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Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

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DOI:

10.3791/68932

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30 de dezembro de 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

Neste artigo

Resumo

Este artigo demonstra a engenharia genômica mediada por CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum, um nematoide entomopatogênico (EPN: parasita inseto) e um modelo genético emergente. A tecnologia descrita é útil para criar mutantes, permitindo a elucidação das funções gênicas na biologia dos nematoides relevantes para simbiose mutualista e parasitária.

Resumo

Nematoides entomopatogênicos (EPNs) dos gêneros Steinernema e Heterorhabditis mantêm interações mutualistas com as bactérias simbióticas Xenorhabdus e Photorhabdus , respectivamente. Juntos, esses pares nematoides-bactérias infectam e matam hospedeiros insetos que são principalmente larvas das ordens de Lepidópteros e Coleópteros, formando um sistema tripartite manejável para dissecar a base molecular do mutualismo e parasitismo. Um passo fundamental para a utilização plena desse modelo é o desenvolvimento de ferramentas genéticas estáveis e transgeracionais nas NEPs. Aqui, demonstramos uma plataforma confiável de edição genômica CRISPR–Cas9 no modelo emergente Steinernema hermaphroditum, uma espécie que é facilmente mantida in vivo e in vitro, e que é altamente receptiva à microinjeção gonadal. Importante, sua reprodução hermafrodita agiliza muito a geração e manutenção de linhagens mutantes homozigotas. Fornecemos um protocolo detalhado para a perturbação gênica eficiente e direcionada usando a entrega baseada em microinjeção de complexos ribonucleoproteicoicos Cas9. Como prova de conceito, modificamos o gene associado ao músculo conservado unc-22, gerando um fenótipo característico de contração que valida a mutagênese direcionada nesse sistema. Essa plataforma CRISPR–Cas9 abre a porta para manipulação genética estável em S. hermaphroditum, como a expressão de transgenes, e fornece uma estrutura que pode ser estendida para outras espécies EPN de importância agrícola e ecológica.

Introdução

Nematoides entomopatogênicos (EPNs) são parasitas matadores de insetos que formam parcerias mutualistas específicas de espécie com seus simbiontesbacterianos 1. As EPNs consistem em duas famílias: Steinermatidae e Heterorhabditidae, que se associam às bactérias Gram-negativas Photorhabdus e Xenorhabdus spp, respectivamente 2,3. Durante o estágio juvenil infeccioso (IJ) de vida livre dos nematoides Steinernema, as bactérias Xenorhabdus ficam alojadas em um bolso intestinal do nematoide conhecido como receptáculo, e ao penetrar o inseto hospedeiro no hemocoel, as bactérias são liberadas, após o que se multiplicam e matam o inseto porsepticemia 3,4. Nessa relação mutualista, as bactérias produzem compostos antimicrobianos e inseticidas, que protegem contra a resposta imune do hospedeiro e fornecem suporte nutricional aonematoide 5. Em troca, as bactérias se beneficiam da proteção proporcionada pelo hospedeiro nematoide contra microrganismos ambientais e são facilitadas em sua dispersão para novas presasinsetas 6,7.

Nas últimas décadas, a parceria Steinernema-Xenorhabdus foi estabelecida como um poderoso sistema experimental para estudar vários aspectos das interações parasitárias e mutualistas, como comportamentos de busca por hospedeirosinsetos 3, colonização bacteriana no hospedeironematoide 8 e comportamentos adaptativos de bactérias simbióticas que facilitam suas transições entre nematoides e animais hospedeirosinseto 9. As NEPs também são espécies importantes para a sustentabilidade do solo e são usadas como agentes orgânicos de controle de pragas para promover a produtividade agrícola10,11.

