Artigo de método

Revelando o controle eletromecânico da homeostase tecidual usando um dispositivo microfluídico de duas camadas

DOI:

10.3791/68894

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19 de setembro de 2025

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar um dispositivo microfluídico exclusivo de duas camadas para estudar a regulação eletromecânica da homeostase do tecido epitelial. O dispositivo aplica correntes elétricas fisiológicas estáticas perpendiculares ao plano do tecido, impactando a adesão, proliferação e extrusão célula-célula. Imagens de células vivas e medições de estresse mecânico revelam mecanismos desses processos.

Resumo

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O comportamento e o destino celular são afetados por correntes elétricas ou campos endógenos ou aplicados externamente. Sinais elétricos estáticos podem ser aplicados em dispositivos microfluídicos personalizados para imitar o ambiente elétrico em processos fisiológicos lentos, como desenvolvimento, cicatrização de feridas e homeostase. Uma classe importante de estudos elétricos celulares é o controle da migração celular por correntes galvânicas estáticas no plano em canais microfluídicos simples que imitam correntes de feridas, com densidades de corrente de ~ 0,1-1000 A / m2. No entanto, devido à geometria incompatível, esses dispositivos não são apropriados para estudar os efeitos elétricos na homeostase tecidual, onde as células adotam polaridade apico-basal e uma diferença de potencial transepitelial (TEPD). Aqui, detalhamos um dispositivo único baseado em microfluídica que aplica correntes de íons fisiológicos perpendiculares ao plano das camadas de células epiteliais confluentes para perturbar o TEPD e investigar a regulação elétrica dos estados estacionários do tecido. A configuração é feita de um polímero curável por UV de duas camadas incorporado com substrato de gel de poliacrilamida macio revestido com proteína de matriz extracelular de sua escolha. Este dispositivo microfluídico fornece a geometria correta e o substrato permeável para induzir uma corrente iônica relativamente uniforme através das camadas celulares de escala centimétrica. A configuração é compatível com imagens confocais de células vivas e microscopia de força de tração para inferir tensões mecânicas induzidas pelas correntes transepiteliais. Surpreendentemente, a proliferação, extrusão e migração de células são influenciadas coletivamente dentro do epitélio confluente, dependendo da direção da corrente iônica, induzindo um novo estado de tecido caracterizado por diferentes forças de interação célula-célula, eventos celulares (morte e proliferação) e estruturas teciduais. Os comportamentos celulares controlados eletricamente podem ser entendidos como um estresse mecânico induzido eletricamente e uma resposta celular. Este novo dispositivo e protocolo microfluídico fornece a ferramenta e a documentação necessárias para que as comunidades de mecanobiologia e bioengenharia estudem os efeitos elétricos na homeostase dos tecidos e desenvolvam novas aplicações de engenharia de tecidos.

Introdução

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Os sinais bioelétricos são importantes fatores biofísicos que contribuem para governar o comportamento celular. O exemplo mais famoso é o potencial de ação em neurônios e células cardíacas, que transmitem sinais elétricos a longas distâncias (até um metro) e em altas frequências (até centenas de Hertz)1. Pulsos elétricos aplicados com eletrodos podem ser usados para estimular o disparo do potencial de ação e são úteis em pesquisas e aplicações médicas2. Sinais bioelétricos endógenos em processos fisiológicos lentos, como desenvolvimento, cicatrização de feridas e homeostase 3,4,5,6,7,8 também foram medidos 9,10 em períodos de horas a dias. Um exemplo importante são as camadas epiteliais confluentes que mantêm ativamente uma diferença de potencial transepitelial (TEPD) variando de alguns a dezenas de milivolts 4,11. Um corte ou ferida nessas camadas confluentes gera uma corrente de curto-circuito, impulsionada pela atividade elétrica do tecido 12,13. Correntes enroladas de até dezenas de μA/cm2 e campos elétricos de até centenas de mV/mm foram relatados com diferentes técnicas. Estudos sugerem que esses sinais elétricos produzem uma pista direcional para as células migrarem em direção aos locais de ferida ou infecção, o que é importante para o processo de cicatrização 3,6,14. Em geral, os sinais elétricos estáticos (ou de variação lenta) e de variação rápida são importantes e desencadeiam diferentes respostas celulares ou teciduais.

Dentro do reino dos sinais de variação lenta, um fenômeno importante é o processo de migração acionado eletricamente denominado "galvanotaxis". Correntes galvânicas controladas no plano podem ser aplicadas em dispositivos microfluídicos com canais simples para imitar as correntes da ferida enquanto a migração celular é investigada em função da densidade de corrente15,16. Campos elétricos de 0,1-1000 V / m (densidade de corrente correspondente de 0,1-1000 A / m2) são encontrados para conduzir a migração celular em muitos tipos de células neste cenário in vitro 17, enquanto vias de sinalização canônicas para quimiotaxia (migração celular guiada por gradientes químicos), como PI3K, foram implicadas na galvanotaxia 7,18. Dispositivos microfluídicos "básicos" para estudo de galvanotaxia podem ser fabricados com técnicas padrão de litografia macia e microfabricação19. Esses dispositivos normalmente compreendem um substrato de polidimetil-siloxano (PDMS) de canal único ligado a uma lâmina de vidro (tamanho da seção transversal do canal: centenas de micrômetros, comprimento: centímetros). Os eletrodos usados para fornecer a corrente estática são instalados longe da região da célula e conectados com ou sem pontes salinas. A conexão da ponte salina pode ser feita por furos perfurados através do substrato PDMS, conectores microfluídicos e tubos preenchidos com ágar. A lâmina de vidro simples (normalmente com 170 μm de espessura) sob o canal também suporta imagens de células vivas de alta resolução durante os experimentos de galvanotaxia, o que é uma característica crucial para estudar o processo.

