Este protocolo avalia o papel protetor da superexpressão do klotho nos cardiomiócitos H9C2 sob hipóxia-reoxigenação usando ensaios moleculares e funcionais.
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Artigo de investigação
Este protocolo avalia o papel protetor da superexpressão do klotho nos cardiomiócitos H9C2 sob hipóxia-reoxigenação usando ensaios moleculares e funcionais.
Este estudo teve como objetivo investigar o papel protetor do klotho em cardiomiócitos submetidos a lesão por hipóxia/reoxigenação (H/R). Um modelo H/ R in vitro foi estabelecido usando cardiomioblastos de rato H9C2, que foram transfectados com vetores lentivirais que superexpressam klotho. As células foram divididas em seis grupos experimentais: controle, H/R, controle negativo (NC), superexpressão de klotho, PDTC (um inibidor de NF-κB) e um grupo combinado tratado com klotho e lipopolissacarídeo (LPS). Os níveis de expressão do klotho foram determinados por PCR quantitativa em tempo real e western bloting. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio MTT, enquanto a apoptose foi avaliada usando citometria de fluxo. A expressão das proteínas envolvidas na via de sinalização NF-κB foi analisada por western bloting, e a expressão celular de citocinas pró-inflamatórias foi avaliada por meio de coloração por imunofluorescência. A superexpressão do klotho elevou significativamente os níveis de klotho nas células H9C2 e levou a melhora na viabilidade celular, redução da apoptose e diminuição da expressão celular de citocinas pró-inflamatórias em comparação com o grupo H/R. A análise do Western blot revelou que a superexpressão do klotho, assim como o tratamento com PDTC, suprimiram a ativação da via NF-κB, como indicado por uma redução da razão p-P65/P65 e aumento dos níveis de p-IκBα/IκBα. Esses efeitos foram parcialmente revertidos após o tratamento conjunto com LPS. Esses resultados sugerem que o klotho confere cardioproteção contra lesões induzidas por H/R ao modular a sinalização do NF-κB, reduzir a inflamação e promover a sobrevivência celular. Esse protocolo fornece um método reprodutível para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à lesão por isquemia-reperfusão do miocárdio e o potencial terapêutico do klotho na inflamação cardíaca.
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é causado principalmente por isquemia seguida de reperfusão, o que motivou extensas pesquisas sobre os mecanismos da lesão da hipóxia/reoxigenação (H/R)do miocárdio 1,2,3. Um aspecto fundamental da lesão H/R do miocárdio é a apoptose celular, que contribui significativamente para a progressão patológica daAMI 4,5.
Estudos recentes implicaram a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) na lesão H/R do miocárdio por meio da modulação das respostas inflamatórias a estímulos como lipopolissacarídeos (LPS)6,7,8. A ativação do NF-κB ocorre por dois mecanismos distintos: as vias canônica e nãocanônica 9. Na via canônica, a ativação depende da degradação induzida pela fosforilação do inibidor do kappa B alfa (IκBα)10. No entanto, também foi relatado que a fosforilação da subunidade NF-κB p65 pode impulsionar a apoptose, potencialmente independentemente da degradação de IκBα11. Klotho, uma proteína transmembranar de passagem única, regula o metabolismo do fosfato e do cálcio e inibe a sinalização dainsulina 12,13,14. Evidências emergentes indicam que o Klotho exerce efeitos inibitórios sobre a ativação do NF-κB em diversos tecidos, incluindo rim, hipocampo e células envelhecidas, mitigando assim inflamação e danostecituais 15,16,17. Apesar desses avanços, o papel do Klotho na AMI e sua potencial interação com a via NF-κB durante a lesão H/R do miocárdio permanecem amplamente inexplorados.