Apesar do rápido desenvolvimento de ferramentas genéticas nas bactérias simbióticas Xenorhabdus e Photorhabdus12, as ferramentas genéticas consistentes nas NEPs têm sido escassas. A microinjeção gonadal foi estabelecida com sucesso tanto em nematoides de Heterorhabditis quanto de Steinernema 13,14. Anteriormente, a microinjeção gonadal em Heterorhabditis bacteriophora foi usada para fornecer consistentemente RNA de fita dupla para a destruição gênica entre a primeira geração dedescendentes 13,15. Recentemente, a edição genômica CRISPR-Cas9 em Steinernema foi desenvolvida, administrada por microinjeção gonadal, resultando em mutações precisas, estáveis ehereditárias 14.

Uma espécie de Steinernema, S. hermaphroditum, demonstrou ser altamente tratável e tem grande potencial como um organismo modelo genéticoemergente 4,14. Originalmente isolado do solo naIndonésia 16 e reisolado naÍndia 17, S. hermaphroditum é consistentemente hermafrodita, com um pequeno número de machos em cada geração, duas características que facilitam a adaptação de ferramentas genéticas do nematoide modelo clássico C. elegans4. Além disso, o genoma de S. hermafroditum foi sequenciado e montado em cromossomos, simplificando a tarefa de identificar possíveis sítios-alvo Cas9 e projetar osprimers 18.

Durante a microinjeção de EPN, uma mistura de injeção contendo reagentes apropriados, como dsRNAs, proteína Cas9 ou RNAs guia, é entregue ao gônade do nematoide sinciacial por meio de uma agulha puxada de um capilar de quartzo. O volume e a pressão apropriados de injeção resultam em um 'fluxo' visível de líquido por todo o braço gonadal. Como esses nematoides possuem um par de gônadas sinciciais compostas por núcleos germinativos que compartilham o mesmo citosol19, essa abordagem de microinjeção permite que múltiplas células germinativas estejam acessíveis para edição, antes que a citocinese ocorra, separando os núcleos germinativos emoócitos em desenvolvimento 20. Embora a microinjeção gonadal sirva como uma técnica consistente para modulação genética em várias espécies de nematoides não modelos 14,21,22,23,24,25, é crucial adaptar as técnicas de injeção às estruturas gonadais apropriadas, estágio de vida e condição fisiológica de cada espécie de nematoide para garantir sucesso e alta eficiência na administração. Técnicas de recuperação pós-injeção e manutenção das linhas mutantes são importantes para garantir que essa técnica seja econômica.

Este estudo demonstra um protocolo de edição genômica CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum. A microinjeção gonadal é descrita no jovem adulto, um estágio resistente à microinjeção de alta pressão e receptivo à edição genética14. Além disso, métodos detalhados que descrevem a manutenção de linhagens hereditárias e estáveis de mutantes são fornecidos, tanto por criopreservação quanto por propagação por insetos.

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do nematoide antes da microinjeção