O papel dos sinais elétricos endógenos na manutenção da homeostase tecidual é muito menos compreendido do que na cicatrização de feridas. Uma razão importante é a falta de ferramentas apropriadas para estudar esses efeitos em tecidos intactos. O dispositivo microfluídico para galvanotaxia não é adequado para esse fim devido à sua geometria, que suporta apenas correntes elétricas no plano. No contexto da homeostase epitelial, um novo dispositivo é necessário para controlar e perturbar o TEPD ou correntes fora do plano através de uma camada epitelial confluente. Para atingir o objetivo de aplicar uma densidade de corrente iônica relativamente uniforme em uma monocamada, projetamos e fabricamos um dispositivo microfluídico com inovações na geometria do dispositivo, uso de material e recursos de medição biomecânica in situ 4. A última capacidade é importante, pois os efeitos elétricos podem estar afetando o comportamento celular por meio do acoplamento com as vias biomecânicas e mecanobiológicas, que podem ser estudadas com esse recurso.

Este novo dispositivo exibe vários recursos inovadores. Ele é projetado com duas camadas em vez do canal único encontrado nos dispositivos de galvanotaxia (inovação em geometria), mantendo a conexão com as câmaras de eletrodos semelhante à deste último. A primeira camada microfluídica tem canais para direcionar as correntes iônicas para (ou para longe) da região do tecido, enquanto a segunda camada tem uma abertura que direcionará essa corrente perpendicularmente através do epitélio situado no topo desta segunda camada microfluídica (Figura 1A, B). As técnicas de microfabricação são usadas para produzir camadas suficientemente finas, de modo que a imagem confocal de alta resolução seja possível, apesar do empilhamento de camadas microfluídicas que aumentam a espessura da amostra. Para as outras inovações importantes, um hidrogel sintético de poliacrilamida (PA) é incorporado ao meio do dispositivo, que desempenha um papel crucial (Figura 1A, B). As propriedades físico-químicas deste gel, como a química disponível para revestir as proteínas da matriz extracelular, a permeabilidade aos íons, bem como a elasticidade conhecida, são respectivamente essenciais para a fixação e crescimento celular, aplicação de correntes fora do plano e medição do estresse mecânico20 durante a estimulação elétrica. As estruturas de barreira são incorporadas na camada 1 da região do tecido para confinamento da solução precursora de gel de PA, como feito em dispositivos microfluídicos anteriores21 (Figura 1A, B). Por último, mas não menos importante, como a polimerização do gel PA é inibida pelo oxigênio em superfícies PDMS permeáveis ao gás oxigênio, outro material22 é usado para a fabricação do dispositivo, o que pode permitir a polimerização e a ligação firme do gel PA. Todos os recursos inovadores são cruciais para o novo dispositivo funcionar.

No geral, o estudo aprofundado de sinais bioelétricos estáticos ou de variação lenta na homeostase de tecidos intactos é possível com este novo dispositivo, cujo protocolo será detalhado a seguir. O protocolo e os resultados aqui referidos estão focados na linhagem celular epitelial Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), incluindo os eventos celulares (proliferação, morte, extrusão e migração) e alterações estruturais teciduais induzidas pela corrente elétrica. Esses estudos também são instrutivos para pesquisadores interessados em aplicar essa técnica para estudar a regulação elétrica do transporte epitelial e indução de eventos celulares e mudanças no destino celular em camadas celulares e sistemas mais complexos, como células primárias e organoides 2D.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo fornece etapas para construir uma configuração que aplica correntes elétricas estáticas e perturba o TEPD do epitélio confluente e para estudar seus efeitos por meio de técnicas de imagem de células vivas e mecanobiologia (Figura 1). A configuração consiste em dispositivos feitos de chips microfluídicos ligados a cartuchos, inserções e suportes para abrigar vários dispositivos para experimentos multiplexados em um microscópio, um par de câmaras de eletrodos conectadas a um medidor de fonte e dispositivos e uma tampa de câmara de célula viva para a manutenção de condições adequadas de células vivas (Figura 1C). Os princípios de design e desenhos de arquivo CAD do cartucho e outros componentes importantes da configuração podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1. As etapas incluem: 1) Litografia suave PDMS; 2) Fabricação de chips e montagem de dispositivos; 3) Conclusão da configuração; e 4) Experimentos de crescimento em monocamada e células vivas. Informações detalhadas sobre os reagentes e materiais utilizados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais.

1. Litografia suave de PDMS

NOTA: Esta seção detalha a produção de elastômeros PDMS a partir de wafers SU-8 (Figura 2A, B) para moldar camadas à base de adesivo curáveis por UV do chip microfluídico.

