Este protocolo avalia o papel protetor da superexpressão do klotho nos cardiomiócitos H9C2 sob hipóxia-reoxigenação usando ensaios moleculares e funcionais.
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Artigo de investigação
Este protocolo avalia o papel protetor da superexpressão do klotho nos cardiomiócitos H9C2 sob hipóxia-reoxigenação usando ensaios moleculares e funcionais.
Este estudo teve como objetivo investigar o papel protetor do klotho em cardiomiócitos submetidos a lesão por hipóxia/reoxigenação (H/R). Um modelo H/ R in vitro foi estabelecido usando cardiomioblastos de rato H9C2, que foram transfectados com vetores lentivirais que superexpressam klotho. As células foram divididas em seis grupos experimentais: controle, H/R, controle negativo (NC), superexpressão de klotho, PDTC (um inibidor de NF-κB) e um grupo combinado tratado com klotho e lipopolissacarídeo (LPS). Os níveis de expressão do klotho foram determinados por PCR quantitativa em tempo real e western bloting. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio MTT, enquanto a apoptose foi avaliada usando citometria de fluxo. A expressão das proteínas envolvidas na via de sinalização NF-κB foi analisada por western bloting, e a expressão celular de citocinas pró-inflamatórias foi avaliada por meio de coloração por imunofluorescência. A superexpressão do klotho elevou significativamente os níveis de klotho nas células H9C2 e levou a melhora na viabilidade celular, redução da apoptose e diminuição da expressão celular de citocinas pró-inflamatórias em comparação com o grupo H/R. A análise do Western blot revelou que a superexpressão do klotho, assim como o tratamento com PDTC, suprimiram a ativação da via NF-κB, como indicado por uma redução da razão p-P65/P65 e aumento dos níveis de p-IκBα/IκBα. Esses efeitos foram parcialmente revertidos após o tratamento conjunto com LPS. Esses resultados sugerem que o klotho confere cardioproteção contra lesões induzidas por H/R ao modular a sinalização do NF-κB, reduzir a inflamação e promover a sobrevivência celular. Esse protocolo fornece um método reprodutível para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à lesão por isquemia-reperfusão do miocárdio e o potencial terapêutico do klotho na inflamação cardíaca.
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é causado principalmente por isquemia seguida de reperfusão, o que motivou extensas pesquisas sobre os mecanismos da lesão da hipóxia/reoxigenação (H/R)do miocárdio 1,2,3. Um aspecto fundamental da lesão H/R do miocárdio é a apoptose celular, que contribui significativamente para a progressão patológica daAMI 4,5.
Estudos recentes implicaram a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) na lesão H/R do miocárdio po....
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Todos os procedimentos envolvendo a linha celular de cardiomioblastas de rato H9C2 (ATCC, CRL-1446) foram realizados em conformidade com as regulamentações institucionais de biossegurança. Nenhum animal ou humano esteve diretamente envolvido neste estudo. A Figura 1 ilustra o fluxo gráfico do pipeline experimental de desenho e análise. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura celular
A linha celular de cardiomioblastas de rato H9C2 (ATCC, CRL-1446) foi criopreservada em nitrogênio líqu....
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A superexpressão do klotho melhora a sobrevivência celular e atenua a lesão inflamatória mediada por NF-κB
Para confirmar a eficiência da entrega de genes, a expressão do Klotho foi quantificada tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína. Células que superexpressam klotho apresentaram um aumento robusto em comparação com os grupos controle hipóxia/reoxigenação (H/R) e negativos (p < 0,05;
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Neste estudo, foi investigado o papel protetor do Klotho em cardiomiócitos expostos à lesão por hipóxia/reoxigenação (H/R), e a superexpressão do Klotho foi encontrada como melhora significativa da viabilidade celular, redução da apoptose e suprimição da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Esses efeitos foram acompanhados por redução da fosforilação de p65 e fosforilação aprimorada de IκBα, sugerindo que a inibição da sinalização NF-κB contribui para o fenótipo protetor. A inibição.......
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldeído | Biosharp | XG1050 | |
| Solução de Coloração Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit de Síntese de cDNA | Qiagen | 205410 | |
| Solução DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit de Reagentes de Detecção ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Fonte de Alimentação por Eletroforese (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Citômetro de Fluxo (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscópio de Fluorescência (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Solvente formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticorpo Anti-Coelho IgG conjugado com HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-κ Agonista da Via B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Leitor de Microplacas (Modelo K3) | Termodinâmica | K3 | |
| Câmara Incubadora Modular (Câmara da Hipóxia) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| Solução MTT | Cayman | 21795 | |
| PDTC (NF-κ Inibidor da Via B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticorpo IgG Anti-Coelho Conjugado com PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polibrena (brometo de hexadimetrina) | Invitrogen | X2351 | |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Rabbit Anti-Rat IL-1 e beta; Anticorpo | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticorpo Anti-Rato do Coelho IL-6 | ZEN BIO | 384702 | |
| Coelho Anti-Rato Iκ Bα Anticorpo | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticorpo Anti-Rato Klotho do Coelho | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticorpo Anti-Rato de Coelho p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Phospho-I&kappa de Coelhos Anti-Rato; Bα Anticorpo | Biorbyt | orb223035 | |
| Phospho-NF-& kappa do Coelho Anti-Rato; Anticorpo B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Rabbit Anti-Rat TNF-& alpha; Anticorpo | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticorpo Anti-Rato & beta-actina do Coelho | Huabio | ET1702 | |
| Sistema de PCR Quantitativo em Tempo Real (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Buffer de Lise RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit de Preparação de Gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit de Reagentes Trizol | Tecnologias de Vida | 15596-018 |
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