema de imagem que usamos com uma câmera CMOS científica, usando objetiva 60x 550 e óleo de imersão com um índice de refração de n = 1,516, configurando o sinal máximo do canal vermelho para 1000-2000 UA, o canal verde para 3000 UA, o canal azul para 3000 UA e o canal DIC para 4000-5000 UA produz imagens de alta qualidade.
  4. Ajuste as configurações de aquisição para levar 14-20 pilhas Z de 0,2 μm para abranger um total de 2-4 μm.
  5. Para microscópios equipados com módulos de pós-processamento, selecione Deconvolução e Projeção rápida para cada pilha.
  6. Colete pilhas Z de células, tirando imagens suficientes para capturar ~ 100-200 células para cada condição ou ponto de tempo.
  7. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter instruções de software com capturas de tela do software de imagem.

7. Análise de imagem

  1. Abra as imagens projetadas no ImageJ e ajuste o brilho e o contraste para visualizar diferentes canais. Se o microscópio usado para imagens não tiver módulos de pós-processamento, execute a projeção máxima das pilhas Z neste estágio.
  2. Para determinar a progressão do ciclo celular, conte 100 células por ponto de tempo e classifique-as como contendo um ou dois núcleos. Como alternativa, calcule o comprimento do fuso ou a distância entre os corpos dos pólos do fuso para definir o estado do ciclo celular. A distância entre os focos de Spc110 < 1,5 μm corresponde às células metafásicas, e a distância > 1,5 μm corresponde às células anáfases.
  3. Para calcular as intensidades dos pontos de proteína (por exemplo, Stu2-GFP), use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar em torno do limite do sinal de interesse. Adicione este sinal ao gerenciador de ROI (Região de Interesse) pressionando T ou usando o Menu. No ROI Manager, selecione Measure para calcular a intensidade de cada ponto selecionado. Para visualizar as mudanças no sinal de pontuação ao longo do tempo, plote a intensidade média com intervalo de confiança de 95% em um gráfico de linhas para cada ponto de tempo.
  4. Para calcular a porcentagem de células com o ponto Bub1-GFP, certifique-se de que as configurações de brilho mínimo e máximo do canal verde sejam as mesmas em diferentes imagens. As células com um ponto Bub1-GFP mostrando sobreposição com um ponto Mtw1-mCherry são contadas como Bub1 localizado no cinetócoro; caso contrário, a célula é contada como negativa. Conte ~100 células por condição. Aravamudhan et al.29 contêm mais informações sobre a localização de Bub1 em cinetocoros.
  5. Para calcular a porcentagem de células mononucleares de brotos grandes, conte o número de células com um botão grande e um núcleo (um sinal DAPI) na população e divida pelo número total de células.
  6. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter as instruções do software com capturas de tela do software de imagem.

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Results

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A análise de mudanças na localização de proteínas dependentes do ciclo celular por microscopia de fluorescência pode ser prontamente realizada usando os métodos que descrevemos aqui. Nosso grupo há muito se interessa pela regulação dinâmica e função do fuso mitótico. Na levedura, os corpos dos pólos do fuso (marcados pelo componente Spc110) funcionam como centros organizadores de microtúbulos dos quais os filamentos de microtúbulos emanam para criar a est...

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Discussion

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A utilização da sincronização do ciclo celular em leveduras em brotamento permite estudar mecanismos importantes para uma variedade de processos celulares. O uso de liberações de parada G1 com tratamento com fator de α permite a progressão síncrona de uma população de células através dos estágios do ciclo celular e, como mostramos, pode revelar padrões dinâmicos de localização de reguladores celulares como Stu236. As paradas do ciclo celular também podem ser reali...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Núcleo de Imagens Celulares da Universidade de Utah por manter as instalações do microscópio Delta Vision. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do NIH F31CA2717405 (para MGS) e T32GM141848 (para MGS e TCS), 5 For the Fight (para MPM), Pew Biomedical Scholars (para MPM) e NIH grant R35GM142749 (para MPM).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-fatorInstalação de Síntese Núcleo da Universidade de UtahSequência: WHWLQLKPGQPMY
Válvulas Eppendorf de 1,5 mLAxygenMCT-175-C
Mistura 10mM dNTPTermo CientíficaR0193
Tubos cônicos de 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x Tampão de reação HF PhusionNew England BioLabsB0518S
Ácido acético, glacialFisher ChemicalBP2401C-212
Sal de hemissulfato de adeninaSigma-AldrichA9126-100G
Ágar, granuladoApex Chemicals and Reagents20-275
agaroseProdutos de Biopesquisa Apex20-102GP
Autoclave Amsco Century Steam SterilizadorSterisSV-1262
Água DI autoclavada
AuxinaSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratórios Cargille20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicricloreto)Sondas MolecularesCat#D1306
Ácido desoxirribonucleico sal de sódio proveniente dos testículos do salmãoSigma-AldrichD1626
DextroseFisher ChemicalD16-10
Tetraacetato de etilendiamina dissódicaFisher ChemicalS811-10
DMSOTermo Científica20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Misturador de Vórtice de Velocidade FixaVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscópio fluorescente DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerial #: NV01063. Não mais suportado
FormaldeídoFisher ChemicalCat#F79-500
Aparelho de gelTermo CientíficaOwl EasyCast B1
Mistura de Escada de DNA GeneRulerFermentasSM0333
Contas de vidroFisher Scientific11312A
Slides de vidroVWR48300-026
Agitador de Plataforma Innova 2300New brunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Centrífuga de laboratório para tubos de 1,5 mLEppendorf2525
Centrífuga de laboratório para tubos de 50 mLEppendorf5804
Diidrato de acetato de lítioSigma-AldrichL4158-250G
Mestre ciclista Nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micropipetas p2, p20, p200 e p1000 e pontas correspondentesRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vidro de Cobertura de MicroscópioFisher Scientific12541014
NocodazolCalbioquímicaCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lote#B35705
Orange GSigma-AldrichO7252
GANCHOPesquisa HamptonHR2-591
Peptona granulada Biorreagentes FisherBP9725-5
Polimerase de DNA HF PhusionNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Fosfato de potássio, dibásicoTermo Científica424195000
Fosfato de potássio, monobásicoTermo Científica424200025
Fonte de energiaBio-Rad23786
Comece a Adquirir Ultra 1.2.2softWoRx CytivaObtenha com DV Ultra
Tris BaseBiorreagentes FisherBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Rotador de tuboVWR10136-084
Banho-mariaVWRWBE10A11B
Água, Ultra PuraProdutos de Biopesquisa Apex18-194
Extrato de levedura granuladoBiorreagentes FisherBP9727-5

References

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