Detecção de comportamento propenso à agregação em células mutantes de câncer de mama P53 V157F usando fluorescência multiponto de tioflavina T

Resumo

As células de câncer de mama Hs578T que possuem a mutação p53 V157F apresentam fluorescência significativamente maior da Tioflavina T em comparação com as células MCF7, indicando agregação proteica aumentada. Medições de fluorescência multiponto melhoram a precisão e a confiabilidade da detecção na identificação de agregados ricos em folhas β, ressaltando a importância das mutações p53 propensas à agregação na pesquisa do câncer e no desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

Resumo

O supressor tumoral p53, codificado pelo gene TP53 , desempenha um papel central na manutenção da estabilidade genômica. Mutações TP53 , especialmente variantes hotspot, são encontradas em aproximadamente 50% dos cânceres humanos e podem levar à perda de funções supressoras tumorais ou à aquisição de propriedades de ganho de função, incluindo a agregação em estruturas semelhantes a príons.

Neste estudo, avaliamos a tendência de agregação da mutação p53 V157F em células de câncer de mama Hs578T em comparação com células MCF7 que expressam p53 do tipo selvagem. A agregação de proteínas foi avaliada usando coloração com Tioflavina T (ThT), seguida de quantificação de fluorescência em ensaios de placas de 96 poços. As células foram coradas com uma solução de ThT/Hoechst, lavadas e analisadas usando um leitor de microplacas sob parâmetros definidos de excitação/emissão. Análises quantitativas usando leituras de fluorescência de ponto único e de quatro pontos revelaram que as células Hs578T apresentaram um aumento de 3,20 a 4,26 vezes na intensidade da fluorescência ThT em relação ao MCF7, indicando níveis significativamente elevados de agregados ricos em folhas β ou semelhantes a amiloides. Medições multiponto confirmaram a presença ampla e consistente de agregados proteicos em toda a superfície do poço. Esses achados apoiam o uso da leitura de placas multiponto para detectar com precisão a agregação de proteínas em ensaios celulares.

Introdução

O gene TP53, que codifica a proteína supressora tumoral p53, sofre mutação em aproximadamente 50% dos cânceres^{humanos 1,2}. Tais mutações não apenas aboliram as funções supressoras tumorais do p53, mas, em certas variantes de hotspot, também promovem a formação de agregados semelhantes a^{príons 3,4}. Essas formas agregadas de p53 mutante frequentemente adquirem propriedades de ganho de função, incluindo aumento da resistência a terapias anticâncer ^5,6. Portanto, identificar quais mutações dos hotspots p53 são propensas à agregação é fundamental para orientar o desenvolvimento de estratégias de tratamento eficazes em cânceres mutantes^{p53-mutantes 7,8}.

Em nossos estudos anteriores, observamos que mutações específicas de p53 em carcinomas escamosos de cabeça e pescoço (HNSCC) e linhas celulares de câncer de mama exibem fortes sinais de coloração com Tioflavina T (ThT), indicando a presença de proteínas agregadas. ThT é um corante benzotiazol que se liga especificamente a estruturas amiloides ricas em β folhas, produzindo fluorescência aprimorada ao se ligar⁹. Por exemplo, a linha celular Detroit 562 HNSCC, que carrega a mutação p53 R175H, exibiu fortes sinais de fluorescência^{ThT 10}. De forma semelhante, outras duas linhas celulares do HNSCC, TW01 e HONE-1, ambas com a mutação p53 R280T, também apresentaram coloração pronunciada com^{ThT 11}. Nesses casos, os sinais ThT colocalizados com p53, suportando a presença agregada de p53^{, 10,11}.

Em células de câncer de mama, MDA-MB-231 (mutação p53 R280K) e T47D (mutação p53 L194F) também apresentaram forte coloração com ThT com colocalização clara p53/^{ThT 12}. Em contraste, as células MCF7, que expressam o tipo selvagem p53, e as células MDA-MB-468 (mutação p53 R273H) apresentaram apenas sinais fracos de^{ThT 12}. De forma semelhante, células OECM-1 HNSCC com a mutação p53 V173L demonstraram baixos níveis de coloração^{ThT 10}.

