Artigo de método

Dissecção de tecidos craniofaciais de peixe-zebra após coloração com azul de Alcian

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 de setembro de 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito aqui apresenta um procedimento simples e fácil de seguir para coloração e dissecação de cartilagens craniofaciais em uma larva de peixe-zebra com 5 dias de idade. Ele pode ser usado para estudar a anatomia, a forma e o tamanho dessas estruturas sob várias condições de desenvolvimento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O peixe-zebra, dada a sua transparência óptica, é um excelente modelo de vertebrado para estudar os mecanismos pelos quais as cartilagens craniofaciais se formam no embrião. As cartilagens craniofaciais podem ser amplamente classificadas em dois grupos, o neurocrânio e o viscerocrânio, que por sua vez podem ser subdivididos em vários grupos de cartilagens necessários para sustentar o cérebro e constituir o aparelho alimentar e respiratório, entre outros. Este protocolo descreverá primeiro um procedimento de coloração simples e estabelecido em peixe-zebra para visualizar esses grupos de cartilagem, seguido por uma metodologia para dissecar e separar o neuro e o viscerocrânio. A partir dessas dissecções, métricas simples de forma e tamanho podem ser facilmente obtidas e, neste protocolo, isso é demonstrado para o palato, que faz parte do neurocrânio anterior, um tecido frequentemente afetado na maioria dos distúrbios craniofaciais em humanos. O protocolo pode ser replicado de maneira direta, mesmo em ambientes com recursos limitados, fornecendo assim uma valiosa ferramenta educacional para estudantes de graduação serem apresentados à morfologia craniofacial.

Introdução

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A cartilagem craniofacial em vertebrados emerge de uma população de células multipotente chamada células da crista neural craniana1. Essas células são especificadas primeiro nas margens dorsais da placa neural nos embriões iniciais, que então migram grandes distâncias para atingir a região craniofacial e os arcos faríngeos antes de sediferenciarem 2,3. Os mecanismos de sinalização que impulsionam essa migração e diferenciação são amplamente conservados entre os vertebrados 4,5. Apesar disso, a organização, o tamanho e a forma dos elementos individuais da cartilagem são distintos entre as espécies, dando origem a diversas morfologias craniofaciais6. O peixe-zebra, em particular, emergiu como um poderoso sistema modelo para estudar a morfogênese craniofacial, dada a natureza transparente dos embriões até os estágios larvais. Usando procedimentos simples de coloração para marcar a cartilagem, a morfologia de muitas estruturas craniofaciais em peixe-zebra tem sido caracterizada sob diferentes perturbações nas vias de sinalização 7,8,9, bem como quando embriões ou larvas são expostos a poluentes comuns presentes no ambiente10. A coloração com azul de Alcian descrita aqui para marcação da cartilagem envolve o uso de condições não ácidas padronizadas por Walker e Kimmel11, que tem sido posteriormente utilizada por muitos laboratórios de peixe-zebra que trabalham no desenvolvimento craniofacial 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , incluindo a descrição do uso em ambientes de ensino médio20. A coloração sem ácido preserva as estruturas ósseas intactas, permitindo a coloração da cartilagem e dos ossos usando azul de alcian e vermelho de alizarina, respectivamente. No entanto, falta um protocolo detalhado para coloração, bem como para realizar dissecção precisa das cartilagens craniofaciais, especialmente para auxiliar esses estudos a serem realizados em ambientes com recursos limitados.

Embora a estrutura esquelética facial no peixe-zebra adulto seja bastante complexa, consistindo em 43 ossos derivados da cartilagem21, a cartilagem craniofacial em uma larva 5 dias após a fertilização (dpf), que acaba de adquirir a capacidade de se alimentar, é relativamente simples e pode ser amplamente dividida em um neurocrânio dorsal e viscerocrânio ventral4. Essas estruturas sustentam o cérebro, contribuem para o aparato de alimentação e dão origem a cartilagens de suporte para os tecidos branquiais. O protocolo aqui descrito permitirá a coloração das cartilagens do peixe-zebra com azul de Alcian, seguido de um procedimento detalhado para dissecar o neuro e o viscerocrânio em estruturas separadas, o que permitirá uma caracterização cuidadosa da forma e tamanho de várias cartilagens nessas estruturas. Como exemplo, medimos as dimensões da região anterior do palato (céu da boca) chamada de placa etmoidal, que é uma parte do neurocrânio.

