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Artigo de método

Estabelecimento e manutenção de organoides de câncer de próstata derivados de pacientes: um protocolo experimental detalhado

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DOI:

10.3791/68912

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14 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

Neste artigo

Resumo

A heterogeneidade do câncer de próstata e a resistência ao tratamento continuam sendo desafios. Descrevemos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes (PDOs) que preservam as principais características do tumor parental. Este modelo padronizado suporta a triagem de medicamentos e os avanços da medicina de precisão.

Resumo

O câncer de próstata (CaP) é uma neoplasia maligna altamente heterogênea e uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em homens, com desafios clínicos significativos para lidar com a resistência ao tratamento e a progressão da doença. Os modelos pré-clínicos existentes, como linhagens celulares bidimensionais (2D) e xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs), têm limitações em recapitular fielmente a complexidade do CaP, incluindo heterogeneidade tumoral, sinalização dependente do receptor de andrógeno (AR) e interações microambientais. Para preencher essa lacuna, este estudo apresenta um protocolo robusto e reprodutível para o estabelecimento de organoides derivados de pacientes (PDOs) que preservam as características genéticas, fenotípicas e histológicas dos tumores parentais. Este método permite o cultivo de organoides de CaP localizado e avançado, fornecendo um modelo biologicamente relevante para estudar mecanismos de doenças, resposta a medicamentos e descoberta de biomarcadores. Os resultados demonstram a capacidade do protocolo de gerar organoides a partir de uma variedade de espécimes clínicos, com aplicações na triagem de medicamentos de alto rendimento e medicina de precisão. Ao oferecer um fluxo de trabalho padronizado que aborda os principais desafios técnicos, este estudo destaca a importância dos PDOs como ferramentas versáteis para o avanço da pesquisa do câncer de próstata e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes.

Introdução

O câncer de próstata (CaP) continua sendo uma das neoplasias malignas mais prevalentes em homens em todo o mundo, perdendo apenas para o câncer de pulmão na mortalidade relacionada ao câncer. De acordo com estudos epidemiológicos recentes, a incidência global de CaP tem aumentado constantemente, e projeta-se que o número de novos casos de câncer de próstata anualmente aumentará de 1,4 milhão em 2020 para 2,9 milhões em 20401. Apesar dos avanços na detecção precoce e no desenvolvimento de novas terapias, incluindo terapia de privação androgênica (ADT) e agentes direcionados, o câncer de próstata continua sendo um desafio clínico significativo devido à sua natureza heterogênea e ao inevitável desenvolvimento de resistência ao tratamento, particularmente em estágios avançados2. O câncer de próstata resistente à castração (CRPC), que surge após a falha da ADT, representa uma forma letal da doença, caracterizada por resultados de sobrevida ruins e opções terapêuticas limitadas3. Compreender os mecanismos moleculares que impulsionam a progressão e a resistência da doença é, portanto, crucial para identificar novos alvos terapêuticos e melhorar os resultados dos pacientes.

O desenvolvimento de modelos pré-clínicos que imitam com precisão a complexidade do câncer de próstata humano é fundamental para o avanço da pesquisa neste campo. As culturas de células 2D tradicionais, embora amplamente utilizadas, não conseguem recapitular a heterogeneidade celular, a arquitetura do tumor e o microambiente observados in vivo4. Como resultado, a utilidade translacional desses modelos é limitada, particularmente para estudar a progressão do tumor, a resistência aos medicamentos e as interações dinâmicas entre as células cancerígenas e o microambiente tumoral5. Em contraste, xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs) e culturas organoides surgiram como ferramentas mais sofisticadas que preenchem a lacuna entre as linhagens celulares convencionais e os tumores clínicos 4,5,6.