  1. Prepare placas de Meio de Crescimento Nematoide (NGM) semeadas com as bactérias Xenorhabdus griffiniae e Comamonas aquaticus.
    NOTA: Cultive nematoides de S. hermaphroditum em sua bactéria simbiótica nativa Xenorhabdus griffiniae antes da microinjeção para maximizar o crescimento dos nematoides e recuperar animais injetados na bactéria Comamonas aquaticus para aumentar a sobrevivência pós-injeção14.
    1. Estirar a bactéria X. griffiniae em placas de ágar de piruvato LB (2,5 g de extrato de levedura, 5 g de triptona, 2,5 g de cloreto de sódio, 0,5 g de piruvato de sódio, 7,5 g de ágar em 500 mL de água) e incubar durante a noite a 30 °C.
    2. Espalhe a bactéria C. aquaticus em placas de ágar LB e incube durante a noite a 37 °C.
    3. Escolha uma única colônia de bactérias para inocular o meio líquido LB escuro (5 g de extrato de levedura, 10 g de triptona, 5 g de cloreto de sódio em 1 L de água). Cultive a cultura bacteriana durante a noite (máximo 16 horas) com aeração (X. griffiniae a 30 °C e C. aquaticus a 37 °C).
    4. Preparar ágar NGM: (3 g de NaCl, 2,5 g de peptona e 20 g de ágar adicionados a 975 mL de água, com 1 mL de colesterol, 1 mL 1 MCaCl 2, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 MKPO 4 adicionados após autoclavagem) 10 mL por placa de Petri de 60 mm x 15 mm.
    5. Bactérias de sementes: Adicione algumas gotas da cultura bacteriana durante a noite em cada placa de ágar NGM, agite suavemente para espalhar as gotículas bacterianas em uma mancha.
    6. Incube placas NGM semeadas por bactérias em temperatura ambiente para permitir que o ágar seque e as bactérias cresçam.
      NOTA: Placas com sementes de X. griffiniae devem ser usadas o mais rápido possível; As placas de C. aquaticus podem ser armazenadas em temperatura ambiente por 1 a 2 semanas.
  2. Estágio do nematoide
    NOTA: Escolha o estágio J3 do hermafrodite na noite anterior à injeção e os jovens adultos no dia da injeção.
    1. Retire ou desfaça nematoides de S. hermafrodium nas placas NGM preparadas com sementes de X. griffiniae. Incube a uma temperatura de 25-28 °C para crescimento ideal.
    2. Na noite anterior à microinjeção, selecione o estágio J3 dos hermafroditas em ágar NGM semeado com X. griffiniae. Como mostrado na Figura 1A, o estágio J3 é estimado pelo tamanho do nematoide e pela morfologia das gônadas e da vulva.
    3. No dia da microinjeção, escolha hermafroditas jovens adultos (Figura 1B).

2. Preparação CRISPR-Cas9 para microinjeção

  1. Seleção dos crRNAs CRISPR e armazenamento de reagentes
    1. Extraia a sequência do gene alvo do genoma de referência Steinernema hermaphroditum usando BlastP, PRJNA982879.
    2. Selecione uma sequência de exons codificante precoce, se possível, de preferência o primeiro exônio, e insira a sequência no CRISPRScan usando as configurações padrão26 para gerar uma lista de possíveis RNAs CRISPR (crRNAs).
    3. Bombardear os crRNAs superiores contra o genoma de S. hermafroditum para garantir que apenas crRNAs únicos sejam escolhidos.
      NOTA: Opcional: Confirme a sequência da região-alvo do genoma por amplificação por PCR e sequenciamento Sanger antes do desenho do crRNA, para garantir a ligação eficiente dos crRNAs.
    4. Armazene os RNAs CRISPR (crRNAs) e os RNAs CRISPR transativadores universais (tracrRNAs) a 100 μM cada em buffer duplex a -80 °C.
    5. Armazene a proteína Cas9 a 10 mg/mL em -20 °C ou -80 °C. Armazene 1 M KCl a 4 °C.
  2. Fabricando a almofada de agarose a 2% para injeção (adaptado de Berkowitz et al.27)
    1. Derrete 2% de agarose em água usando um micro-ondas.
    2. Transfira 50 μL de agarose derretida para um copo de cobertura (48 x 60 mm nº1). Imediatamente cubra a gota de agarose com outro copo de cobertura.
    3. Deixe a agarose secar em temperatura ambiente por 20 minutos. Remova o vidro superior da tampa da tampa do corpo. Rotule a parte frontal da almofada de agarose.
      NOTA: Opcional: Asse a almofada de agarose a 37 °C durante a noite para secar ainda mais a almofada de agarose.
    4. Armazene as almofadas de agarose a 2% em temperatura ambiente por meses a anos.
  3. Preparação da agulha
    1. Fabricar agulhas de quartzo usando os seguintes parâmetros em um puxador de filamento a laser. Com o puxador de agulha usado neste estudo, o programa sugerido é o seguinte: Calor: 700, Filamento: 4, Velocidade: 60, Atraso: 145, Puxada: 175.
    2. Retire as agulhas de quartzo (OD: 1,0 mm, DI: 0,7 mm) imediatamente antes da injeção, ou antes, e guarde-as em uma caixa de armazenamento de pipetas.
      NOTA: Alternativamente, também temos sucesso injetando agulhas de borosilicato (OD: 1,2 mm, DI: 0,68 mm). Note que diferentes tamanhos de agulhas correspondem a diferentes tamanhos de suportes.

