Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Summary

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Abstract

As células eucarióticas seguem um ciclo celular conservado que regula diversos processos, incluindo a manutenção do DNA e a homeostase das organelas. Estudar os processos celulares de maneira dependente do ciclo celular é frequentemente necessário para interpretar adequadamente os resultados experimentais. Existem métodos químicos e genéticos disponíveis para produzir a sincronização do ciclo celular em células cultivadas em uma ampla faixa de organismos, incluindo modelos de vertebrados, permitindo o estudo de processos dependentes do ciclo celular. No entanto, entre os organismos modelo, a levedura em brotamento continua sendo uma potência para a análise do ciclo celular devido aos seus métodos de sincronização particularmente robustos, curto tempo de geração e tratabilidade genética. A levedura compartilha a maquinaria central do ciclo celular com outros eucariotos, o que permitiu descobertas marcantes na regulação do ciclo celular. Este protocolo detalha métodos para análise do ciclo celular em leveduras, com foco em experimentos de liberação de parada G1 e liberação de parada mitótica, incluindo construção de cepas, preparação de cultura e microscopia. São apresentados métodos de marcação por PCR para a produção de cepas adequadas para paradas do ciclo celular e microscopia de fluorescência. Uma parada G1 é obtida usando o fator de α de feromônio peptídico, e breves lavagens resultam em liberação síncrona e progressão do ciclo celular. As amostras são coletadas em diferentes momentos após a liberação no ciclo celular e fixadas para microscopia. Um segundo método interrompe as células de levedura na mitose, esgotando o regulador do ciclo celular Cdc20 para atingir uma população parada por metáfase, bem como a liberação opcional na anáfase. As amostras são fixadas e preparadas para imagens pré e pós-liberação, e são fotografadas e analisadas. A análise de imagens se concentra na catalogação da localização dinâmica e nas mudanças na abundância populacional de proteínas no ciclo celular. Esses métodos de sincronização são adequados para diversas manipulações do ciclo celular e, embora seu uso na imagem de células fixas seja destacado aqui, eles podem ser adaptados para muitas outras análises, incluindo imagens de células vivas, bem como ensaios bioquímicos e moleculares.

Introduction

A divisão celular eucariótica é altamente regulada por meio de um programa chamado ciclo celular. Os processos altamente conservados e dinâmicos que ocorrem no ciclo celular tornam interessante o estudo por si só, mas também têm implicações generalizadas que informam as investigações de outros processos biológicos celulares - por exemplo, muitas organelas sofrem remodelação dramática durante a divisão celular, e a abundância e localização de muitas proteínas é altamente regulada^{ao longo 1,2,3}. Embora existam algumas camadas adicionais de comp....

Protocol

1. Construção de estirpes para análise e imagem do ciclo celular

1. Projete primers para marcar C-terminalmente o gene de interesse usando plasmídeos de marcação Pringle (plasmídeos pFA6a) ²⁴ . Em suma, projete primers F2 e R1 que, quando usados com um plasmídeo da série pFA6a, produzem um produto de PCR que pode ser transformado diretamente em levedura para gerar uma versão 'marcada' do gene de interesse. Use os pares de primers e plasmídeos contidos na Tabela 1 para marcar os genes de interesse neste protocolo. As estratégias de design de plasmídeo e primer para marcação C-terminal d....

Results

A análise de mudanças na localização de proteínas dependentes do ciclo celular por microscopia de fluorescência pode ser prontamente realizada usando os métodos que descrevemos aqui. Nosso grupo há muito se interessa pela regulação dinâmica e função do fuso mitótico. Na levedura, os corpos dos pólos do fuso (marcados pelo componente Spc110) funcionam como centros organizadores de microtúbulos dos quais os filamentos de microtúbulos emanam para criar a est.......

Discussion

A utilização da sincronização do ciclo celular em leveduras em brotamento permite estudar mecanismos importantes para uma variedade de processos celulares. O uso de liberações de parada G1 com tratamento com fator de α permite a progressão síncrona de uma população de células através dos estágios do ciclo celular e, como mostramos, pode revelar padrões dinâmicos de localização de reguladores celulares como Stu2³⁶. As paradas do ciclo celular também podem ser reali.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-fator	Instalação de Síntese Núcleo da Universidade de Utah		Sequência: WHWLQLKPGQPMY
Válvulas Eppendorf de 1,5 mL	Axygen	MCT-175-C
Mistura 10mM dNTP	Termo Científica	R0193
Tubos cônicos de 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
5x Tampão de reação HF Phusion	New England BioLabs	B0518S
Ácido acético, glacial	Fisher Chemical	BP2401C-212
Sal de hemissulfato de adenina	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Ágar, granulado	Apex Chemicals and Reagents	20-275
agarose	Produtos de Biopesquisa Apex	20-102GP
Autoclave Amsco Century Steam Sterilizador	Steris	SV-1262
Água DI autoclavada
Auxina	Sigma-Aldrich	Cat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser Liquid	Laboratórios Cargille	20130
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicricloreto)	Sondas Moleculares	Cat#D1306
Ácido desoxirribonucleico sal de sódio proveniente dos testículos do salmão	Sigma-Aldrich	D1626
Dextrose	Fisher Chemical	D16-10
Tetraacetato de etilendiamina dissódica	Fisher Chemical	S811-10
DMSO	Termo Científica	20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
Misturador de Vórtice de Velocidade Fixa	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscópio fluorescente DV Ultra	Leica	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	Serial #: NV01063. Não mais suportado
Formaldeído	Fisher Chemical	Cat#F79-500
Aparelho de gel	Termo Científica	Owl EasyCast B1
Mistura de Escada de DNA GeneRuler	Fermentas	SM0333
Contas de vidro	Fisher Scientific	11312A
Slides de vidro	VWR	48300-026
Agitador de Plataforma Innova 2300	New brunswick	NB-2300
Kimwipes	Kimtech	06-666
Centrífuga de laboratório para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	2525
Centrífuga de laboratório para tubos de 50 mL	Eppendorf	5804
Diidrato de acetato de lítio	Sigma-Aldrich	L4158-250G
Mestre ciclista Nexus X2	eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micropipetas p2, p20, p200 e p1000 e pontas correspondentes	Rainin	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vidro de Cobertura de Microscópio	Fisher Scientific	12541014
Nocodazol	Calbioquímica	Cat#487928; CAS: 31430-18-9; Lote#B35705
Orange G	Sigma-Aldrich	O7252
GANCHO	Pesquisa Hampton	HR2-591
Peptona granulada	Biorreagentes Fisher	BP9725-5
Polimerase de DNA HF Phusion	New England BioLabs	M0530L
Pipet-X	Rainin	PX-100R
Fosfato de potássio, dibásico	Termo Científica	424195000
Fosfato de potássio, monobásico	Termo Científica	424200025
Fonte de energia	Bio-Rad	23786
Comece a Adquirir Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	Obtenha com DV Ultra
Tris Base	Biorreagentes Fisher	BP152-10
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Rotador de tubo	VWR	10136-084
Banho-maria	VWR	WBE10A11B
Água, Ultra Pura	Produtos de Biopesquisa Apex	18-194
Extrato de levedura granulado	Biorreagentes Fisher	BP9727-5