Os sistemas de cultura organoide revolucionaram a modelagem do câncer. Essas estruturas tridimensionais (3D) são derivadas de tecidos do paciente e podem reter as características histológicas, genômicas e fenotípicas do tumor original 7,8,9,10. É importante ressaltar que os organoides do câncer de próstata preservam características críticas da heterogeneidade da doença, incluindo sinalização AR, resistência ao tratamento e instabilidade genômica, tornando-os ferramentas ideais para pesquisa translacional11. Em comparação com os modelos PDX, os organoides são mais econômicos, escaláveis e passíveis de manipulação genética, o que facilita a triagem de medicamentos de alto rendimento, a descoberta de biomarcadores e estudos funcionais. As plataformas organoides já mostraram resultados promissores em outras neoplasias malignas, incluindo câncer colorretal, de mama e pancreático, ressaltando seu potencial para oncologia personalizada 4,12.

No entanto, estabelecer e manter organoides de câncer de próstata (PCOs) apresenta desafios técnicos únicos. O epitélio da próstata é inerentemente dependente da sinalização androgênica e do suporte da matriz extracelular (MEC), necessitando de condições de cultura especializadas. Além disso, o câncer de próstata exibe uma ampla gama de comportamentos clínicos, desde tumores sensíveis a hormônios localizados até CRPC altamente agressivo e refratário ao tratamento, o que complica ainda mais o desenvolvimento de sistemas organoides reprodutíveis11,12. Protocolos bem-sucedidos para geração de PCO devem abordar essas complexidades biológicas, otimizando as principais etapas, incluindo processamento de tecidos, digestão enzimática, incorporação de ECM e suplementação com fatores críticos de crescimento, hormônios e pequenas moléculas. Tais protocolos são essenciais para garantir a fidelidade dos organoides aos seus tumores parentais e facilitar sua aplicação em análises posteriores.

Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado e reprodutível para o estabelecimento e manutenção a longo prazo de DOPs. Nosso fluxo de trabalho abrange todo o processo, desde a aquisição de tecidos e processamento de biópsias e espécimes cirúrgicos até a passagem de organoides, criopreservação e ressuscitação (Figura 1). Este protocolo foi otimizado para preservar a integridade fenotípica e genômica dos tecidos do câncer de próstata, permitindo sistemas de cultura 3D robustos adequados para uma ampla gama de aplicações, incluindo perfis genômicos, testes de resposta a medicamentos e ensaios funcionais. Notavelmente, nosso método aborda obstáculos técnicos comuns, como baixas taxas de sucesso na cultura de organoides, crescimento abaixo do ideal e dificuldades na passagem subsequente, e fornece diretrizes padronizadas, facilitando assim a reprodutibilidade entre os laboratórios.

O desenvolvimento de modelos organoides confiáveis de câncer de próstata tem imenso significado para a pesquisa básica e translacional13. Esses sistemas oferecem uma plataforma poderosa para decifrar mecanismos de doenças, identificar novos alvos terapêuticos e avançar em abordagens de medicina de precisão adaptadas a pacientes individuais. Ao abordar as lacunas técnicas existentes e fornecer um protocolo abrangente, nosso trabalho visa acelerar a adoção da tecnologia organoide na pesquisa do câncer de próstata e apoiar os esforços globais para combater essa doença desafiadora14.

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Protocolo

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Popular de Wuxi No. 2 (Número de aprovação: Y-38 (2023)). Todos os participantes forneceram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os dados dos pacientes foram desidentificados para garantir a proteção da privacidade em conformidade com os padrões éticos.