Comparado a outros métodos de detecção por agregação de proteínas — como ensaios de filtros com armadilha de filtro, microscopia eletrônica de transmissão (MET) ou imunocoloração com anticorpos específicos para agregados — a análise de fluorescência ThT oferece várias vantagens. É não destrutivo, rápido e aplicável tanto a células vivas quanto fixas, sem processamento extensivo. Embora ensaios de filtro capturem efetivamente agregados insolúveis, eles exigem desnaturação severa e são inadequados para uso com células^{vivas 13}. TEM fornece visualização direta da morfologia das fibrilas, mas é trabalhoso e de baixo^{rendimento 14}. A imunocoloração específica para agregados permite a detecção in situ usando anticorpos dependentes da conformação, embora a disponibilidade e especificidade de anticorpos possam^{limitar 15}. Em contraste, a fluorescência ThT — especialmente quando combinada com leitura de placas multiponto — oferece uma abordagem simples, quantitativa e espacialmente confiável para detectar estruturas ricas em folhas de β ou semelhantes a amiloides.

Considerações práticas também são fundamentais para a reprodutibilidade. A fluorescência do ThT correlaciona-se linearmente com a concentração de amiloide em uma ampla faixa de concentração (0,2-500 μM), e o sinal de pico é tipicamente alcançado entre 20-50 μM, dependendo da proteína — embora a autofluorescência do ThT possa emergir a ≥5 μM, e concentrações mais altas possam impactar a cinética de^{agregação 16}. Portanto, uma concentração de ThT de trabalho em torno de 10-20 μM é geralmente recomendada para equilibrar a sensibilidade e minimizar os possíveis efeitos nos processos^{de agregação 16}. No nosso protocolo, o estoque de ThT 1.000x (12. mM) é diluído 1:1.000 para resultar em uma concentração de trabalho de aproximadamente 12. μM, que está dentro dessa faixa recomendada.

O ThT se liga preferencialmente a estruturas amiloides ricas em β folhas, características das fibrilas amiloides. Essa especificidade surge da interação do corante com a arquitetura cross-β das fibrilas amiloides, onde as superfícies formadas por fibrilas β fornecem locais de ligação para ThT. Consequentemente, o ThT pode não detectar efetivamente outros agregados mal dobrados ou não amiloides que não apresentam essa estrutura rica em folhas^{de β 17}. Portanto, embora o ThT seja uma ferramenta valiosa para identificar fibrilas amiloides, é recomendável empregar métodos complementares de validação — como colocalização com imunofluorescência p53 ou abordagens biofísicas — para verificar a identidade e especificidade dos agregados^{detectados 10,18}.

Estudos de predição estrutural sugerem que a mutação p53 V157F adota uma conformação mais propensa à agregação do que a proteína^{selvagem 19}. Neste estudo, comparamos sinais de fluorescência ThT entre células de câncer de mama Hs578T, que possuem a mutação p53 V157F, propensa à agregação, e células de câncer de mama MCF7 que expressam o tipo selvagem p53. Usando um ensaio de coloração ThT baseado em leitor de placas multiponto, buscamos avaliar a propensão à agregação de p53 V157F em relação ao tipo selvagem p53.

Protocolo

1. Semeadura de células

1. Para avaliar a viabilidade celular, misture 10 μL de Azul de Tripano com 10 μL de células ressuspensas em 1x Soro Tamponado com Fosfato (DPBS) de Dulbecco em um tubo de microcentrífuga e misture cuidadosamente.
2. Carregue 10 μL da mistura em uma lâmina contadora e depois conte as células vivas usando um contador automático de células.
3. Com base na contagem de viabilidade, semeie 30.000 células viáveis por poço em uma placa de cultivo de 96 poços, com um poço designado como controle não corado e os três poços restantes usados para coloração.

2. Incubação

1. Coloque a placa de cultivo em uma incubadora de_CO2 e incube por 12 horas a 37 °C.

3. Preparação de material de coloração ThT fresco (1.000x)

1. Pese 0,02 g (20 mg) de pó de ThT e dissolva-o em 5,0 mL de água deionizada. Misture bem até que o pó esteja completamente dissolvido.
   NOTA: Esta preparação produz uma solução de estoque de ThT 1.000x com concentração final de 4 mg/mL, equivalente a 12,5 mM (ThT tem peso molecular de ~318,85 g/mol. Uma solução de 4 mg/mL equivale a 4 g/L. Dividindo 4 g/L por 318,85 g/mol dá 0,0125 mol/L, ou ~12,5 mM).