  1. Litografia suave PDMS
    1. Fabrique um wafer separado à base de SU-8 para cada camada microfluídica, Camada 1 e 2, usando técnicas de fotolitografia (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).
      NOTA: A fabricação de wafer pode levar um mês se uma solicitação for enviada a uma instalação de microfabricação/sala limpa. A técnica de gravação de silicone para fabricação de wafer também pode ser usada.
    2. Silanize o wafer de silício para permitir a desmoldagem do PDMS19.
      1. Limpe o wafer com uma pistola de ar de nitrogênio pressurizado. Ative a superfície do wafer aplicando um processo curto de plasma de oxigênio (30 s, 30 W em fluxo de gás 20 sccm O2 a uma pressão do reator de 1-3 mbar) 23.
      2. Pipetar 200 μL de Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil-1-triclorossilano em uma tampa de plástico limpa (diâmetro 60 mm, altura 15 mm). Coloque a tampa ao lado do wafer no dessecador a vácuo (apenas para silanização). Ligue a bomba de vácuo e aguarde 1-2 h, enquanto o silano vaporizado é depositado como uma monocamada no wafer de silício.
        CUIDADO: O silano é corrosivo e tóxico. Use luvas e óculos de segurança e opere em uma capela para garantir uma operação segura.
        NOTA: Um wafer recém-silanizado pode ser usado para fabricar 10-20 peças de moldes PDMS. O tempo de vácuo depende da condição da bomba de vácuo. A silanização excessiva causa espessura irregular e resulta em uma aparência turva, que deve ser evitada. Armazene o wafer em câmaras com controle de umidade quando não estiver em uso. As estruturas PDMS feitas de novos wafers podem ser verificadas usando microscopia eletrônica de varredura (SEM).
    3. Misture bem a resina PDMS de base suficiente e o agente de reticulação (l:p = 10:1 e 70-80 g) por alguns minutos em uma placa de Petri (diâmetro 150 mm, altura 25 mm). Certifique-se de que pequenas bolhas se formem uniformemente na mistura, o que confirma uma boa mistura. Transfira a mistura para tubos de centrifugação de 50 mL e centrifugue a 550 x g por 3 min para remover completamente as bolhas de ar.
      NOTA: O líquido PDMS é pegajoso e difícil de limpar; Tenha cuidado ao despejar. Limpe com isopropanol se as superfícies da bancada estiverem contaminadas por mistura de PDMS derramada.
    4. Despeje delicadamente a mistura de PDMS no wafer em um prato de plástico ou vidro (diâmetro 150 mm, altura 25 mm) com fundo plano e, em seguida, empurre o wafer para baixo para purgar o PDMS do fundo do wafer. Desgaseifique a mistura com uma bomba de vácuo.
      NOTA: A purga do PDMS líquido do fundo do wafer é importante; uma espessa camada de PDMS na parte inferior dificulta a remoção do wafer do prato de plástico, aumentando a probabilidade de o wafer quebrar. Alternativamente, pode-se cortar o PDMS ao longo da borda do wafer e mantê-lo na placa de Petri. Garanta a espessura do PDMS de aproximadamente 1,5 mm para a Camada 1 para garantir a flexibilidade do molde nas etapas de fabricação posteriores. Garanta a espessura do PDMS de aproximadamente 2,5 mm para a Camada 2 para reduzir a probabilidade de flacidez nas etapas posteriores de fabricação. A espessura do PDMS é medida por uma régua depois que os moldes do PDMS são cortados nas formas necessárias.
    5. Catalise o PDMS em um forno a 80 °C por 2 h e certifique-se de que o prato seja colocado o mais horizontalmente possível durante o processo. Deixe o molde e o wafer PDMS esfriarem até a temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o molde PDMS em sua totalidade do wafer usando uma lâmina cirúrgica afiada e uma pinça acolchoada.
      NOTA: Tenha cuidado para não arranhar a superfície do wafer. Verifique se os restos do PDMS são formados na superfície do wafer quando o PDMS é retirado. Isso sinaliza que a superfície do wafer deve ser resilanizada.
    6. Corte o molde PDMS em blocos que contenham as características de interesse e armazene esses blocos em placas de Petri limpas (diâmetro 150 mm, altura 25 mm) ou em uma câmara de vácuo quando não estiverem em uso. Manipule o molde PDMS sem tocar nos recursos essenciais.

2. Fabricação de chips e montagem de dispositivos

NOTA: Use um polímero curável por UV de baixa viscosidade (faixa máxima de absorção de UV 350-380 nm) para fabricar o chip microfluídico por meio de moldagem PDMS. O adesivo curável por UV permite a integração do hidrogel de poliacrilamida (PA) como um substrato de célula transparente, permeável a íons e elástico. As propriedades do gel PA o suportam como um sensor de estresse mecânico tecidual que permite imagens de células vivas e estimulação por corrente estática. O chip será finalmente conectado a um cartucho que abriga o meio de cultura e se conecta às câmaras dos eletrodos.