1. Coleta de amostras

  1. Aquisição de tecido
    1. Preparação antes da amostragem
      1. Critério de inclusão: Garantir que todos os participantes tenham um diagnóstico confirmado de câncer de próstata, conforme determinado por exame patológico ou de imagem. Derive amostras de tumor de ressecção cirúrgica, biópsia ou outras amostras clínicas. Certifique-se de que todos os participantes tenham 18 anos ou mais e não tenham outras malignidades, para excluir possíveis interferências de outros tipos de câncer no estudo do câncer de próstata. De todos os participantes, coletar o consentimento informado por escrito para participar do estudo e permitir que suas amostras sejam usadas para pesquisas científicas.
      2. Critério de exclusão: Excluir pacientes cujas amostras não contenham tecido tumoral suficiente para cultura ou análise. Exclua os pacientes que retiram o consentimento ou não podem fornecer as amostras necessárias durante o estudo.
    2. Amostras de biópsia por agulha de núcleo de próstata:Use uma agulha especial para obter amostras de tecido da próstata. Colocar imediatamente o tecido em solução de conservação (meio Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) + solução inibidora de rochas (diluição 1:2000)) e transportá-lo para o laboratório em gelo, garantindo a entrega no prazo de 24 h.
      NOTA: Direcione com precisão o tecido do câncer de próstata e realize amostragem em vários locais em diferentes regiões anatômicas. Realize 1-2 punções por local, cada uma produzindo ≥ amostras de núcleo de 1 cm.
    3. Amostras de prostatectomia radical: Após a coleta, coloque rapidamente as amostras em solução de preservação (meio adDMEM/F-12 + solução inibidora de rocha (diluição 1:2000)) e transporte em gelo, garantindo a entrega ao laboratório em até 24 h.
      NOTA: Mais fragmentos de tecido podem ser obtidos através da prostatectomia radical15.
      Coletar amostras ≥ 1g (≈ 5 mm de diâmetro), minimizando a contaminação por tecido normal. Coordene no pré-operatório com os médicos para especificar: 1) núcleo do tumor; 2) tecido peritumoral; 3) controle normal. Priorize fragmentos firmes com descoloração cinza-amarelada. Se ausente, implemente amostragem aleatória sistemática. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre a coleta de amostras.
  2. Processamento de amostras
    1. Rotulagem e categorização: Rotule claramente as amostras de tecido coletadas (incluindo nome do paciente, número de hospitalização, nome do tecido, local do tecido e tipo de tecido).
    2. Criopreservação: Processar amostras de tecido imediatamente (≤ 12h após a coleta). Colocar as amostras numa solução de conservação pré-arrefecida (4 °C) [meio adDMEM/F-12 + solução inibidora de rochas (diluição 1:2000)] e armazená-las a 4 °C. Prossiga com outras etapas experimentais dentro de 4-6 h para obter os melhores resultados.
  3. Transporte e armazenamento
    1. Transporte da cadeia de frio: Transporte as amostras de tecido para o laboratório em condições de baixa temperatura.
    2. Registro de amostra: Ao chegar ao laboratório, verifique e registre as informações da amostra em detalhes, incluindo as informações pessoais básicas do paciente, tipo de tecido, nome e local de amostragem.
  4. Recebimento e inspeção do laboratório:
    1. Inspeção de amostras: Abra as amostras em um gabinete de biossegurança e inspecione se há perda, contaminação ou anormalidades visíveis.
    2. Dissecção da amostra: Extraia a amostra e coloque-a em uma placa de cultura. Use uma tesoura de tecido ou um bisturi para dividir a amostra em pequenos pedaços (aproximadamente 1-3 mm³) para uso em experimentos subsequentes.

