Um modelo de mouse baseado em esteira para investigar ondas de calor com monitoramento contínuo da temperatura da pele

Resumo

Este estudo estabelece um modelo de camundongo de ondas de calor na menopausa, combinando ovariectomia com termogênese induzida por exercício e monitoramento contínuo da temperatura da pele da cauda de alta resolução.

Resumo

As ondas de calor prejudicam significativamente a qualidade de vida em mulheres na menopausa, mas os mecanismos neurais subjacentes e as terapias eficazes permanecem pouco compreendidos. Um grande desafio neste campo tem sido a falta de modelos animais confiáveis e métodos não invasivos para monitoramento contínuo da temperatura da pele. Aqui, um modelo de camundongo combinando ovariectomia com termogênese induzida por exercício foi desenvolvido para estudar ondas de calor. Usando um registrador telemétrico preso por uma manga de cauda impressa em 3D, a temperatura da pele da cauda foi monitorada continuamente em um estado livre de estresse. Além disso, as câmeras infravermelhas forneceram um método complementar para monitorar a produção e dissipação de calor, permitindo uma avaliação mais abrangente da temperatura corporal. Usando este modelo, camundongos ovariectomizados foram encontrados exibindo maiores aumentos de temperatura da pele e menor temperatura corporal central, imitando efetivamente o fenótipo de ondas de calor observado na menopausa. Essa abordagem estabelece um modelo preciso para o monitoramento de ondas de calor e será valiosa para pesquisadores em termorregulação, neurociência e estudos clínicos da menopausa.

Introdução

As ondas de calor estão entre os sintomas mais prevalentes e perturbadores da menopausa, prejudicando significativamente a qualidade de vida¹. Esses episódios são caracterizados por um aumento repentino na temperatura da pele seguido por uma queda transitória na temperatura corporal central², muitas vezes acompanhada de aumento da frequência cardíaca, ansiedade e tontura³. Apesar de seu profundo impacto, os tratamentos eficazes permanecem limitados⁴, ressaltando a necessidade de uma compreensão mais profunda de seus mecanismos subjacentes.

Um passo crítico no estudo de ondas de calor é o desenvolvimento de modelos animais confiáveis que reproduzam com precisão a disfunção termorreguladora. Atualmente, a abordagem primária envolve a ovariectomia (OVX), que induz alterações na temperatura da pele e do corpo central⁵. No entanto, essas mudanças são muitas vezes inconsistentes, pois podem ser confundidas por estresse ou flutuações de temperatura ambiente⁶. Além disso, a captura de eventos esporádicos do tipo ondas de calor continua sendo um desafio. Métodos alternativos empregam agentes farmacológicos (por exemplo, senktide, capsaicina, tamoxifeno ou naloxona) para desencadear vasodilatação cutânea aguda em roedores ^7,8,9. Embora esses compostos produzam aumentos rápidos e mensuráveis da temperatura da pele, sua administração invasiva e efeitos dependentes da dose complicam a interpretação das respostas termorreguladoras. Além disso, ainda não está claro se a vasodilatação induzida por drogas recapitula totalmente as condições fisiológicas das ondas de calor naturais. Assim, um modelo animal mais refinado e confiável é urgentemente necessário.

O exercício é um modulador bem conhecido da temperatura corporal e tem sido associado à indução de ondas de calor em humanos¹⁰. Alguns estudos aproveitaram o exercício forçado em camundongos para imitar padrões de dissipação de calor semelhantes a ondas de calor 11,12,13. Embora essa abordagem forneça um meio não invasivo de provocar flutuações de temperatura, monitorar a temperatura da pele em camundongos ativos, principalmente por meio de termografia infravermelha, é tecnicamente desafiador. Além disso, uma avaliação abrangente dos sintomas semelhantes a ondas de calor requer o registro contínuo e de longo prazo da temperatura corporal da cauda (pele) e do núcleo.

Para superar essas limitações, um modelo de camundongo otimizado foi desenvolvido combinando ovariectomia com exercícios induzidos em esteira para evocar de forma confiável respostas termorreguladoras semelhantes a ondas de calor. No experimento, camundongos C57BL/6J de 8 a 10 semanas foram alojados em condições padrão (ciclo claro-escuro 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% de umidade). Além disso, um registrador de temperatura telemétrico protegido por uma manga de cauda impressa em 3D foi projetado para permitir o monitoramento contínuo e sem estresse da temperatura da cauda em camundongos em movimento livre. A termografia infravermelha também foi incorporada para fornecer dados complementares sobre a produção e dissipação de calor. Este modelo servirá como uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos das ondas de calor e avaliar possíveis intervenções terapêuticas.

