Este estudo examina as variações circadianas na liberação do fator de crescimento da fibrina rica em plaquetas (PRF) e explora as correlações com os níveis de cortisol, com o objetivo de otimizar o tempo dos procedimentos regenerativos baseados em PRF.
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Artigo de investigação
Avaliação da variação circadiana nos fatores de crescimento da fibrina rica em plaquetas: um estudo piloto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fibrina rica em plaquetas (PRF) tem extensas aplicações clínicas em odontologia, particularmente na regeneração de tecidos moles e duros, cicatrização do alvéolo de extração, tratamento de defeitos periodontais, aumento do seio maxilar e procedimentos mucogengivais. O PRF é um biomaterial rico em fator de crescimento derivado de plaquetas, preparado por meio de um protocolo de centrifugação de etapa única. Este estudo teve como objetivo avaliar se os fatores de crescimento derivados do PRF exibem variação circadiana entre as horas da manhã e da noite. Participaram vinte voluntários saudáveis, cada um fornecendo seis amostras de sangue venoso, três às 08:00 e três às 20:00. A partir de cada momento, um tubo foi usado para hemograma completo, um para análise de cortisol sérico e um para preparo de PRF (centrifugado a 708 x gpor 12 min). Os fatores de crescimento (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) no PRF foram medidos em 24 h e 72 h usando ELISA. Seus níveis foram comparados entre os momentos e correlacionados com os níveis séricos de cortisol. Os níveis de FGFR foram significativamente maiores em 72 h do que em 24 h em amostras noturnas. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas para IGF-1, PDGF, VEGF ou TGFβ-1 entre a manhã e a noite. Os níveis de cortisol foram negativamente correlacionados com PDGF em 72 h em amostras matinais e com IGF-1 em 72 h em amostras noturnas; no entanto, nenhuma outra correlação significativa foi observada. Esses achados sugerem que o momento da coleta de sangue não influencia significativamente o conteúdo do fator de crescimento PRF, indicando flexibilidade nos protocolos clínicos em relação ao tempo da amostra.
Introdução
A fibrina rica em plaquetas (PRF) é um concentrado de plaquetas de segunda geração comumente usado em odontologia regenerativa devido à sua origem autóloga, facilidade de preparo e conteúdo biologicamente ativo1. Formado pela centrifugação do sangue total sem anticoagulantes, o PRF fornece uma matriz de fibrina rica em plaquetas e leucócitos que secretam fatores de crescimento como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador-beta 1 (TGF-β1), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFr). Essas biomoléculas desempenham papéis centrais na proliferação celular, angiogênese, remodelação da matriz extracelular e regeneração tecidual2. Em comparação com o plasma rico em plaquetas (PRP), que requer anticoagulantes e ativação exógena, o PRF é produzido por meio de um processo de etapa única, livre de anticoagulantes, que produz um andaime fisiológico de fibrina com leucócitos e plaquetas aprisionados. Essa arquitetura suporta uma liberação mais lenta e sustentada de fatores de crescimento e citocinas, potencialmente aumentando a estabilidade da ferida e o reparo precoce do tecido, reduzindo a complexidade e o custo do manuseio 1,2. Além disso, a ausência de anticoagulantes e ativadores minimiza a variabilidade relacionada à manipulação e pode preservar melhor o comportamento das plaquetas nativas, oferecendo vantagens práticas para uso em consultório e padronização entre os operadores2.
Apesar de seu amplo uso clínico, a dinâmica temporal dos componentes bioativos do PRF permanece pouco compreendida. O ritmo circadiano, um ciclo biológico intrínseco de 24 horas, influencia vários sistemas fisiológicos, incluindo função imunológica, secreção hormonal e parâmetros hematológicos 3,4. O cortisol, o principal hormônio circadiano, atinge o pico no início da manhã e diminui gradualmente ao longo do dia5. É importante ressaltar que estudos mostraram que a atividade plaquetária, a capacidade de agregação e a contagem também podem ser moduladas por mecanismos circadianos, com implicações para a coagulação e cicatrização de feridas6.