2. Procedimentos experimentais

  1. Preparação de suspensões de células primárias de tecidos
    1. Preservação: Coloque os blocos de tecido coletados em tubos centrífugos cônicos estéreis de 50 mL, garantindo que os tecidos sejam categorizados por tipo. Rotule cada tubo adequadamente. Adicionar solução de preservação (meio adDMEM/F-12 + solução inibidora de rochas (diluição 1:2000)) a cada tubo até que o tecido esteja completamente submerso. Armazenar as amostras a 4 °C até processamento posterior.
      NOTA: Os tipos de tecido devem incluir tecidos tumorais e não tumorais. Os rótulos de amostra normalmente devem incluir o número do registro médico.
    2. Separação de tecidos: Usando uma pinça esterilizada, transfira as amostras de tecido do câncer de próstata para uma placa de cultura de tamanho médio. Lave o tecido 2-3 vezes com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) para remover sangue e detritos. Remova cuidadosamente o tecido adiposo, músculo e outros componentes não epiteliais usando uma pinça de ponta fina, retendo apenas as regiões epiteliais. Em seguida, pique o tecido limpo em pequenos fragmentos de aproximadamente 1-3 mm³ de tamanho com uma tesoura.
      NOTA: A remoção completa de componentes não epiteliais é crítica para aplicações a jusante, pois a contaminação do tecido estromal ou adiposo pode reduzir a eficiência e a especificidade do isolamento celular. Mantenha as condições estéreis durante todo o procedimento para minimizar o risco de contaminação microbiana.
    3. Digestão de tecidos: Transfira os pedaços de tecido preparados para tubos de processamento de tecidos. Adicione a solução de digestão do tecido tumoral (Tabela 2) a cada tubo. Ativar o dispositivo de digestão (aparelho de preparação de suspensão unicelular) utilizando o Programa de Dissociação de Tecidos Médio-Duros para dissociação enzimática-mecânica.
      NOTA: O protocolo de digestão é o seguinte: rotação para frente a 200 rpm por 3 s, rotação reversa a 200 rpm por 3 s, rotação para frente a 300 rpm por 4 s, rotação reversa a 300 rpm por 4 s, rotação para frente a 600 rpm por 5 s, rotação reversa a 600 rpm por 5 s, rotação para frente a 400 rpm por 3 s, rotação reversa a 400 rpm por 3 s. Esta sequência constitui um ciclo, que deve ser repetido três vezes. Depois de completar os dois primeiros ciclos, continue com rotação lenta a 20 rpm por aproximadamente 25 min. A duração pode ser ajustada com base em condições experimentais. Digerir os tecidos a 37 °C durante 40 min a 1 h.
    4. Terminação da digestão: Adicione um volume igual ou duplo de meio adDMEM/F-12 suplementado com FBS à suspensão celular para encerrar a atividade enzimática.
      NOTA: Se o resíduo não digerido permanecer, colete o sobrenadante, adicione enzimas digestivas frescas ao resíduo e continue a digestão a 37 ° C por mais 15-20 min. Monitore o processo periodicamente e combine suspensões celulares de ambas as etapas de digestão.
    5. Filtração: Pré-umedeça um filtro de célula de 100 μm com 1 mL de meio adDMEM/F-12 e, em seguida, filtre a suspensão celular. Enxágue o tubo de processamento de tecido e o filtro de células duas vezes com 5 mL de meio adDMEM / F-12 suplementado com solução inibidora de rocha (diluição 1:2000). Recolha o filtrado num tubo de centrifugação cónico estéril de 50 ml. Passe a suspensão por um filtro de 70 μm e recolha todas as suspensões celulares em um novo tubo de 50 mL.
      NOTA: O número de etapas de filtração e o tamanho dos poros dos filtros podem ser ajustados de acordo com as características da amostra.
    6. Lise dos glóbulos vermelhos: Centrifugue a suspensão celular coletada a 200 × g por 5 min a 25 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incube a suspensão no gelo por 2-3 min.
      NOTA: O tempo de incubação da lise dos glóbulos vermelhos pode ser ajustado com base na eficiência da lise. A incubação prolongada pode levar ao aumento da morte celular. Recomenda-se monitorar a amostra ao microscópio para garantir a lise completa dos glóbulos vermelhos sem danos excessivos a outros tipos de células.
    7. Terminar a lise: Adicionar 6 ml de meio adDMEM/F-12 suplementado com solução inibidora de rocha (diluição 1:2000) à suspensão celular. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min a 25 °C. Descarte o sobrenadante. Lave o pellet celular 1-2 vezes com o mesmo meio suplementado e transfira a suspensão celular final para um tubo Eppendorf de 1,5 mL.
    8. Avaliação da viabilidade: Misture 10 μL da suspensão celular com um volume igual de solução de azul de tripano e observe a viabilidade celular ao microscópio.
      NOTA: Se forem observadas quantidades significativas de células mortas ou detritos, execute uma centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 5 min a 25 °C para removê-los antes de prosseguir com a contagem.
    9. Contagem de células: Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio adDMEM/F-12, dilua a suspensão conforme necessário (normalmente em uma diluição de 1:20) e coloque 6 μL da suspensão diluída em um hemocitômetro para contar as células ao microscópio.
    10. Coleta de pellets celulares: Centrifugar a 200 x g, 25 °C, por 5 min. Colete o pellet celular final em um tubo Eppendorf de 1,5 mL.