  1. Preparação da base de lamínula de vidro
    1. Marque a quantidade necessária de lamínulas de vidro retangulares (170 μm) com um cortador de diamante para um tamanho de 37 × 24 mm2, para caber nas dimensões do cartucho (Arquivo Suplementar 4).
      NOTA: A lamínula tem 170 μm de espessura compatível com imagens de alta resolução, mas é frágil e requer manuseio cuidadoso. Use luvas e proteção para os olhos. Descarte as lamínulas de vidro retangulares imediatamente se aparecerem rachaduras visíveis, pois lascas dessas lamínulas de vidro retangulares podem representar risco de vazamento. Como alternativa, solicite lamínulas do tamanho certo dos fabricantes de lamínulas. Evite tocar nas superfícies de lamínulas de vidro retangulares com as mãos desprotegidas e deixe manchas que possam deteriorar a qualidade da imagem.
    2. Coloque as lamínulas retangulares em uma placa de Petri limpa sem sobreposição e transfira-as para uma câmara de plasma. Induza uma condição de vácuo, mas deixe entrar um pouco de ar no final. Ative as superfícies das lamínulas de vidro retangulares usando plasma de ar (30 s a 5 min, 29,6 W, dependendo da condição do equipamento)
      NOTA: Apenas os lados totalmente expostos ao plasma (ou seja, superfícies superiores) devem ser usados na etapa subsequente (etapa 2.1.3). Conclua a etapa 2.1.3 dentro de 30 minutos após a exposição plasmática. A câmara deve aparecer como Rosa-Púrpura nesta fase se o plasma de ar tiver sido gerado. Se as últimas etapas de ligação forem bem-sucedidas, reduza a duração do plasma por conveniência.
    3. Prepare 10 mL de solução de tratamento de superfície feita de ácido acético a 0,3% e metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propila a 0,5% dissolvido em etanol a 100%. Trate as lamínulas de vidro retangulares com esta solução em uma placa de Petri (diâmetro 150 mm, altura 25 mm) por 5 min em um agitador, para permitir uma boa ligação com camadas microfluídicas à base de adesivo curáveis por UV. Certifique-se de que as lamínulas de vidro retangulares estejam totalmente imersas na solução e que ambos os lados sejam tratados.
      CUIDADO: A solução de tratamento de superfície é corrosiva. Manuseie-o em uma hotte.
    4. Enxágue as lamínulas de vidro retangulares com etanol 100% três vezes, sem deixá-las secar durante o processo. Seque as lamínulas de vidro retangulares, uma a uma, com gás nitrogênio e uma pistola de sopro. Garanta uma taxa de sopro suficiente que remova de forma limpa as gotículas de líquido das superfícies da base da lamínula, evitando manchas de líquido. Armazene as lamínulas de vidro retangulares em uma placa de Petri limpa (diâmetro 150 mm, altura 25 mm).
      NOTA: Use uma pistola de ar para direcionar o fluxo de ar paralelamente às bases da lamínula e evite usar uma taxa de sopro excessiva para evitar que os vidros se quebrem.
  2. Fabricação da camada 1 (Figura 2C)
    1. Coloque e alise um molde PDMS de Camada 1 limpo, com a face para cima, em uma tampa de prato de plástico limpa (diâmetro 60 mm, altura 15 mm). Pipete 500 μL de adesivo líquido curável por UV no molde lentamente, umedecendo cuidadosamente todas as estruturas salientes com o auxílio de uma espátula. Remova as bolhas de ar devido ao processo de umedecimento.
      NOTA: Os moldes PDMS limpos podem ser preparados usando fita adesiva para remover poeira ou restos de adesivo curáveis por UV ou limpando com etanol. Para precaução adicional, mantenha os moldes PDMS em câmaras de vácuo quando não estiverem em uso.
    2. Pressione suavemente a lamínula no molde PDMS. Evite que o excesso de adesivo curável por UV molhe a parte superior da lamínula, pois os restos de adesivo curável por UV podem impedir uma lamínula limpa e plana. Remova o excesso de adesivo curável por UV com limpadores de laboratório.
      NOTA: É fundamental garantir que as características do molde PDMS transferido para a camada adesiva curável por UV se alinhem com o cartucho ao qual será colado. Para isso, marque a lamínula com um marcador solúvel onde ficarão os centros dos poços do cartucho (três deles). Use essas marcas para alinhar a lamínula com os recursos do molde PDMS ao pressionar a lamínula de vidro retangular para baixo.
    3. Cure parcialmente a estrutura sob uma luz UV uniformemente iluminada (363-370 nm, 224 mW / cm2) por 10 s. Limpe as marcas com etanol 75% mais tarde. Segure a estrutura firmemente em uma superfície plana e retire o molde PDMS da Camada 1 lentamente.
      NOTA: A cura parcial permite a formação de uma camada adesiva curável por UV suficientemente sólida, permitindo o descascamento do molde PDMS nesta fase. Isso também facilita a colagem com uma camada 2 parcialmente curada nas etapas subsequentes para a fabricação de uma estrutura adesiva curável por UV de duas camadas. O molde PDMS da camada 1, que foi preparado com uma espessura de 1,5 mm (etapa 1.2.4), garante flexibilidade PDMS suficiente que reduz a probabilidade de a lamínula fina se estilhaçar durante o processo de descascamento. O molde PDMS pode ser reutilizado por até dez a vinte vezes, após o que pode haver uma camada esbranquiçada de restos adesivos curáveis por UV na superfície do PDMS, reduzindo a espessura da estrutura. Use novos moldes PDMS neste caso.
  3. Fabricação da camada 2 (Figura 2D)
    1. Coloque um molde PDMS de camada 2 limpo, com a face voltada para baixo, em uma laje PDMS plana (espessura da laje de > 2,5 mm para garantir alta rigidez). Bata suavemente nos recursos de cima usando uma pinça. Observe a interface quanto a escurecimento ou contraste óptico abaixo dos recursos - isso indica contato adequado.
      NOTA: Os pilares de suporte que circundam as características principais (duas aberturas redondas e uma fenda) são cruciais para evitar que a superfície do molde PDMS caia.
    2. Preencha o espaço entre o molde PDMS e a placa com adesivo líquido curável por UV por efeito capilar. Catalise parcialmente a estrutura sob luz UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) por 10 s.