Como o PRF é derivado diretamente do sangue periférico, o tempo circadiano da coleta de sangue pode afetar o status de ativação plaquetária e a subsequente liberação de fatores de crescimento durante a polimerização da fibrina. Embora as variações diurnas na contagem de plaquetas e fatores de crescimento no plasma rico em plaquetas tenham sido previamente analisadas por Aoto et al.7, não há estudos que examinem sistematicamente se o PRF preparado em diferentes momentos do dia exibe diferenças mensuráveis em sua composição de fatores de crescimento. Portanto, este estudo piloto tem como objetivo investigar a variação circadiana dos fatores de crescimento derivados da PRF, comparando amostras coletadas pela manhã e à noite de indivíduos saudáveis. Além disso, avaliamos os níveis séricos de cortisol em cada momento e exploramos suas correlações com a liberação do fator de crescimento PRF. A compreensão dessa variabilidade temporal pode ajudar a otimizar os protocolos clínicos e contribuir para a padronização de tratamentos regenerativos baseados em PRF. A hipótese nula deste estudo foi que o tempo circadiano da coleta de sangue não influencia significativamente a concentração de fatores de crescimento liberados pela fibrina rica em plaquetas (PRF); no entanto, com base na conhecida regulação circadiana da atividade plaquetária e secreção hormonal, foi inicialmente hipotetizado que o horário da coleta de sangue (manhã vs. noite) pode alterar o conteúdo do fator de crescimento PRF. Do ponto de vista clínico, esclarecer se o conteúdo do fator de crescimento PRF é sensível à variação circadiana é importante para a padronização de protocolos regenerativos. Se a liberação do fator de crescimento permanecer praticamente estável ao longo do dia, os médicos podem ter certeza de que o momento da punção venosa pode não afetar substancialmente os resultados do tratamento, permitindo flexibilidade no agendamento de procedimentos. Por outro lado, se surgirem diferenças sutis em fatores selecionados, como aqueles envolvidos na angiogênese ou reparo tecidual, o tempo de coleta de sangue pode ser otimizado nos casos em que o potencial regenerativo máximo é desejado, por exemplo, em condições de cicatrização comprometidas.
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Protocolo
Este estudo foi realizado no Departamento de Periodontologia da Faculdade de Odontologia da Universidade de Çukurova, Adana, Turquia, com a participação de 20 voluntários saudáveis. Antes da inclusão, todos os participantes foram informados sobre o objetivo, metodologia e procedimentos do estudo, e o consentimento informado por escrito foi obtido. A aprovação ética foi concedida pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Faculdade de Medicina da Universidade de Çukurova (Aprovação nº: 125/55, Data: 16.09.2022). Todos os procedimentos, incluindo orientações essenciais de biossegurança para o manuseio de sangue humano e instruções de descarte de resíduos para materiais de risco biológico e reagentes químicos, foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH-CDC8. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Seleção dos participantes
Participaram do estudo indivíduos saudáveis entre 18 e 25 anos de idade, sem doença sistêmica conhecida, e que demonstraram cooperação adequada durante os procedimentos. Foram excluídos os indivíduos que apresentavam alguma condição sistêmica, estavam grávidas ou amamentando, ou estavam em uso de algum medicamento ou agente hormonal que pudesse afetar os parâmetros hematológicos ou hormonais.
2. Colheita de sangue e atribuição de grupos
Um total de seis amostras de sangue venoso de 10 mL foram coletadas de cada participante, três pela manhã (08:00) e três à noite (20:00). Tubos PRF estéreis de vidro sem aditivos (10 mL) foram usados no estudo. Na sessão da manhã, o Tubo 1 foi usado para hemograma completo, o Tubo 2 para análise do cortisol sérico e o Tubo 3 para preparação do PRF seguido de análise do fator de crescimento. Na sessão noturna, o Tubo 4 foi usado para hemograma, o Tubo 5 para análise do cortisol sérico e o Tubo 6 para preparação de PRF e análise do fator de crescimento. Com base no horário da coleta de sangue, as amostras foram alocadas em dois grupos: o Grupo 1 consistiu em PRF puro preparado a partir do sangue da manhã (08:00) e o Grupo 2 consistiu em PRF puro preparado a partir do sangue da noite (20:00).