3. Estabelecimento de organoides a partir de suspensões de células primárias

  1. Semeadura: Determine o volume necessário de gel de matriz com base na contagem de células. Usando pontas de pipeta pré-resfriadas (armazenadas a -20 °C), transfira cuidadosamente o volume apropriado de gel de matriz para o pellet celular. Misture a mistura célula-gel no gelo suavemente, evitando a formação de bolhas de ar para garantir uma semeadura uniforme e a integridade ideal do gel da matriz.
    NOTA: Descongele o gel da matriz a 4 °C durante a noite antes de usar. Certifique-se de que todas as ferramentas de manuseio, incluindo pontas e tubos de pipeta, sejam pré-resfriadas para evitar gelificação prematura.
  2. Plaqueamento: Dispense a mistura de gel de matriz celular em uma placa de cultura de 24 poços de baixa adesão, aplicando aproximadamente 30 μL por gota. Certifique-se de que cada gota contenha mais de 10.000 células para suportar a formação eficaz de estruturas tridimensionais (3D).
    NOTA: Evite a diluição excessiva do gel da matriz. Para manter a integridade estrutural e apoiar a formação da cultura 3D, o gel da matriz deve constituir mais de 70% do volume total da mistura. Organoides derivados de espécimes de biópsia humana e prostatectomia são equivalentes em natureza, diferindo principalmente no rendimento de células viáveis, e densidades de semeadura idênticas foram aplicadas neste protocolo.
  3. Incubação: Coloque a placa de cultura em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 5 min, permitindo que o gel da matriz solidifique preliminarmente. Inverta a placa e deixe descansar por 20 min para manter o gel da matriz na forma 3D. Adicione 800-1000 μL de meio de cultura (Tabela 3) a cada poço. Substitua o meio de cultura a cada 2-3 dias.
    NOTA: Certifique-se de que o gel da matriz não seja perturbado durante a etapa de inversão para manter a estrutura 3D.

4. Passagem de organoide

  1. Coleta e preparação de organoides: Usando uma ponta de pipeta pré-resfriada, interrompa mecanicamente o gel da matriz para fragmentar os aglomerados de organoides. Enxágue cada poço 1-2 vezes com meio adDMEM / F-12 + solução inibidora de rocha (diluição 1: 2000). Transferir os aglomerados fragmentados juntamente com o meio de cultura para um tubo de centrifugação cónico estéril de 15 ml. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Quando os organoides atingem um diâmetro de 100 μm (normalmente no dia 14 da cultura). Se o volume excessivo do meio interferir na interrupção mecânica, aspire parte do meio antes de quebrar os aglomerados. Para gel de matriz residual que adere à superfície da placa, raspe suavemente usando uma ponta de pipeta e enxágue 2-3 vezes com meio adDMEM/F-12 + solução inibidora de rocha (diluição 1:2000). Todos os enxágues devem ser agrupados com a coleta inicial para obter o máximo rendimento.
  2. Dissociação organoide: Ressuspenda o pellet resultante em 2 mL de solução enzimática recombinante pré-aquecida semelhante à tripsina. Pipetar para cima e para baixo para iniciar a dissociação e, em seguida, incubar a 37 °C durante 15-30 min. Monitore a dissociação ao microscópio a cada 5 minutos até que pequenos aglomerados de células (aproximadamente 5-6 células por aglomerado) dominem o campo e, em seguida, prossiga para a próxima etapa.
    NOTA: O término oportuno da digestão é crucial para evitar a dissociação excessiva e preservar a viabilidade celular. A observação microscópica frequente garante que a digestão seja interrompida no momento ideal para a formação de aglomerados.
  3. Terminar a digestão: Terminar a digestão adicionando um volume igual ou duplo de meio adDMEM/F-12 suplementado com soro fetal bovino (FBS) para extinguir a atividade enzimática. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 25 °C e rejeitar o sobrenadante.
  4. Remoção do gel da matriz: Ressuspenda o pellet em 2 mL de solução de recuperação celular e incube a 4 ° C por 20-40 min para dissolver o gel da matriz residual. Centrifugue a 200 x g por 5 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante e repita a lavagem duas vezes com meio adDMEM / F-12 para eliminar os componentes residuais da matriz. Transfira o pellet final para um tubo Eppendorf estéril de 1,5 mL para processamento posterior.
    NOTA: A incubação em baixa temperatura é fundamental para a despolimerização eficaz do gel da matriz, preservando a integridade da célula. Minimize o tempo fora do ambiente frio para evitar a regelificação prematura.
  5. Semeadura e cultura: Prossiga com a repropagação dos aglomerados organoides dissociados seguindo os procedimentos descritos nas etapas 3.1-3.3. Garanta a densidade celular adequada e a proporção do gel da matriz para uma reforma ideal da estrutura 3D.
    NOTA: Protocolos detalhados para criopreservação, descongelamento, reincorporação e processamento histológico de organoides estão disponíveis mediante solicitação.