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Protocolo

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A manutenção do peixe-zebra e os procedimentos experimentais utilizados neste estudo foram aprovados pelo comitê institucional de ética animal, vide Referência TIFR/IAEC/2023-1.

1. Preparação do reagente

  1. Mídia da E3:
    1. Prepare 50x estoque 1 misturando 3,25 g de fosfato de sódio dibásico (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g de di-hidrogenofosfato de potássio (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g de cloreto de sódio (4,084 mM NaCl) e 0,48 g de cloreto de potássio (0,128 mM KCl) em 1 L de água destilada.
    2. Prepare 50x estoque 2 misturando 2,43 g de cloreto de cálcio (0,33 mM CaCl2) e 4,07 g de sulfato de magnésio (0,33 mM MgSO4) em 1 L de água destilada.
    3. Para preparar 500 mL de 1x meio E3, para 480 mL de água destilada, adicione 10 mL cada um dos estoques 1 e 2 (pH = 7,4).
      NOTA: Use luvas durante a preparação dessas soluções.
  2. Paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato):
    1. Pré-aqueça 100 mL de 1x PBS a 68 °C. Adicionar 4 g de PFA e incubar a solução a 68 °C com mistura periódica até que o PFA esteja completamente dissolvido.
      NOTA: Use luvas e máscara ao preparar este reagente, de preferência sob uma capela de exaustão, pois o PFA é altamente tóxico.
  3. Solução de MS-222 a 0,05% (comumente conhecida como tricaína):
    1. Faça caldo de tricaína a 4% em E3 e armazene a 4 °C. Para fazer 10 mL de estoque de tricaína, adicione 0,40 g de MS-222 em 7 mL de E3. Agitar suavemente o tubo que contém a solução para misturar e completar o volume para 10 ml. Para fazer 50 mL de solução de tricaína a 0,05%, adicione 625 μL do estoque a 4% a 49,375 mL de E3.
      NOTA: Use luvas e máscara ao preparar este reagente.
  4. Solução de estoque azul de Alcian a 0,4% em etanol a 70%
    1. Para preparar 2 mL da solução estoque, dissolva 8 mg de azul de Alcian em 1 mL de etanol a 50%. Aquecer a solução a 37 °C durante 15-20 min com mistura periódica para dissolver. Assim que a mancha se dissolver, complete a solução para etanol a 70% adicionando 900 μL de etanol a 100% e 100 μL de água destilada.
      NOTA: A solução estoque pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 2 semanas.
  5. Solução de coloração - 0,02% de azul de Alcian, 200 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 70% de etanol
    1. Para preparar 5 mL de solução de corante azul de Alcian, adicione 1 mL de MgCl2 1 M, 3,5 mL de etanol 100% e 250 μL de estoque de azul de Alcian a 0,4% (8 mg de azul de Alcian em 2 mL de etanol a 70%) a 250 μL de água e misture bem.
      NOTA: Prepare a solução de mancha fresca para obter melhores resultados de coloração.
  6. Solução de alvejante:
    1. Misture volumes iguais de peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2) e hidróxido de potássio a 2% (KOH). Para fazer 2 mL de solução de alvejante, misture 1 mL de peróxido de hidrogênio a 3% e 1 mL de hidróxido de potássio a 2%.
      NOTA: Prepare esta solução antes de iniciar esta etapa. Como H2O2 é sensível à luz, proteja-o o máximo possível da exposição à luz. Use luvas ao manusear H2O2 e KOH.
  7. Solução I: 20% de glicerol + 0,25% de KOH
    NOTA: Como o glicerol é altamente viscoso, pipete com cuidado. Use luvas ao preparar essas soluções.
    1. Para preparar 5 mL de solução I, adicione 2 mL de glicerol a 50% e 625 μL de KOH a 2,375 mL de água e misture bem.
  8. Solução II: 50% de glicerol + 0,25% de KOH
    1. Para preparar 5 mL de solução II, adicione 3,570 mL de glicerol a 70% e 625 μL de KOH a 805 μL de água e misture bem.
  9. Solução de armazenamento: 50% de glicerol + 0,1% de KOH
    1. Para preparar 5 mL de solução de armazenamento, adicione 3.570 mL de glicerol a 70% e 250 μL de KOH a 1.180 mL de água e misture bem.
  10. 3% de agarose
    1. Dissolva 3 g de agarose em 100 mL de água destilada. Microondas até que a solução fique límpida.
  11. 0,1% PBST (0,1% Tween 20 em 1x PBS)
    1. Para fazer 1 L de 1x PBS, adicione 8 g de NaCl, 0,20 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 em 1.000 mL de água destilada. Misture a solução e ajuste o pH para 7,4. Para fazer 500 mL de PBST a 0,1%, adicione 5 mL de Tween 20 a 495 mL de 1x PBS.
  12. Solução DAPI de 0,50 μg/mL
    1. Faça estoque de DAPI de 10 mg/mL em 1x PBS. Para fazer 10 mL de solução de DAPI a 0,50 μg/mL, adicione 0,50 μL do estoque a 10 mL de 1x PBS e agite vigorosamente para garantir que o DAPI se dissolva completamente.
      NOTA: Use luvas ao preparar essas soluções. Proteja o DAPI da luz, pois é sensível à luz. O estoque DAPI pode ser armazenado a 4 °C por mais de um ano.