    3. Retire suavemente a camada adesiva composta curável por UV e o molde PDMS da placa PDMS com uma pinça acolchoada macia. Apare o excesso de bordas da camada adesiva curável por UV com uma tesoura afiada, se necessário.
  4. Colagem das camadas 1 e 2 (Figura 2E)
    1. Coloque a Camada 1 presa a uma lamínula de vidro retangular em uma superfície plana. Alinhe a Camada 2 (ainda anexada ao seu molde PDMS) com a Camada 1 e pressione ambas as camadas com firmeza, garantindo que as "sombras" apareçam sob os recursos.
    2. Cure a estrutura sob luz UV (363-370 nm, 224 mW/cm²) por 10 s para unir as camadas 1 e 2, que formam a estrutura de duas camadas do chip microfluídico. Retire suavemente o molde PDMS do chip.
      NOTA: Para garantir o descascamento bem-sucedido do molde PDMS do chip, use uma pinça para separar cada pilar de suporte PDMS da camada 2 adesiva curável por UV na etapa 2.4.1. Essa ação ajuda a reduzir a adesão geral entre o molde PDMS e a Camada 2, o que é importante para o descascamento.
  5. Integração do gel de poliacrilamida (Figura 2F)
    NOTA: Antes desta seção, prepare quantos chips forem necessários para um experimento multiplexado.
    1. Prepare a solução precursora de gel PA misturando suavemente os ingredientes na tabela abaixo, correspondendo à rigidez do gel PA de escolha24 (consulte a Tabela 1). Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar durante a pipetagem, pois o oxigênio inibe a gelificação.
      CUIDADO: TEMED e APS são tóxicos. Trabalhe em um exaustor e use luvas.
      NOTA: Pipetagem e manuseio cuidadosos são necessários, pois pequenos volumes de líquidos estão envolvidos (1 μL TEMED para 1 mL de solução precursora de gel de PA). A rigidez do gel pode influenciar o comportamento celular, como mostrado em muitos estudos de mecanobiologia. Escolha a rigidez mais apropriada para seus experimentos. As esferas fluorescentes servem como marcadores fiduciais para deformação em gel e inferência de tensão mecânica. Solução de esferas de vórtice antes de pipetar a solução na solução precursora de gel PA. Recomenda-se não misturar o TEMED de pequeno volume, pois as soluções precursoras de gel PA começam a gelificar quando ambos os iniciadores são adicionados e pequenos volumes são difíceis de misturar completamente durante esse curto período de tempo.
    2. Pipete imediatamente 10 μL da solução precursora de gel PA no meio da região do tecido e no topo da fenda da camada 2 (Fig. 1B, 2F). Pressione suavemente com uma lamínula de vidro redonda (diâmetro 10 mm) para formar um gel plano. Observe o fluxo da solução de PA para a camada 1 através da fenda e pare na fileira de pilares de barreira.
      NOTA: O volume de 10 μL da solução precursora de gel PA produz um gel de 100 μm de espessura acima da camada 2. Altere este volume dependendo da espessura do gel necessária. Pipete a solução no chip o mais rápido possível, pois a solução de PA começa a polimerizar assim que os iniciadores são adicionados. Pressione a solução com a quantidade certa de força para evitar que a solução transborde pelos pilares da barreira e bloqueie o canal. Descarte o chip se os canais estiverem bloqueados. Para géis macios com rigidez de 5 kPa ou menos, use repelente de água de vidro para tratar as lamínulas redondas de vidro para torná-las hidrofóbicas. Em particular, mergulhe as lamínulas em vidro repelente de água por 5 min, enxágue com etanol 100% 3 vezes e seque com gás nitrogênio. Isso facilita a remoção da lamínula do gel polimerizado posteriormente sem destruir o gel.
    3. Cure imediatamente o chip microfluídico sob luz ultravioleta (363-370 nm, 224 mW / cm2) por 5 min. Aguarde pelo menos ~1 h para que o gel PA solidifique completamente.
      NOTA: Isso curará totalmente o chip, permitindo que o gel PA polimerizado se ligue à estrutura. As etapas 2.5.1, 2.5.2 e 2.5.3 devem ser concluídas em rápida sucessão.
    4. Incube o chip completamente em HEPES (0,1 M, pH 7,4) por pelo menos 1 h ou mais para umedecer o gel e soltar a adesão entre a lamínula e o gel. Remova cuidadosamente a tampa do vidro com uma pinça afiada.
      NOTA: Para géis mais macios com rigidez de 5 kPa ou menos, aumente o período de incubação em até 10 h em um agitador para garantir a remoção limpa da lamínula do gel sem interromper a estrutura do gel. Às vezes, padrões estruturais de várias dezenas e centenas de micrômetros podem se formar entre a base retangular da lamínula e a Camada 1 à base de adesivo curável por UV. Esses padrões podem interferir na imagem de campo claro, mas têm efeitos mínimos na imagem de fluorescência. Isso pode ser melhorado pela ativação plasmática de lamínulas retangulares, como na etapa 2.1.2.
  6. Ligação de chip e cartucho (Figura 2F)
    1. Coloque um cartucho de policarbonato de grau médico limpo (Arquivo Suplementar 4) em uma superfície plana, com a parte inferior voltada para cima. Seque o gel no chip com lenços de laboratório laterais. Alinhe o chip, com a face voltada para baixo, com o cartucho.
      NOTA: Ao testar novos designs de cartuchos, pode-se usar métodos de usinagem ou impressão 3D. Quando o design é definido, pode-se usar a moldagem por injeção para produzir grandes quantidades do cartucho.
    2. Pipete o adesivo curável por UV nas fendas entre o chip e o cartucho, que serão preenchidos por efeito capilar. Cura com luz UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) durante 5 min.
      NOTA: Cuidado para evitar que o adesivo curável por UV transborde para os canais ou para o outro lado da base da lamínula.
  7. Remoção da solução de PA não polimerizada
    1. Use uma rolha PDMS e uma seringa para aspirar aproximadamente 5 mL de HEPES (0.1 M, pH 7.4) através dos canais de remoção de resíduos para liberar a solução precursora de gel de PA não polimerizada que é tóxica para as células.
    2. Incube o gel no dispositivo com 2 mL de HEPES (0,1 M, pH 7,4) por dispositivo e coloque-o em um agitador por 1-2 dias, para garantir a remoção completa da solução precursora de gel de PA não polimerizada.