5. Criopreservação organoide

  1. Coleta de organoides: Remova a placa de cultura da incubadora e dissocie mecanicamente os agregados de hidrogel organoide usando uma ponta de pipeta pré-resfriada. Transferir os agregados dissociados juntamente com o meio de cultura para um tubo de centrifugação cónico de 15 ml. Enxágue os poços 2-3 vezes com o meio adDMEM/F-12, combinando as lavagens com a suspensão primária. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Para garantir o rendimento máximo, interrompa suavemente os agregados organoides sem causar danos excessivos. Todas as lavagens devem ser combinadas com a coleta primária para reduzir a perda de organoides durante o processo de coleta.
  2. Dissociação enzimática: Adicione 2-4 mL de solução enzimática recombinante pré-aquecida semelhante à tripsina ao pellet organoide em um tubo cônico e misture suavemente a suspensão. Incubar a suspensão a 37 °C durante 15-20 min. Monitore o processo de dissociação microscopicamente a cada 5 min.
    NOTA: Se necessário, pipete suavemente para ajudar a quebrar grupos maiores em agregados menores (aproximadamente 5-6 células por grupo). Tempos de digestão mais curtos são necessários para a criopreservação para evitar a dissociação excessiva e a perda de viabilidade celular. A observação frequente garante que a digestão seja encerrada no estágio apropriado para preservar a integridade do organoide.
  3. Terminação da digestão: Adicione um volume igual ou maior de meio adDMEM/F-12 suplementado com FBS para interromper a atividade enzimática. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Se o pellet estiver livre de gel de matriz residual, prossiga para a etapa 5.5 para criopreservação. Se a contaminação do gel da matriz persistir, prossiga com a etapa 5.4.
  4. Remoção do gel da matriz (opcional): Siga o procedimento descrito na etapa 4.4 para remover o gel da matriz. Ressuspenda o pellet em 2 ml de solução de recuperação celular e incube a 4 °C durante 20-40 min. Centrifugue a 200 × g por 5 min a 4 ° C, descarte o sobrenadante e repita o processo de lavagem 1-2 vezes para garantir a remoção completa do gel da matriz.
    NOTA: A remoção do gel de matriz residual é fundamental para garantir que apenas as células dissociadas sejam criopreservadas. A remoção incompleta do gel pode afetar a viabilidade e a integridade estrutural dos organoides após o descongelamento.
  5. Criopreservação: Ressuspenda o pellet celular em 1,5 mL de meio de congelamento organoide por pipetagem suave para garantir uma suspensão uniforme. Transfira a suspensão para um criovial e armazene-o a -80 °C para preservação a curto prazo. Após 24 h, transfira os frascos para injetáveis para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: Certifique-se de que o meio de criopreservação esteja bem misturado com as células para evitar congelamento desigual, o que pode causar danos às células. Os frascos para injetáveis devem ser transferidos para nitrogênio líquido imediatamente após o período de armazenamento de curto prazo para garantir a preservação a longo prazo e evitar a degradação celular.