4. Preparação do tampão de coloração ThT com contra-coloração nuclear

1. Prepare a solução de coloração adicionando o seguinte a 1 mL de 1x DPBS e misture suavemente para garantir homogeneidade.
   1. Adicione 1 μL de estoque de ThT recém-preparado, 1.000x, obtendo uma concentração final de ThT de 12,5 μM (1x).
   2. Adicione 1 μL de solução Hoechst 33342 com 1 mg/mL, obtendo uma concentração final de ~1 μg/mL (=1,6 μM).

5. Tingimento

1. Remova o meio de cultivo de cada poço. Adicione 100 μL do tampão de coloração ThT/Hoechst preparado em cada poço de tingimento. Adicione 100 μL de 1x DPBS ao controle não corado.

6. Incubação

1. Coloque o prato em um local escuro em temperatura ambiente (25 °C) por 30 minutos.

7. Lavar roupas

1. Aspire cuidadosamente ou descarte a solução de coloração de cada poço, tomando cuidado para não perturbar a monocamada da célula.
2. Adicione 100 μL de 1× DPBS a cada poço e permita uma imersão suave opcional de 30 segundos.
3. Aspire cuidadosamente ou descarte a solução de lavagem DPBS.
4. Repita a lavagem adicionando 100 μL de 1x DPBS fresco a cada poço, permitindo novamente uma imersão suave opcional de 30 segundos, depois descarte a solução de lavagem DPBS.
5. Após a segunda lavagem, adicione 100 μL de 1x DPBS fresco a cada poço.

8. Medição de fluorescência

1. Antes de ler o sinal de fluorescência, remova a tampa da placa de 96 poços. Meça a fluorescência usando um de dois métodos: leitura de ponto único ou leitura de quatro pontos.
2. Coloque a placa de 96 poços em um leitor de microplacas e meça a fluorescência usando as seguintes configurações: Fluorescência ThT: excitação a 450 nm, emissão a 490 nm; Fluorescência de Hoechst 33342: Excitação a 360 nm, emissão a 460 nm; configurações do leitor: tremendo: 5 s antes de ler; Direção de leitura: Leitura principal; Tempo de integração: 140 ms; Altura de leitura: 1,00 mm; Pontos por well: 1 (ponto final) ou 4 (varredura do poço); Configuração de varredura do poço: (Configuração de densidade: 2; espaçamento de pontos: 2,5).

9. Análise de dados

1. Calcule a agregação de proteínas da seguinte forma:
   
2. Normalize a intensidade da fluorescência do ThT definindo a razão em células MCF7 como 1 (controle basal).

Resultados

Para investigar a presença de agregados proteicos ricos em folhas β em células de câncer de mama, linhagens celulares MCF7 e Hs578T foram submetidas à coloração com ThT seguida de quantificação por fluorescência. Como mostrado na Figura 1, as células foram semeadas em quatro poços de uma placa de 96 poços, sendo um poço designado como controle não corado. Os três poços restantes foram corados com ThT conforme o protocolo padrão. A fluorescência foi medida us...

Discussão

Ao semear células em placas de 96 poços, muitas vezes é difícil alcançar uma distribuição uniforme na superfície do poço, pois agitar ou bater suavemente na placa para espalhar as células nem sempre é viável. Essa distribuição desigual pode introduzir variabilidade na intensidade do sinal em todo o poço. A leitura de fluorescência multiponto revelou variação significativa entre diferentes regiões dentro do mesmo poço, destacando esse viés e o potencial de resultados enganosos quando apen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de 96 poços	Simplesmente	PC396-0100
Deslizamento contador	Invitrogen	C10228
Condessa II FL Contador Automático de Células	Thermo Fisher Scientific	AMQAF1000
dPBS	Simplesmente	CC704-0500
Tubo de Eppendorf	Simplesmente	PC101-5000
Hoechst 33342	AAT Bioquest	17530
SpectraMax iD3	Dispositivos Moleculares	735-0391
Tioflavina T	Sigma-Aldrich	T3516
Trippan Blue	Invitrogen	T10282