3. Conclusão da configuração

NOTA: Com os dispositivos fabricados, conclua a configuração (Figura 1C) revestindo o gel PA com proteína ECM para semeadura celular, conectando os dispositivos à câmara do eletrodo para estimulação elétrica e colocando os dispositivos em inserções, suportes e uma tampa de câmara de célula viva para experimentos de imagem multiplexados de células vivas.

  1. Preparação de componentes esterilizados
    1. Todos os componentes da configuração, exceto o dispositivo (Tabela de Materiais), devem ser sonicados na seguinte ordem: primeiro em água com sabão por 30 min, depois em água MQ por 30 min e, finalmente, em etanol a 75% por 30 min. Depois disso, seque-os em um forno a 60 °C e trate-os com luz ultravioleta a 200-280 nm em um gabinete de biossegurança por 30 min para obter a esterilização.
  2. Funcionalização do gel PA com proteína ECM
    1. Esterilize os dispositivos com luz UV (200-280 nm) em um gabinete de biossegurança.
    2. Prepare a quantidade necessária de 50 μg/mL de solução de trabalho de colágeno I em 1x DPBS no gelo.
      NOTA: Mantenha o estoque de colágeno I no gelo para evitar a gelificação. São necessários 100-150 μL de solução de trabalho de colágeno I para cada dispositivo para imergir totalmente o gel. Pipete suavemente as soluções de colágeno I para evitar a formação de fibras.
    3. Prepare a quantidade necessária de solução de trabalho Sulfo-SANPAH (SS) em gelo. Cada tratamento em gel requer aproximadamente 80 μL de solução de trabalho SS, onde 2 μL de solução estoque SS (dissolvida em DMSO anidro) são diluídos em 80 μL de HEPES frio (a partir de 4 °C refrigerado, 0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: SS é sensível à umidade; Evite a condensação de umidade no produto equilibrando os frascos de estoque à temperatura ambiente antes de abrir. Use SS sem pesagem para melhor desempenho e prepare estoques em DMSO anidro. Use-o o mais rápido possível. Um tampão HEPES frio é usado para reduzir a taxa de hidrólise do SS em preparação para a solução de trabalho do SS. Cada gel requer dois tratamentos com a solução de trabalho SS para garantir que a superfície do gel PA seja bem funcionalizada.
    4. Seque o gel no dispositivo esfregando com lenços umedecidos de laboratório nas bordas do gel. Pipete 80 μL de solução de trabalho SS no gel, garantindo que a superfície do gel esteja completamente imersa com solução SS. Trate o gel com UV (363-370 nm, 24,5 mW / cm2) por 5 min para ativar o SS. Enxágue 3 vezes com HEPES frio (0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: Pipete cuidadosamente o SS no meio do cartucho para evitar que o SS seja atraído para a parede.
    5. Repita a etapa 3.2.4, mas enxágue três vezes com 1x DPBS frio no final.
      NOTA: As etapas 3.2.3 a 3.2.5 devem ser executadas em rápida sucessão para evitar a hidrólise do SS. O gel enxaguado deve aparecer como um tom mais escuro de vermelho nesta fase, se a ativação da superfície por SS for bem-sucedida.
    6. Pipete 100 μL de solução de colágeno I no gel de PA, certificando-se de mergulhar totalmente o gel. Incube em temperatura ambiente por 1 h e, em seguida, enxágue o colágeno solto com 1x DPBS três vezes. Mergulhe o gel em 1x DPBS antes de usar.
      NOTA: A amostra revestida com colágeno I pode ser armazenada na geladeira a 4 °C por alguns dias.
  3. Conexão de dispositivos a câmaras de eletrodos
    1. Fixe os dispositivos aos insertos usando parafusos (Figura 1C, tipo de parafuso: M3 X 10 mm). Em seguida, prenda até quatro conjuntos de inserção de dispositivo ao suporte projetado para montagem em uma platina de microscópio (tipo de parafuso: M3 X 5 mm).
      NOTA: Se o número máximo de conjuntos de inserção do dispositivo não for usado, recomenda-se preencher todos os outros slots de suporte com dispositivos vazios para vedar o espaço para que boas condições de células vivas possam ser preservadas para os experimentos de imagem posteriores. Dispositivos vazios podem ser feitos simplesmente colando cartuchos em lamínulas de vidro retangulares.
    2. Encha os dispositivos com meio de cultura (DMEM++, 2 mL em cada um dos poços principais). Puxe ainda 2 mL de meio através dos canais de remoção de resíduos para lavar e substituir o 1x DPBS.
    3. Prepare dois tubos de 50 mL com tampas que tenham orifícios passantes para funcionar como câmaras de eletrodos. Crie orifícios de tamanho e quantidade apropriados para encaixar com segurança os eletrodos de platina e os tubos Tygon, conectando as câmaras dos eletrodos aos dispositivos. Encha cada câmara do eletrodo com 45 mL de meio de cultura.
      NOTA: Os furos podem ser facilmente criados nas tampas usando lâminas cirúrgicas afiadas.
    4. Prepare a conexão entre as câmaras de eletrodos e os dispositivos: Conecte dois conectores de tubulação a cada dispositivo. Encaixe um clipe de tubo em cada tubo Tygon (Figura 1C). Puxe o meio de cultura através dos tubos com uma seringa e prenda-os firmemente. Conecte uma extremidade do tubo com enchimento médio à câmara do eletrodo e a outra ao dispositivo.
      NOTA: Reduza a probabilidade de surgimento de bolhas na tubulação usando meio pré-aquecido e/ou desgaseificação do meio em uma câmara de vácuo. Evite a formação de bolhas de ar na interface entre a tubulação Tygon e o conector da tubulação, aperte as extremidades da tubulação para projetar a superfície do meio antes de imergir no meio no tubo ou faça uma conexão física aos conectores da tubulação.
    5. Ajuste as alturas relativas entre as superfícies do meio de cultura nos dispositivos e nas câmaras dos eletrodos usando um conector de laboratório. Solte os clipes de tubulação e deixe todas as superfícies médias se equilibrarem na mesma altura.
      NOTA: Lembre-se de prender os clipes da tubulação sempre que toda a configuração estiver sendo movida para evitar o transbordamento de fluidos.
    6. Realize o controle de qualidade medindo a resistência de cada dispositivo separadamente usando um medidor de fonte elétrica.
      NOTA: Certifique-se de soltar apenas o clipe de tubulação do dispositivo para o qual a resistência está sendo medida, mantendo os clipes dos outros dispositivos conectados em paralelo bem presos.

4. Crescimento de monocamada e experimentos de células vivas

NOTA: Para formar uma monocamada confluente adequada e obter uma densidade de corrente elétrica uniformemente distribuída que depende da confluência e resistência elétrica da monocamada. Em seguida, garanta as condições adequadas de células vivas em um microscópio para experimentos de imagem e estimulação elétrica de longo prazo.