6. Recuperação de organoides

  1. Descongelamento de organoides criopreservados: Remova os criogenianos contendo organoides do nitrogênio líquido ou do armazenamento a -80 °C. Mergulhe imediatamente o frasco para injetáveis em banho-maria a 37 °C e agite suavemente até que o conteúdo esteja totalmente descongelado. Assim que o descongelamento estiver completo, transfira a suspensão organoide para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta pré-resfriada (-20 ° C).
    NOTA: O descongelamento rápido e uniforme é fundamental para minimizar os danos celulares induzidos por crio. Use ponteiras de pipeta pré-resfriadas para evitar o aquecimento prematuro e a reforma do gel da matriz durante a transferência.
  2. Remoção do crioprotetor: Adicione cuidadosamente 1-2 mL de meio adDMEM/F-12 ao longo da parede do tubo cônico para diluir o crioprotetor gradualmente. Misture delicadamente por inversão. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Evite pipetagem vigorosa ou vórtice neste estágio, pois mudanças osmóticas repentinas e estresse mecânico podem comprometer a viabilidade do organoide. Uma abordagem de diluição lenta minimiza o choque celular.
  3. Lavagem e ressuspensão: Adicione 1 mL de meio adDMEM/F-12 fresco ao pellet. Ressuspenda as células suavemente usando uma ponta de pipeta pré-resfriada (-20 ° C) para evitar a adesão prematura do gel da matriz. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Manter uma temperatura baixa durante a lavagem é essencial para evitar a remontagem induzida termicamente dos componentes do gel da matriz, o que pode dificultar a reforma organoide subsequente.
  4. Recolha: Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem 2-3 vezes para garantir a remoção completa do crioprotetor residual e dos contaminantes.
  5. Semeadura e cultura: Ressuspender o sedimento celular final em meio de cultura organoide preparado de acordo com as necessidades experimentais. Prossiga com a semeadura seguindo o protocolo descrito nas etapas 3.1-3.3, garantindo a proporção adequada do gel da matriz e a densidade celular para suportar o restabelecimento da estrutura 3D.
    NOTA: A viabilidade e a recuperação das células pós-descongelamento são altamente dependentes do manuseio cuidadoso, da diluição adequada dos crioprotetores e do restabelecimento imediato de um ambiente de gel de matriz 3D de suporte.