3. Microinjeção CRISPR-Cas9 e recuperação dos nematoides após microinjeção

  1. Prepare a mistura de microinjeção CRISPR-Cas9 (adaptada de Wang et al.28)
    1. Prepare novos duplex de RNA-guia misturando os crRNAs escolhidos e o tracrRNA universal em uma proporção 1:1, ou seja, crRNA total para traçrRNA em um tubo PCR:
      crRNA #1 (100 μM) - 1,5 μL
      crRNA #2 (100 μM) - 1,5 μL
      TracrRNA (100 μM) - 3,0 μL
      NOTA: Se for usado co-CRISPR, o crRNA #1 está direcionado ao gene marcador unc-22 , enquanto o crRNA #2 pode ser substituído por outra sequência direcionada a um segundo gene de interesse.
    2. Incube o tubo de PCR em um termociclador a 94 °C por 2 minutos e depois esfrie até a temperatura ambiente.
    3. Monte a mistura de injeção combinando o seguinte, depois incube por 5 minutos em temperatura ambiente:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      Dúplexes de gRNA (a partir do passo 3.1.1) - 2,7 μL
    4. Misture três vezes estalando o tubo de PCR, seguido de uma breve rotação (10-15 s) em uma mini centrífuga para coletar o conteúdo do tubo. Após a mistura final, deixe a rotação por mais tempo, por até 1 minuto.
  2. Carregue e quebre a agulha
    1. Carregue a agulha com 1-2 μL de mistura de injeção usando uma ponta microcarregadora.
    2. Monte a agulha no suporte da pipeta, depois abra a ponta arrastando a agulha por um pedaço de fita dupla face coberto com óleo de halocarbono. Teste a abertura da agulha usando a função CLEAN do microinjetor.
  3. Microinjeção nas gônadas sinciciais de um nematoide jovem adulto
    1. Transfira uma pequena gota de óleo de halocarbono para a almofada de agarose a 2%.
    2. Sob o estereoscópio dissecante, use um fio fino (macio) de platina para pegar um nematoide hermafrodito jovem adulto e lavá-lo em um tampão M9 (por litro: 3 gKH 2PO4, 11,3 gNa 2HPO 4, 5 g de NaCl, com 1 ml 1 M MgSO4 adicionado após autoclav) para remover bactérias (veja nematoide jovem adulto na Figura 1).
    3. Transfira o nematoide lavado para uma almofada de agarose e coloque-o na gota de óleo de halocarbono. Use um fio platinado macio para escovar suavemente o nematoide até que o animal fique imobilizado.
    4. Coloque cuidadosamente a pastilha de agarose no estágio de microinjeção. A orientação do sincito gonadal deve estar apontando para a agulha em um ângulo de cerca de 45°. Comece com ampliação 5x, depois troque para ampliação 20x e 40x para as injeções.
    5. Certifique-se de que a agulha penetre no sincito e, em seguida, use a função CLEAN do microinjetor para introduzir a mistura de injeção a aproximadamente 99 psi até que um fluxo gonadal claro de líquido injetado seja observado para garantir que os reagentes acessem as células germinativas no sincitício gonadal.
    6. Se o segundo braço gonadal estiver acessível, mova o palco para posicionar a agulha e injetar no segundo braço.
  4. Recuperação do nematoide após a injeção
    1. Imediatamente após a injeção, ressuspenda o animal injetado em 1-2 μL de tampão M9 na almofada de agarose.
    2. Usando um fio fino de platina, retire o nematoide injetado da almofada de agarose e lave o óleo usando o tampão M9.
    3. Recupere os nematoides em placas NGM com um gramado de bactérias C. aquatica (preparação da placa NGM: veja passo 1.1), o que aumenta a taxa de sobrevivência dos nematoides apósa injeção 14. Incube a 25 °C durante a noite.
    4. No dia seguinte, isole cada nematoide injetado (P0) em uma placa individual de NGM semeada com X. griffiniae. Deixe os animais P0 produzirem descendentes F1 durante a noite (seja por ovos ou por ensacamento) para fenotipagem e genotipagem (veja passo 4).