  1. Crescimento de monocamada
    1. Separe as células MDCK usando tripsina dos frascos T25. Centrifugue e conte o volume médio necessário para obter 0,1 milhão de células. Suspenda esse número de células e misture-as bem em meio de 2 mL em tubos de centrífuga.
    2. Pipetar todo o meio carregado de células para o poço na região do tecido. Deixe as células sedimentarem por 15 minutos antes de transferir lentamente toda a configuração para uma incubadora de cultura de tecidos.
      NOTA: Para cada dispositivo, uma densidade de semeadura de 0,1 milhão de células corresponde a 0,06 milhão de células por centímetro quadrado (6 × 104 células/cm2). Essa densidade de semeadura é bastante esparsa e as células crescem por 2 dias antes de atingir um estado confluente. Este processo garante uma monocamada devidamente polarizada e homogênea, sem a necessidade de enxaguar o excesso de células soltas que correm o risco de perturbar o tecido. É importante que a etapa de sedimentação não seja perturbada para que haja semeadura uniforme das células.
    3. Permitir que as células cresçam na incubadora (37 °C, 5% CO2, 90% de humidade) durante 72 h para atingir uma densidade celular de >~50 células/100 μm2. Verifique diariamente em um microscópio de bancada, com contraste de fase, para monitorar o processo de crescimento.
      NOTA: Com este número de células semeadas, as células MDCK terão atingido 70%-80% de confluência após 24 h, confluência total após 48 h e aumento adicional da densidade celular e maturação do tecido até 72 h. Após 24 h, o comprimento médio da célula é de cerca de 10-20 μm. Em 48 h, as junções célula-célula e o corpo celular têm um contraste claro sob a imagem de contraste de fase. Este contraste reduz drasticamente após 72 h.
  2. Aquisição de imagens de células vivas
    1. Escolha uma epifluorescência ou um microscópio confocal, dependendo das necessidades experimentais. Quando as células expressam ou são coradas com marcadores fluorescentes, escolha confocal para observação tridimensional da forma celular e deformações do substrato do gel. Para observação bidimensional, escolha contraste de fase e epifluorescência, que produzem menos fototoxicidade. Ligue o sistema de células vivas 1 h antes de levar a configuração ao microscópio, permitindo que a incubadora de platina do microscópio se estabilize a 37 °C, 5% de CO2 e 90% de umidade.
      NOTA: O controlador do sistema de célula viva mostra as condições na incubadora de platina e soará um aviso quando as condições estiverem abaixo do ideal. Como a tampa da incubadora no topo do palco é diferente da comercial devido à necessidade de acomodar tubos de dispositivos que se estendem para fora, o sistema precisa ser recalibrado para garantir boas condições de células vivas para experimentos de longa duração (alguns dias até uma semana). A calibração pode ser feita com base no manual do usuário, e as posições dos sensores precisam ser mantidas as mesmas nos experimentos e nas condições de calibração. Verifique a taxa de evaporação do meio na incubadora de estágio superior e as condições de pH com meio com infusão de vermelho de fenol.
    2. Monte a configuração no microscópio, com as câmaras dos eletrodos nas laterais. Certifique-se de que o microscópio eletrônico stage tenha espaço suficiente para se mover e não esbarrar nas câmaras dos eletrodos. Certifique-se de que as alturas médias da superfície estejam equilibradas e na mesma altura entre as dos dispositivos e as câmaras dos eletrodos.
      NOTA: A superfície média nos poços do dispositivo, onde está a região do tecido (Figura 1C), tem um impacto significativo na imagem de campo claro e contraste de fase. O menisco causará foco de luz indesejado. Certifique-se de que a superfície do meio esteja plana na borda do poço, mas observe que a evaporação do meio na câmara de células vivas levará à distorção dessa superfície plana após algum tempo. Para superar esse problema, uma solução é colocar uma lamínula de vidro plana em contato com a superfície do meio para achatar essa superfície. Esta lamínula deve ter uma área menor que o poço para não obstruir as trocas gasosas, o que é importante para o crescimento celular. Outra opção é colocar óleo mineral de grau de cultura de células no meio.
    3. Configure o software.
      1. Escolha lentes objetivas de 10x ou 20x para imagens de tecido inteiro com um microscópio de epifluorescência e lentes objetivas de 30x (WD 0,8 mm, NA 1,05) para imagens confocais de alta resolução.
      2. Para imagens de tecido inteiro, escolha várias posições para cobrir a área retangular na região do tecido (Figura 1A, por exemplo, 5 linhas por 5 colunas, a linha do meio cobrindo a fenda, enquanto as outras fora da fenda). Escolha os canais fluorescentes e de campo claro de acordo com as linhas celulares usadas na parte resultante (canal 488 para fluorescência verde e canal 561 para fluorescência vermelha). Escolha um intervalo de tempo de 1 h para reduzir a fototoxicidade neste experimento de imagem de longo prazo por até alguns dias.
        NOTA: Outras lentes objetivas, como 4x, podem ser escolhidas se for necessária uma visão mais ampla de todo o tecido.
  3. Estimulação elétrica
    1. Verifique o número de dispositivos, a resistência relativa do dispositivo e a corrente elétrica alvo de cada dispositivo. Decida a corrente elétrica total a ser fornecida por algumas horas até uma semana na configuração geral.
    2. Forneça um sinal elétrico no modo de pinça de corrente. Para 3 dispositivos com a mesma resistência de canal, com um grupo de controle (sem corrente elétrica, clipe de tubulação preso), uma condição de corrente apical-basal (AtB) e uma condição de corrente basal-apical (BtA) (Figura 1D), forneça uma corrente total de 20 μA com um medidor de fonte. Isso leva a 10 μA fornecidos para cada dispositivo com uma densidade de corrente estimada ~ 10 μA / cm2 que é fisiologicamente relevante (mais detalhes em discussão).
      NOTA: A tensão total é de cerca de dezenas de milivolts, dependendo do comprimento da tubulação Tygon. Essa corrente elétrica pode ser fornecida continuamente por alguns dias até uma semana. O indicador de vermelho de fenol mudará de cor nas câmaras dos eletrodos (mais ácido na câmara com o eletrodo positivo), mas não na incubadora do topo do palco, que está bem calibrada. As células permanecerão saudáveis desde que as condições das células vivas sejam bem mantidas. Os pesquisadores podem mudar o meio na incubadora do palco uma vez a cada dois dias e o meio nas câmaras dos eletrodos uma vez a cada poucos dias. Aperte os clipes da tubulação ao trocar as câmaras do eletrodo para evitar o transbordamento do meio. Conforme mencionado na etapa 3.1.1, lembre-se de ter um dispositivo vazio para cobrir o espaço do suporte. Isso garante que a câmara de células vivas esteja nas condições adequadas.

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Resultados

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Todos os resultados aqui apresentados são adaptados da publicação anterior4; Para mais detalhes, consulte esta publicação.

Este protocolo permite a aplicação de uma corrente iônica externa ou campo elétrico perpendicular ao plano das células ou tecidos. Essa estimulação elétrica perturba a diferença de potencial elétrico transepitelial endógeno (TEPD) e permite estudar o papel do TEPD no comportamento do tecido. Seguindo o protocolo, células MDCK do tipo selvagem e gene...