7. Processamento de pré-análise para caracterização de organoides

  1. Colheita de organoides: Dissocie mecanicamente os agregados quando os diâmetros dos organoides atingirem 70-100 μm e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL contendo meio para posterior cultura. Enxágue os poços 2-3 vezes com o meio adDMEM/F-12 e combine as lavagens com a suspensão organoide. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Para coletas em pequena escala (por exemplo, 1-2 poços), use um tubo de microcentrífuga de 1.5 mL para garantir um manuseio eficiente e reduzir a perda de amostras. Seja cauteloso para evitar interromper as estruturas organoides durante a dissociação.
  2. Ressuspensão: Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio adDMEM/F-12 e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: Certifique-se de que o pellet seja completamente ressuspenso antes da centrifugação para evitar aglomeração e facilitar o processamento uniforme nas etapas subsequentes.
  3. Lavagem e fixação: Adicione 1 mL de D-PBS ao pellet e misture suavemente por pipetagem ou inversão. Centrifugue a 200 × g durante 5 min a 25 °C, elimine o sobrenadante e repita o passo de lavagem 1-2 vezes. Fixe o pellet com 1-2 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) e incube durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Execute cuidadosamente as etapas de lavagem para garantir a remoção completa do meio residual e outros contaminantes. A fixação em paraformaldeído é crucial para preservar a morfologia organoide para posterior análise.
  4. Lavagem pós-fixação: Centrifugue as amostras a 200 × g durante 5 min a 4 °C e elimine o sobrenadante. Lave as amostras fixas 2-3 vezes com D-PBS, misturando suavemente com movimentos de dedos ou inversão suave para garantir a distribuição adequada do tampão de lavagem e evitar a perda de organoides.
    NOTA: A lavagem pós-fixação adequada é essencial para remover o excesso de paraformaldeído e reduzir a coloração de fundo em aplicações a jusante, como imuno-histoquímica.
  5. Refixação de etanol: ressuspenda o pellet em 1 mL de mistura de etanol a 70% suavemente com o dedo e incube em temperatura ambiente por 20 min. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: A fixação de etanol nesta fase ajuda a preservar a integridade do organoide e a preparar as amostras para incorporação ou processamento posterior. Garantir suspensão uniforme em etanol para evitar fixação irregular.
  6. Depuração do gel da matriz (opcional): Se o gel residual da matriz permanecer no pellet, siga o protocolo descrito na etapa 4.4 para removê-lo. Esta etapa envolve ressuspender o pellet na solução de recuperação celular e incubar a 4 °C por 20-40 min, seguido de centrifugação e várias lavagens para garantir a remoção completa do gel.
    NOTA: A remoção do gel da matriz é particularmente importante para análise histológica ou imagem a jusante, pois o gel residual pode interferir na secção e análise do tecido.
  7. Inclusão de agarose: Prepare cerca de 6 mL de agarose a 2% derretendo a 96 ° C durante a fixação do etanol organoide. Misture 100 μL da agarose derretida com o pellet organoide, garantindo a formação mínima de bolhas de ar. Transfira a mistura para um molde, solidifique a 4 ° C e, em seguida, processe para inclusão de parafina.
    NOTA: Pré-aqueça as pontas da pipeta (com as extremidades aparadas) para evitar entupimentos. A incorporação de agarose facilita a preservação da estrutura organoide, permitindo fácil manuseio e seccionamento. Evite a formação de bolhas durante a mistura para garantir uma incorporação uniforme e um corte ideal do tecido.

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Resultados

Características morfológicas e dinâmicas de crescimento de organoides de câncer de próstata derivados de pacientes
Organoides de câncer de próstata derivados de pacientes foram estabelecidos com sucesso a partir de tecidos tumorais frescos coletados durante procedimentos clínicos. A formação inicial de organoides foi tipicamente observada dentro de 5-7 dias após a cultura (Figura 2). Sob microscopia de campo claro, os organoides exibiram ...

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Discussão

O estabelecimento de PDOs para CaP representa um avanço crítico na modelagem pré-clínica, oferecendo vantagens significativas sobre as culturas de células 2D convencionais e PDXs16. O método apresentado neste estudo permite a geração de organoides que recapitulam fielmente as características histológicas, genéticas e fenotípicas do tumor original. Ao preservar a heterogeneidade do tumor, incluindo a sinalização AR e a arquitetura celular, os organoides fornecem um...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Concessão nº 82172831) e do Projeto-Chave de Pesquisa da Comissão Provincial de Saúde e Planejamento Familiar de Jiangsu (Concessão nº X20240121).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Gabinete de biossegurançaJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Solução de Recuperação CelularCorning354253
CentrífugaShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Tubos centrífugasNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex CaminhoLimpar BMR& D3533-010-02
Cultrex Redução do Fator de Crescimento BME, Tipo 2R& D3533-005-02
Recipientes de cultura (placas de baixa aderência de 24 poços)termodinâmicaNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Balanço eletrônicoNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Soro Fetal BovinoGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
incubadora de cultura celular umidificada (37° C, 5% CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
Caixa de geloNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Pratos culturais de tamanho médioAbsinabs7005
Suplemento de Mídia N21-MAX (50X)R& DAR008
N-AcetilcisteínaSigmaA9165-5G
NicotinamidaR& D3533-010-02
NormocinaInvivogenANT-NR-2
Dispositivo pipeteador com pipetaNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PipetasNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Aparelho de preparação de suspensão de célula únicaRWDDSC-400
Tesoura de tecido/bisturiNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Kit de Dissociação Tumoral, HumanoMiltenyi Biotec130-095-929
PinçaNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Banho-mariaChangzhou Zhongjie Experimental Instrument Manufacturing Co., LtdHH-600
Y-27632 di-hidrocloretoR& D1254/10

Referências

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

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