2. Colheita de embriões

  1. Instale pares de peixes-zebra machos e fêmeas em tanques de reprodução na noite anterior à necessidade de embriões, com os peixes machos e fêmeas separados por barreiras.
  2. Remova as barreiras na manhã seguinte e colete os embriões dentro de 15 a 20 minutos após a remoção das barreiras.
    NOTA: O momento da remoção da barreira é útil no estadiamento de embriões e larvas de peixe-zebra.
  3. Levantar os embriões a 28,5 °C até atingirem 5 dpf.
    NOTA: Certifique-se de substituir a mídia E3 por um novo lote de E3 pré-aquecido a 28.5 °C uma vez a cada 2 dias.

3. Coloração azul Alcian

NOTA: Use luvas ao realizar este experimento

  1. Anestesiar 20-25 larvas de peixe-zebra de 5 dias usando tricaína a 0,05% em um tubo de microcentrífuga (MCT) de 2 mL.
  2. Depois que as larvas pararem de se mover, o que normalmente leva ~ 4-5 min, remova o anestésico e fixe-as em 1,5 mL de PFA a 4% à temperatura ambiente (RT) em um balancim a 60 rpm por 2 h.
  3. Remova o máximo possível do fixador usando uma pipeta e adicione 1,5 mL de etanol a 50% à amostra. Incube por 10 min enquanto balança a 60 rpm em RT.
  4. Remova o máximo possível de etanol usando uma pipeta e adicione 1,5 mL da solução de corante azul de Alcian.
  5. Incubar as larvas fixas na solução corante durante 18-20 h num balancim a 60 rpm à RT.
    NOTA: A incubação por um período de tempo mais curto ou mais longo pode fazer com que certas regiões da cartilagem fiquem submanchadas ou supermarcadas, respectivamente. Aqui, 18-20 h de coloração pareciam funcionar melhor para visualizar claramente o neuro e o viscerocrânio de uma larva de 5 dias de idade.
  6. Remova a solução de mancha, adicione 1,5 mL de água destilada e incube por 1-2 min em um balancim em RT.
    NOTA: A coloração pode ser interrompida nesta etapa para visualizar os limites celulares nas cartilagens dissecadas. No entanto, uma desvantagem de interromper o protocolo de coloração nesta etapa sem realizar as etapas de limpeza subsequentes é que os limites do neuro e do viscerocrânio ainda permanecerão ligeiramente borrados, e torna-se mais desafiador realizar as dissecções com precisão.
  7. Adicionar 1 ml da solução de lixívia à amostra e incubar durante 20 min à temperatura livre sem qualquer cobertura sobre a placa ou os poços.
    NOTA: Não cubra os MCTs durante esta etapa, pois a reação entre o peróxido de hidrogênio e o hidróxido de potássio produz gás oxigênio, o que pode fazer com que a tampa se solte se fechada.
  8. Remova a solução de alvejante e execute as seguintes etapas de limpeza do tecido.
    1. Adicionar 1,5 ml de solução I à amostra e manter um balancim a 60 rpm durante 40 min à RT.
    2. Retirar a solução I e adicionar 1,5 ml da solução II à amostra e manter num balancim a 60 rpm durante 2 h em RT.
      NOTA: As etapas de limpeza ajudam a remover o excesso de mancha, melhorando a clareza óptica das amostras e, assim, auxiliando na realização das dissecações com eficiência. Manuseie as amostras com cuidado ao trocar as soluções, pois qualquer dano pode afetar a análise futura de sua morfologia.
  9. Remova a solução II e adicione 1,5-2 mL da solução de armazenamento. Devido à presença de glicerol, as amostras coradas afundam gradualmente em 10 minutos.
    NOTA: As amostras coradas podem ser armazenadas a 4 °C por mais de um ano.