4. Triagem para confirmar nocautes mediados por CRISPR-Cas9

  1. Rastreio à base de nicotina (ATENÇÃO) da F1 para fenótipo de espasmos ao usar unc-22 como marcador co-CRISPR
    1. Transfira descendentes F1 de animais injetados com P0 para uma solução de nicotina a 2%.
    2. Escolha um animal individual com espasmos na zona de nicotina e imediatamente o recupere com ágar NGM com sementes de X. griffiniae. Isole cada F1 trêmulo em uma placa individual e deixe que ele produza animais F2 para genotipagem (veja o passo 4.2).
  2. Genotipagem
    1. Escolha oito descendentes F2 ou F3 de cada linha de contração F1 para genotipagem. Esses animais provavelmente incluem tanto heterozigóticos +/mut quanto homozigóticos mut/ mut.
    2. Prepare um tampão de extração de DNA fresco adicionando 20 μL de Proteinase K (10 mg/mL) a 180 μL de tampão de lisão de vermes (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mMMgCl 2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% gelatina).
    3. Adicione nematoides a 10 μL do buffer de extração de DNA em tubos de PCR. Incube a 65 °C por 10 minutos, depois 95 °C por 15 minutos para extrair DNA genômico.
    4. Genótipe os nematoides amplificando por PCR a região alvo do Cas9 seguindo as instruções do fabricante, usando 1-2 μL de lisado do passo 4.2.2. É importante permitir espaço amplo, se possível (pelo menos 300 bp), entre os sítios de corte Cas9 e os sítios de ligação do primer caso ocorram grandes deleções.
      NOTA: A eletroforese em gel de agarose pode ser usada para confirmar a amplificação bem-sucedida antes do sequenciamento.
    5. Limpe o produto PCR seguindo as instruções do fabricante para garantir uma análise precisa de traços de sequenciamento Sanger.
    6. Sequencie os amplicons PCR gerados no passo 4.2.4 usando sequenciamento Sanger e analise os cromatogramas usando o programaICE 29.
    7. Se os alelos mutantes forem confirmados no passo 4.2.6, volte à placa de contração original do F1 e isole pelo menos oito hermafroditas em placas individuais. Permitir que cada nematoide produza descendentes e, em seguida, genótipar a prole para confirmar a homozigomita. Linhagens homozigóticas podem ser mantidas em laboratório, conforme descrito no passo 5.

5. Manutenção da linha CRISPR

NOTA: Existem três métodos principais de manutenção de linha. Esses incluem criopreservação baseada em trehalose-DMSO (etapa 5.1), passagem in vivo por vermes da cera (etapa 5.2) e manutenção in vitro em placas NGM (etapa 5.3).