Protocolo

Esses métodos foram projetados para modelos de camundongos. Os estudos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Fudan (2021JS0040). Antes da implementação do protocolo, os animais foram alojados em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Neste estudo, camundongos C57BL/6J fêmeas de 8 a 10 semanas de idade, pesando 20-23 g, foram alojados em condições padrão (ciclo claro-escuro de 12:12 h, 22 °C ± 1 °C, 50% ± 10% de umidade). Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

1. Preparar dez ratinhos fêmeas com 8 a 10 semanas de idade, alojados em condições normais (ciclo claro-escuro 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% de humidade) com alimentos e água ad libitum .
2. Aloque aleatoriamente os camundongos em grupos OVX e simulado (n = 5 / grupo). Casa agrupada para ajudar na sincronização dos ciclos estrais.
3. Configuração do protocolo de esteira
   1. Abra o software de controle da esteira "TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2" no computador conectado (Figura suplementar 1).
   2. Inicialize um novo arquivo experimental selecionando Arquivo > Inicializar um novo arquivo na barra de menus.
   3. Programe o protocolo em execução:
      1. Defina o primeiro segmento: aceleração de 0-20 s de 0-0.17 m/s.
      2. Defina o segundo segmento: velocidade constante de 20-150 s a 0.17 m/s.
      3. Defina o terceiro segmento: aceleração de 150-170 s de 0,17-0,25 m/s.
      4. Definir o segmento final: velocidade constante de 170-600 s a 0,25 m/s^10,12.
         NOTA: Não use estimulação elétrica neste experimento para evitar estresse extra.

2. Monitoramento do ciclo estral

1. Esfregue esfregaços vaginais em uma lâmina de coloração diariamente no mesmo horário todos os dias por 8 dias consecutivos, lavando com 100 μL de PBS estéril usando uma pipeta.
2. Seque as amostras ao ar nas lâminas durante 24 h numa hotte.
3. Mergulhe brevemente as amostras em metanol 100% à temperatura ambiente.
   CUIDADO: O metanol é tóxico por inalação, ingestão ou contato com a pele. Use em uma hotte bem ventilada, use luvas de nitrilo e evite faíscas/chamas.
4. Dilua o corante comercial 20× Giemsa para 1× usando PBS.
5. Manchar as lâminas fixas de metanol com 1× Giemsa no escuro durante 1-2 h.
6. Examine a citologia vaginal para determinar os estágios estrais com base nesses estudos^14,15.
7. Prossiga com os experimentos quando os camundongos estiverem em proestro (Figura 2B).
   NOTA: Manuseie os ratos com cuidado para evitar a interrupção do ciclo induzida pelo estresse. Evite a inserção profunda de ponteiras de pipeta para evitar a pseudo-gravidez.

3. Cirurgia de ovariectomia

1. Registre o peso dos camundongos e anestesie os camundongos com isoflurano. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do animal durante a operação.
2. Raspe os pelos da região dorsolateral bilateralmente antes das patas traseiras e desinfete com etanol a 70% e iodo alternadamente por 3 vezes.
3. Faça uma incisão paravertebral de 1 cm de comprimento na pele e use um instrumento de ponta romba para separar a pele do tecido muscular subjacente. Em seguida, faça a incisão na parede muscular. Exponha as almofadas de gordura ovariana com palitos de algodão.
4. Ligue os vasos sanguíneos ovarianos com suturas. Extirpar ovários com tesoura cirúrgica¹⁶.
5. Feche a incisão em camadas, músculo e pele com suturas não absorvíveis. Limpe a pele ao redor do local da cirurgia suavemente com solução salina para remover qualquer sangue seco ou esfoliante anti-séptico residual.
6. Para controles simulados, corte um pedaço da almofada de gordura sem tocar nos ovários.
7. Monitore a saúde dos camundongos diariamente por 7 dias após a operação.
   NOTA: Certifique-se de que os camundongos sejam mantidos em uma almofada de aquecimento a cerca de 35 ° C durante todo o processo de anestesia.