4. Dissecção do esqueleto craniofacial

  1. Derreta a solução de agarose a 3% no micro-ondas até que a solução fique clara.
    NOTA: Não superaqueça, pois a solução pode borbulhar para fora do frasco. Mantenha uma verificação cuidadosa da solução enquanto executa esta etapa.
  2. Cubra uma placa de Petri de 90 mm com agarose a 3%, despejando a agarose derretida até cobrir um terço da profundidade da placa de Petri e deixando-a solidificar. As dissecações serão realizadas nesta placa de Petri.
    NOTA: As placas de Petri com revestimento de agarose podem ser preparadas com uma semana de antecedência e armazenadas a 4 °C. O revestimento de agarose fornece um substrato mais macio no qual as dissecções podem ser realizadas sem danificar a pinça.
  3. Limpe a pinça a ser usada com etanol a 70% e limpe-a com um pedaço limpo de papel de seda de laboratório padrão.
  4. Usando uma pipeta Pasteur, transfira 3-4 larvas coradas junto com 0,5 mL de solução de armazenamento para a placa de Petri revestida de agarose.
    NOTA: A solução de armazenamento garante mais clareza óptica para realizar as dissecações em comparação com fazer o mesmo no E3.
  5. Oriente uma larva corada em seu lado lateral (Figura 1A) e raspe cuidadosamente a gema do corpo da larva usando a pinça
    NOTA: A Figura 1B mostra um embrião onde a gema foi removida. É uma boa prática transferir o embrião raspado com gema para uma nova placa de Petri antes de prosseguir com outras etapas de dissecação, para que a massa pegajosa da gema flutuando não interfira na dissecção.
  6. Depois que a gema for removida, segure a larva pela região da cauda com uma pinça e use a outra para remover cuidadosamente os olhos.
    NOTA: A Figura 1C mostra um embrião com a gema e os olhos removidos. Os olhos devem ser removidos com cautela, pois sua proximidade com o esqueleto craniofacial pode interferir em sua dissecção.
  7. Usando a pinça, puxe e aperte cuidadosamente o cérebro e outros tecidos dorsais ao neurocrânio. Segure a larva imóvel com um par de pinças e use o outro par de pinças para fazer uma incisão no meio (Figura 1C, seta vermelha), seguida de pinçar os tecidos (Figura 1D).
    NOTA: Ao executar esta etapa, tenha cuidado ao remover os tecidos mais próximos das regiões mais anteriores do neurocrânio, pois a cartilagem pode sair com eles.
  8. Separe a cabeça da larva do resto do corpo. A região da cabeça após esta etapa contém principalmente o neurocrânio e o viscerocrânio ligados um ao outro em dois pontos - nas extremidades anterior e posterior - juntamente com alguns pequenos tecidos não corados ligados a essas estruturas craniofaciais (Figura 1E).
    NOTA: É difícil remover totalmente os tecidos não corados diretamente ligados ao neurocrânio e ao viscerocrânio. Mesmo que alguns tecidos residuais estejam presentes, sua presença não afetará nenhuma análise de forma ou tamanho a jusante, pois não são corados.
  9. Corte cuidadosamente as duas conexões entre o neurocrânio e o viscerocrânio para separá-las (Figura 1F, linhas tracejadas vermelhas). Veja a Figura 2 para imagens do neurocrânio e do viscerocrânio, tanto em embriões intactos quanto em embriões dissecados.
  10. Em uma lâmina de vidro limpa, adicione uma ou duas gotas de glicerol 100%. Com a ajuda de uma pinça, transfira cuidadosamente o neurocrânio ou viscerocrânio dissecado para esta lâmina. Use uma pinça para colocar suavemente uma lamínula nesses tecidos, garantindo que não se formem bolhas, e sele a lamínula em todas as lâminas com esmalte.
    NOTA: Estas lâminas podem ser armazenadas a 4 °C por mais de um ano sem perder a mancha.