  1. Criopreservação de trehalose-DMSO de linhas selvagens e mutantes
    NOTA: Usandoum método de criopreservação 4 de trehalose-DMSO, S. hermaphroditum pode ser armazenado de forma estável a longo prazo a -80 °C e recuperado em meio NGM. Nematoides são congelados em frascos criogênicos de 2 mL. O congelamento ideal é alcançado por meio do resfriamento gradual usando um recipiente de espuma de poliestireno.
    1. Cultive S. hermaphroditum em NGM semeada com X. griffiniae (veja passo 1.1) até que a maioria da população seja J1 ou em sacos de hermafroditas.
      NOTA: Evite os estágios juvenis infecciosos (IJ), pois eles não congelam bem usando esse método.
    2. Lave os vermes nematoides das placas de ágar NGM no buffer M9 e colete em tubos cônicos de 15 mL até a marca de 5 mL. Concentre por centrifugação (1372 x g por 1-2:30 min é suficiente).
    3. Remova o sobrenadante e lave uma vez em um tampão de congelamento Trehalose-DMSO em temperatura ambiente de 5 mL por centrifugação, seguindo os parâmetros fornecidos na etapa 5.1.2.
    4. Resuspenda os vermes em um tampão de congelamento Trehalose-DMSO em temperatura ambiente de 5 mL. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos com o tubo de lado. Isso aumenta a taxa de sobrevivência.
    5. Dispense 1 mL por tubo em 4 frascos criogênicos.
    6. Coloque frascos em caixas de espuma de poliestireno no freezer a -80 °C.
    7. Uma semana depois, teste de descongelar um dos frascos.
    8. Transfira o restante dos frascos para caixas de freezer a -80°C e armazene permanentemente.
    9. O teste de descongelamento ou recuperação de S. hermafroditum a partir de estoques congelados
      1. Retire um frasco do freezer e deixe descongelar completamente em temperatura ambiente.
      2. Despeje o conteúdo líquido em um novo prato NGM. Note que a adição de uma bactéria simbiótica não é necessária, pois o estoque congelado geralmente contém bactérias simbióticas suficientes. Os vermes devem começar a se recuperar em minutos a horas.
      3. Observe o movimento e a reprodução do nematoide. Após um ou dois dias, transfira vários nematoides para novas placas NGM semeadas com X. griffiniae.
  2. Manutenção in vivo através da Galleria mellonella
    NOTA: Para crescimento in vivo, propague linhagens mutantes de S. hermafroditum através das larvas de5º estágio de Galleria mellonella (larva de cera). Esse método é especialmente útil para linhas que não são viáveis após a criopreservação. Um protocolo detalhado e semelhante de propagação natural de nematoides entomopatogênicos por insetos e outros meios para crescimento de NEPs pode ser encontrado em (McMullen et al.30). Resumindo:
    1. Permitir que os nematoides passem fome e se tornem IJs nas placas NGM.
    2. Use o buffer M9 para remover IJs das placas NGM.
    3. Transfira IJs para infectar insetos Galleria usando a armadilha branca.
  3. Para a manutenção in vitro em placas NGM, siga os passos:
    1. Placas de NGM de semente com aproximadamente 100 μL de cultura líquida fresca do simbionte S. hermafroditum , X. griffiniae.
    2. Deixe a placa bacteriana secar completamente antes de transferir os nematoides para a placa.
    3. Armazene os pratos a 25 °C e transfira os nematoides para pratos recém-semeados aproximadamente uma vez por mês.

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Resultados

Dois RNAs CRISPR foram projetados (identificados pelo número do sítio Pam - Pam 3 e Pam 5) com o alvo do homólogo S. hermafrodidum do unc-22 nos sítiosPam 14 previamente publicados (Figura 2A). Cada crRNA se complexou com traçrRNA para formar um único RNA-guia (sgRNA) e foi incorporado ao Cas9 para formar a ribonucleoproteína conforme descrito no passo 3.1. Nesse protocolo, dois crRNAs foram projetados para direciona...

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Discussão

Sistemas animais modelo genético não convencionais oferecem oportunidades valiosas para estudar a função dos genes eucarióticos dentro dos contextos ecológicos e fisiológicos em que essas características ocorrem naturalmente, por exemplo, na presença de um hospedeiro parasita ou do microbioma nativo de um organismo. Nos nematoides entomopatogênicos (EPNs), a manipulação genética tem se baseado em alguns casos de abordagens baseadas emRNAi 13,32.<...