4. Implantação do registrador de temperatura central

1. Programação e inicialização do registrador (Figura suplementar 2).
   1. Insira o registrador de temperatura verticalmente na estação de acoplamento.
   2. Clique em Gravador > Conectar na barra de menu do software.
   3. Selecione Editar > Nova Medição Seq. Def. na barra de menus.
   4. Escolha Vários intervalos de gravação nas opções do modo de gravação.
   5. Definir parâmetros: Data de início: [AAAA-MM-DD HH:MM], Data de fim: [AAAA-MM-DD HH:MM], Intervalo de gravação: 5 min.
   6. Adicione a configuração de intervalos à sequência.
   7. Clique em Gravador > iniciar nova sequência de medição.
2. Sob anestesia, barbear e higienizar a pele do abdômen.
   NOTA: Este procedimento de implantação de registrador de temperatura abdominal pode ser realizado junto com a cirurgia OVX para evitar várias cirurgias.
3. Faça uma incisão na linha média da pele de 2 cm aproximadamente 1 cm abaixo do diafragma.
4. Estenda a incisão ao longo da linha alba para abrir a cavidade peritoneal.
5. Insira suavemente o registrador de temperatura central na cavidade abdominal ao longo do plano sagital.
   NOTA: O posicionamento adequado é fundamental para leituras precisas da temperatura. Evite o posicionamento superficial perto da pele, pois a temperatura ambiente pode interferir nas medições.
6. Suturar a incisão abdominal com suturas não absorvíveis 5-0.
7. Desinfete o abdômen com solução de iodo.
   NOTA: Monitore o animal de perto durante a recuperação. Mantenha um ambiente quente usando uma almofada de aquecimento até que os ratos estejam totalmente acordados.

5. Acessório do registrador de temperatura montado na cauda

1. Programação e inicialização do registrador (consulte o procedimento da etapa 4.1, modificando o intervalo de gravação para 2 min).
2. Limpe a cauda com um golpe de etanol. Desinfete a manga 3D com etanol a 70% e aperte o registrador de temperatura dentro da manga.
3. Aplique adesivo de cura rápida na manga. Posicione o registrador a 1 cm da base da cauda (Figura 1A). Certifique-se de que a face de detecção do registrador esteja em contato próximo com a pele. Certifique-se de que o registrador esteja fixado no lado ventral da cauda para minimizar a carga de movimento.
4. Segure-o no lugar com pressão por 2 min. Use anestesia breve, se necessário, para uma colocação precisa.
   NOTA: Monitore diariamente o inchaço da cauda ou o descolamento do registrador após a colocação. Um dispositivo conectado corretamente pode permanecer bem por pelo menos 3 dias.

6. Corrida em esteira e coleta de dados

1. Aclimate os ratos à esteira durante a fase de luz por 3 dias usando o protocolo na etapa 1.3.
   1. Coloque os ratos individualmente na esteira estacionária. Reserve 10 minutos para exploração ambiental e habituação.
   2. Execute o protocolo:
      1. Clique no botão Medir . Clique em Iniciar para inicializar a esteira.
      2. Selecione Iniciar perfil para iniciar o protocolo de execução programado.
2. Conecte o registrador de temperatura da cauda 24 h antes dos experimentos para uma boa habituação (consulte a etapa 5).
3. Esteira funcionando na fase leve do dia experimental:
   1. Registre a temperatura basal por 30 s usando uma câmera infravermelha 10 minutos antes do exercício. A temperatura central é registrada simultaneamente usando o registrador de temperatura abdominal implantado.
   2. Execute os mouses na esteira de acordo com o protocolo na etapa 1.3.
      NOTA: Certifique-se de que os mouses funcionem continuamente por 600 s. Se os ratos pararem de correr, incentive suavemente o movimento contínuo usando uma escova de cabelo.
   3. Após a corrida na esteira, transfira os ratos para gaiolas limpas. Meça a temperatura da cauda por meio de termografia infravermelha em 0 min, 5 min, 10 min e 15 min após o exercício.

7. Análise dos dados

1. Para dados infravermelhos e de temperatura do núcleo:
   1. Calcule a linha de base como a temperatura média pré-exercício.
   2. Plote ΔT (temperatura de base pós-exercício) para cada ponto de tempo.
2. Para dados do registrador de temperatura da cauda:
   1. Use a média pré-exercício de 10 minutos como linha de base.
   2. Calcule o ΔT em intervalos de 2 minutos por 15 minutos após o exercício.

Resultados

Desenvolvimento de um sistema de monitoramento termorregulador confiável

Para estabelecer um modelo confiável para medir a temperatura do núcleo e da pele, uma manga de cauda impressa em 3D personalizada foi projetada para prender com segurança um registrador de temperatura a 1 cm da base da cauda (Figura 1A), permitindo a medição contínua e precisa da dissipação de calor durante on...

Discussão

Este estudo estabelece um modelo prático e quantitativo de camundongos para investigar ondas de calor na menopausa, abordando uma lacuna crítica no campo. A integração da ovariectomia com a termogênese induzida por exercícios recapitula com sucesso as principais características das ondas de calor humanas, ou seja, um rápido aumento na temperatura da pele da cauda seguido por um declínio na temperatura corporal central¹⁸. Este modelo combina e estende os pontos for...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Registrador de temperatura implantável para animais	Estrela-Oddi	DST nano-T
Camundongos C57BL/6J	GemPharmatech	N000013
Solução de coloração Giemsa	Beyotime	C0133
Imagens térmicas infravermelhas	VarioCAM	Cabeça VC HD 980
Sistemas de esteira	TSE	Treadmill_6M