5. Quantificação das dimensões da placa etmoidal

  1. Adquira imagens do palato usando uma câmera acoplada ao microscópio estéreo (Figura 2D). Na ausência de uma câmera de nível científico, conecte um smartphone padrão ao microscópio estéreo para adquirir imagens.
  2. Para quantificação, carregue a imagem de um palato em FIJI22 e, em seguida, use a ferramenta de linha para medir a largura e a altura da placa etmoidal em mícrons (consulte a Figura 3A-C) e determine as dimensões usando a resolução de pixels da câmera.
  3. Desenhe um contorno ao redor da placa etmoidal e clique em Analisar | Definir Medidas | área para obter a área da placa etmoidal (Figura 3D,E).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O esqueleto craniofacial do peixe-zebra é totalmente cartilaginoso 5 dias após a fertilização (dpf) e, portanto, pode ser corado com azul de Alcian, que é um corante básico capaz de se ligar a glicosaminoglicanos presentes em abundância nas cartilagens23. Isso resulta na coloração da cartilagem de azul (Figura 1) para que possa ser distinguida de outros tecidos presentes na larva usando um microscópio estéreo padrão disponível na maioria dos ambientes de laboratório d...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As malformações craniofaciais constituem a maioria de todos os defeitos congênitos em humanos, muitas vezes levando à mortalidade infantil. No entanto, a etiologia subjacente na maioria das anomalias craniofaciais ainda precisa ser elucidada25. As estruturas craniofaciais são complexas em qualquer vertebrado e, do ponto de vista do ambiente de graduação, o primeiro requisito é, portanto, ter uma ferramenta educacional que forneça aos alunos uma visão geral das est...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Kalidas Kohale e sua equipe pela manutenção das instalações de peixes. A SRN reconhece o apoio financeiro do Departamento de Energia Atômica (DAE), Governo da Índia (Identificação do Projeto nº. RTI4003, DAE OM nº 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 de 11.02.2020), o programa Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) e a Bolsa de Pesquisa Inicial do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SRG/2023/001716). Agradecemos ao Dr. Shweta Verma, do laboratório, pelos comentários perspicazes. Agradecemos a Swetha Nagarajan e Upal Chatterjee pela ajuda na criação de figuras para o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseBiociência da Lonza50004Para revestimento de placas de Petri
Azul Alcian 8G Sigma-AldrichResposta 3157Para manchar cartilagens
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma-Aldrich12022Para fazer buffers
CâmeraOlimpoDP28Para aquisição de imagens
DAPICiências da Vida da Roche10236276001Para rotular núcleos
EtanolHoneywell32221Solvente para corante azul de alcian
FIJIVersão: ImageJ 1.54f
FórcepsDumontDumontPara realizar dissecações
GlicerolMP biomédicos193996Para fazer lavagens e montar amostras 
Peróxido de hidrogénioMP biomédicos194057Para fazer solução de alvejante
Cloreto de magnésio hexahidratadoSARD BiociênciasSBRC0217Para fazer buffers
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigma-AldrichM2773Para fazer buffers
MS-222 (Tricocaína)Sigma-AldrichRolamento A5040Para anestesiar larvas
Cloreto de potássioSigma-AldrichPág. 9541Para fazer buffers
Hidróxido de potássioSigma-Aldrich484016Para fazer buffers
Fosfato de potássio monobásicoSigma-AldrichPág. 0662Para fazer buffers
Cloreto de sódioSigma-AldrichS3014Para fazer buffers
Fosfato de sódio dibásicoSigma-Aldrich71640Para fazer buffers
EstereoscópioOlimpoSZX61Para realizar dissecações
Interpolação-20HIMÍDIATC287Detergente, utilizado para permeabilizar células

Referências

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Disseca o Craniofacial de ZebrafishColora o com Azul de AlcianCartilagem CraniofacialDisseca o do Neurocr nioDisseca o do Viscerocr nioPlaca EtmoideMorfog nese do PalatoMicroscopia de Folha de LuzClareamento de TecidosAn lise de Imagem

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