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Divulgações

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a Margaret McFall-Ngai e Edward Ruby pelo uso do microscópio confocal. Agradecemos a Alexis (Cody) Hargadon e Grischa Chen pelo treinamento em microscopia confocal, e a Carly R. Myers pela ajuda na obtenção das imagens e análises dos vídeos de espasmos. Também agradecemos a Stephanie Hampton por alocar fundos para a compra do sistema de microinjeção. A Carnegie Institution for Science apoiou esse trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ágar (80-100 de malha)Fisher ScientificBP26411Também usado em placas de piruvato LB
AgaroseFisher Scientific16500500Também usado em genotipagem
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Agulhas de borosilicatoInstrumento de Precisão Mundial1B120F-4
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma AldrichC4901
Colesterol  VWR4335 mg/mL em etanol
Comamonas aquatica (DA1877)
Vidro de cobertura para almofada de agaroseLaboratórios de pesquisa cerebral#4860-1D48 x 60 mm de espessura No1
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich4723010,5 M
DNA Clean e Concentrador-5 Zymo ResearchD4014
Microinjetor FemtoJet 4x com cabeça de empunhadura, suporte de agulha tamanho 4 0Eppendorf/Calibre5253000017
Larvas de 5º instar de Galleria melonellaGrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
Sistema de imagem em gelAzure400AZI400-01
Corante de carga em gelThermo Fisher ScientificB72
Gelatina (2%)Sigma AldrichG1393
GelRedBiotium#41003
Primers de genotipagem: DNA oligo, 25 nmolIDTN/A
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto TriptonaFisher ScientificDF0123-17-3Também usado em placas de piruvato LB escuro e piruvato LB e nbsp;
Extrato de Levedura Gibco BactoFisher ScientificDF0127-17-9Também usado em placas de piruvato LB escuro e piruvato LB e nbsp;
Conjunto de cabeça de empunhadura: suporte de agulha tamanho 1CalibreEPE-5196083008(emparelhado com agulha de borosilicato 1B120F-4)
Óleo de halocarbono 700Sigma AldrichH8898
Picareta worm de fio duro de platina para manutenção diáriaPesquisa TritechPT-9901
Inferência das edições CRISPR (ICE)SynthegoN/ASoftware usado para analisar sequências de Sanger e identificar indels
KClSigma AldrichP9541
Puxador de agulha a laser P-2000SutterP-2000G
Cloreto de magnésio (MgCl2)Sigma AldrichM8266
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma AldrichM7506Para o buffer M9, também usado em NGM
Ponta do microcarregador 2x96STCalibre930001007
Adaptador de Montagem de Micromanipulador para Zeiss Axio Observer e Axiovert 200Pesquisa TritechNZ-19-2
MicroscópioTritechSMT1
NicotinaSigma AldrichN3876
NP-40Thermo Fisher Scientific85124
Buffer Duplex Livre de NucleasesIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
Caixa de armazenamento de pipetasInstrumentos SutterBX10
Cloreto de potássio (KCl)Sigma Aldrich793590
Fosfato de potássio, dibásico (K2HPO4)Sigma AldrichP3786KOH por NGM
Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4)Sigma AldrichP5655Para o buffer M9, também usado em NGM
Proteinase KSigma AldrichP6556
Agulhas de quartzoInstrumentos SutterQF100-70-10
S. hermaphroditium genomaNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
crRNAs SH-UNC-22 Alt-R CRISPR-Cas9IDTN/A
Cloreto de sódio (NaCl)VWRSS0430Também usado em placas de piruvato M9, Dark LB, LB
Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4.7H20)Sigma AldrichS9390Para o buffer M9
Piruvato de sódioSigma AldrichP2256Também usado em placas de piruvato LB & nbsp;
de fio de platina macia para microinjeçãoSurepure Chemetals6824Platina 90%, Fio de Liga de Irídio 10%, 0,002 polegada de diâmetro x 5 pés de comprimento
Suporte de Agulha PadrãoPesquisa TritechHI-7
Steinernema hermaphroditum
Microscópio estereoscópicoLeicaInveta 3
TrehaloseCole-ParmerEW-88195-990,08 M
Tris Fisher ScientificAM9855GpH 8,0
Tween 20Sigma AldrichP1379
Adaptador de Montagem de Micromanipulador VerticalPesquisa TritechNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

Referências

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