3. PRF preparação
As amostras de sangue foram centrifugadas a 708 x g por 12 min em temperatura ambiente usando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo de 40° e tubos de vidro de 10 mL. O dispositivo utilizado tinha um raio de rotor ajustável entre 88 mm e 110 mm; Neste estudo, um raio de 88 mm foi selecionado para padronizar o protocolo. Nenhum anticoagulante foi usado durante o procedimento. Após a centrifugação, os PRF resultantes foram avaliados macroscopicamente para garantir a formação adequada, que é caracterizada por uma superfície lisa e homogênea, uma forma elástica e cilíndrica e uma consistência compacta e firme.
4. Análise ELISA do fator de crescimento
Os coágulos de PRF foram cuidadosamente separados da camada de hemácias usando tesouras estéreis. Cada coágulo foi pesado e o meio de cultura RPMI-1640 foi adicionado na proporção de 1:1 com base no peso (g = mL) para padronizar o ambiente de incubação em todas as amostras e garantir a difusão consistente de fatores de crescimento solúveis da matriz PRF. Essa proporção permite a extração proporcional com base no tamanho do coágulo, minimizando a variabilidade nas concentrações do fator de crescimento devido a massas desiguais de coágulo. As amostras foram incubadas em um agitador orbital a 100 rpm e 3 °C por 24 h e 72 h para promover a difusão uniforme dos fatores de crescimento da matriz PRF para o meio de cultura. Após a incubação, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -8 ° C até a análise. As concentrações de fator de crescimento foram quantificadas usando kits comerciais de ELISA, incluindo FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF e TGF-β1, seguindo o protocolo de preparação do fabricante 9,10.
5. Etapas ELISA
Padrões e amostras (100 μL cada) foram adicionados aos poços e incubados a 3 °C por 90 min. Os poços foram então lavados três vezes com tampão de lavagem. Em seguida, 100 μL de anticorpo marcado com biotina foram adicionados a cada poço e incubados a 3 ° C por 60 min, seguidos por três lavagens adicionais. Em seguida, 100 μL de solução de peroxidase de rábano (HRP) foram adicionados e incubados a 3 °C por 30 min. Após mais três lavagens, 100 μL de reagente de substrato foram adicionados e incubados por 15 min. Finalmente, 50 μL de solução de parada foram adicionados a cada poço e a absorbância foi medida a 450 nm.
6. Análise estatística
As variáveis categóricas foram expressas em frequências e porcentagens, enquanto os dados numéricos foram apresentados como média ± desvio padrão ou mediana (mínimo-máximo), conforme apropriado. A normalidade das variáveis numéricas foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. As variáveis que não atenderam ao pressuposto de normalidade, especificamente as concentrações de fatores de crescimento e os níveis de cortisol, foram analisadas por meio de testes não paramétricos, incluindo o teste de Wilcoxon para comparações pareadas e o coeficiente de correlação de postos de Spearman para associações. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software IBM SPSS Statistics. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as comparações foram realizadas dentro do sujeito para controle da variabilidade interindividual.
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Resultados
Todos os 20 participantes voluntários (10 mulheres e 10 homens, com idades entre 18 e 25 anos) completaram o estudo sem perda amostral. Os resultados do hemograma completo confirmaram que os parâmetros plaquetários e hematológicos estavam dentro dos limites de referência normais em todas as amostras, validando a confiabilidade das preparações de PRF.
Comparação dos parâmetros sanguíneos entre a manhã e a noite
Os níveis de cortisol foram significativamente maiores nas amost...
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Discussão
Com base na conhecida regulação circadiana da atividade plaquetária e secreção hormonal, foi inicialmente hipotetizado que o horário da coleta de sangue (manhã vs. noite) pode alterar o conteúdo do fator de crescimento PRF. O objetivo deste estudo foi testar se existe alguma variação temporal e, em caso afirmativo, se ela se correlaciona com os níveis séricos de cortisol e parâmetros hematológicos. O estudo foi projetado como uma investigação piloto para explorar a variação circ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MÁQUINA DO CENTRIFUGADOR | DUO | 913023410238 | |
| KITS DE ELISA, | Teste fino, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Nº de catálogo:EH0165) | |
| KITS DE ELISA, | Teste fino, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (Nº de catálogo:EH3531) | |
| KITS DE ELISA, | Teste fino, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (Nº de catálogo:EH0715) | |
| KITS DE ELISA, | Teste fino, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (Nº de catálogo:EH0327) | |
| KITS DE ELISA, | Teste fino, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-β 1 (Nº de catálogo: EH0287) | |
| Tubos PRF |  | 6370 |
Referências
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