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Discussão

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Este protocolo fornece etapas detalhadas e lógica de projeto para fabricar um novo dispositivo microfluídico para realizar experimentos de perturbação de potencial elétrico transepitelial e estudar efeitos bioelétricos por meio de imagens de células vivas e métodos de mecanobiologia. A importância deste método é óbvia quando comparada a outros métodos relacionados. Por exemplo, um método relacionado usa um chip microfluídico simples com um design de canal único que aplica uma corrente es...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Certifique-se de que todos os autores divulgaram todo e qualquer conflito de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF e TBS reconhecem discussões úteis com o Dr. Xumei Gao, Xinru Yu e outros membros do grupo do Laboratório de Biofísica de Tecidos. Agradecemos ao Customized Technology Service Facility (CTSF) da Westlake University por ajudar com nosso desenho esquemático. Este trabalho foi apoiado pela Westlake Education Foundation, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine e pelo Research Center for Industries of the Future (RCIF) da Westlake University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x DPBSGibco14190144
Metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propila, TPMSigma2530850Armazenar sob nitrogênio após a abertura.
Tubo Falcon de 50 mLCorning430829Faça 4 furos na tampa do tubo falcon de 50 mL, para permitir que o eletrodo e a tubulação passem pela tampa e fiquem imersos no meio. Para um conjunto de dispositivos microfluídicos, são necessárias pelo menos 2 tampas.
Ácido acéticoSinopharm10000208
Solução de acrilamida, 40%Sigma79061Tóxico
Máquina PneumáticaLaboratório OKOOKO-APComponente da incubadora de microscópio
Persulfato de amônio, APSAladdinA112447
Cartucho--O cartucho é feito sob medida e o design refere-se ao material suplementar. A matéria-prima é PC Makrolon 2858 Medical Grade, e aqui você pode encontrar mais detalhes: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clipes--Robert Clip, para tubulação  de 4,5 mm de diâmetro externo. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Colágeno ICorning354236
Água DI Milli-QMilli-Q-
Meio de cultura de Eagle modificado de Dulbecco, DMEM (glicose alta)Gibco11965092DMEM++ é DMEM com 10% adicionais  FBS (Sigma-Aldrich) e 100  unidades/mL de penicilina-estreptomicina (Gibco).
Gaiola preta do cercoLaboratório OKOH201Componente da incubadora de microscópio
Microscópio invertido de epifluorescênciaOlimpoIX83
Etanol absolutoSinopharm10009218
Soro fetal bovinoSigmaRolamento F8318
Contas fluorescentes, 0,1 μ L, vermelho (580/605)ThermoRolamento F8801
Câmara de gásLaboratório OKOH201-PRIOR-SP200/400/600Componente da incubadora de microscópio
Misturador manual de gásLaboratório OKOMISTURADOR 2GFComponente da incubadora de microscópio
GeneticinaGibco10131027GFP– actina e H1– GFP MDCK foram mantidos usando meios suplementados com 0,5  mg/mL de genetrina (Gibco) para sustentar sua expressão gênica
HEPESSigma736459
IsopropanolSinopharm80109218
KimwipesProfissional da Kimberly-ClarkLH-70155Limpador de laboratório
Parafuso mais longo--Parafuso de máquina de precisão cruzada de cabeça redonda niquelado, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Conector microfluídico--Conexão de união reta de polipropileno, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Suporte de placas multipoçosLaboratório OKOH201-MW-SUPORTE-NZ500Componente da incubadora de microscópio
N',N'-metilenobisacrilamida, 2%Sigma110269Tóxico
NOA 73Produtos Norland17-345Adesivo curável por UV
Penicilina-estreptomicina, PS (10.000 U/mL)Gibco15140122
Placa de Petri (150 mm e aguda; 25 mm)Corning430599Resista a pelo menos 80 > C por 2 h
Ferramenta Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaPara tratamento com plasma O2
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-002Para tratamento de plasma a ar
Prato de plástico (diâmetro 60 mm, altura 15 mm)Ninho705001
Eletrodos de platinaTianjin Aida HengshengPt005Diâmetro 0,5 mm, comprimento 37 mm 
Rain-X Vidro Original Repelente de ÁguaProdutos Químicos ITW800002242
Lamínula retangularMarienfeld0107222  1,5H, 24 e agudo; 50 mm2, 170 μ m de espessura
lamínula de vidro redondaMarienfeld0111500  1,5H, redondo 10 mm de diâmetro
Parafuso mais curto--Parafuso de máquina de precisão cruzado de cabeça redonda niquelado, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, sem pesoThermoRolamento A35395Solução estoque SS: 20 mg/mL em DMSO anidro, 2 μ L para cada um; Solução de trabalho SS: 0,5 mg/mL SS em HEPES (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Kit de elastômero de siliconeDow CorningH052KCM147O produto final é o polidimetilsiloxano, PDMS. Este Kit inclui resina base PDMS e agente de reticulação. 
Unidade de temperaturaLaboratório OKOH201-T-UNIDADE-BLComponente da incubadora de microscópio
Tetrametiletilenodiamina, TEMEDSigma110189Tóxico
Tela sensível ao toqueLaboratório OKOOKO-TOQUEComponente da incubadora de microscópio
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil-1-triclorossilanoSigma78560459
Tripsina-EDTA (0,25%)gibco25200072
Tubos TygonTygonAJK00002Diâmetro externo (OD) = 3,2 mm, Diâmetro interno (ID) = 1,6 mm
Limpador ultrassônicoSufícioKD-300DE
Máquina de cura UV LEDGHUVGHS-MFLGFonte de luz UV-LED, faixa de emissão: 363-ndash; 370 nm, densidade de potência máxima: 230 mW/cm2
Módulo de umidificação sem vibraçãoLaboratório OKOHM-VFComponente da incubadora de microscópio
VisualizaçãoVisitron Systems GmbH-Hardware mais suave de imagem
Camada de wafer1Universidade Nacional de Cingapura, instalação de microfabricação do instituto de Mecanobiologia-O wafer é feito sob medida e o design refere-se a material suplementar.
Wafer-layer2Universidade Nacional de Cingapura, instalação de microfabricação do instituto de Mecanobiologia-O wafer é feito sob medida e o design refere-se a material suplementar.

Referências

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