Do ponto de vista metodológico, o modelo H/R in vitro usando cardiomioblastos de rato H9C2 oferece várias vantagens em relação aos modelos animais, incluindo tensão controlada de oxigênio, reprodutibilidade e redução da variabilidade. Além disso, a superexpressão de Klotho mediada por lentiviral permite uma modulação estável e eficiente da expressão gênica, possibilitando a investigação direta de seu impacto funcional. Essas abordagens tornam o protocolo prático, econômico e acessível para estudos mecanicistas, ao mesmo tempo em que evitam os desafios éticos e logísticos da experimentação in vivo .
Em termos práticos, as células H9C2 são amplamente utilizadas em pesquisas cardiovasculares, pois mantêm muitas propriedades semelhantes às dos cardiomiócitos, embora não imitem totalmente o fenótipo dos cardiomiócitos maduros. A condição H/R selecionada (hipóxia de 5 h seguida de reoxigenação de 1 h) se enquadra em uma faixa comumente empregada para modelar lesão de isquemia-reperfusão in vitro. Da mesma forma, a transdução lentiviral com multiplicidades de infecção (MOI) em torno de 100 é uma abordagem padrão para alcançar superexpressão eficiente com citotoxicidade gerenciável. Embora essas características aumentem a aplicabilidade do protocolo, limitações como a recapitulação incompleta do ambiente in vivo devem ser reconhecidas. Portanto, o presente estudo tem como objetivo explorar como o Klotho protege as células do miocárdio contra lesões H/R e estabelecer um protocolo reprodutível para avaliar sua interação com a sinalização do NF-κB.
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Todos os procedimentos envolvendo a linha celular de cardiomioblastas de rato H9C2 (ATCC, CRL-1446) foram realizados em conformidade com as regulamentações institucionais de biossegurança. Nenhum animal ou humano esteve diretamente envolvido neste estudo. A Figura 1 ilustra o fluxo gráfico do pipeline experimental de desenho e análise. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura celular
A linha celular de cardiomioblastas de rato H9C2 (ATCC, CRL-1446) foi criopreservada em nitrogênio líquido usando um meio congelante composto pelo Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta, 4,5 g/L) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO). Para recuperação, frascos congelados foram rapidamente descongelados em banho-maria a 37 °C por 2-3 minutos e imediatamente transferidos para DMEM pré-aquecido. O meio de cultivo foi preparado com 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio e 1 mM de piruvato de sódio. As células foram mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Células H9C2 entre as passagens 6 e 20 foram usadas em todos os experimentos. Passagens iniciais (P20) não foram usadas para evitar deriva fenotípica relacionada à passagem.
2. Superexpressão lentiviral de Klotho em células H9C2
Um vetor lentiviral auto-inativante de terceira geração, codificando o gene Klotho (Kl) de rato de comprimento completo, sob controle do promotor EF1α, foi aplicado para estabelecer uma superexpressão estável nas células H9C2. A estrutura continha um repórter P2A-EGFP para visualização, elemento regulador pós-transcritivo do vírus da hepatite da marmota (WPRE) e elementos do trato polipurina central (cPPT) para estabilidade do transcrito, e uma fita de resistência à puromicina acionada pelo promotor PGK para seleção. Partículas lentivirais foram produzidas em células HEK293T pela co-transfecção do plasmídeo de transferência com plasmídeos psPAX2 (gag/pol/rev) e pMD2.G (VSV-G) na proporção de 4:3:1 usando polietileneimína (PEI; DNA: PEI = 1:3, v/w). Os supernadantes foram colhidos em 48 h e 72 h, clarificados por centrifugação a 3.000 × g por 10 minutos, filtrados por uma membrana PES de 0,45 μm e concentrados por ultracentrifugação a 25.000 × g durante 2 h a 4 °C. Pellets virais foram ressuscitados em PBS contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA), e títulos funcionais (TU/mL) foram determinados por infecção por diluição limitante de células HEK293T com leitura de EGFP em 72 horas. As células H9C2 foram semeadas em placas de 6 poços a 2 × 10 célulasde 5 por poço, resultando em aproximadamente 60% de confluência no momento da transdução. Partículas lentivirais foram adicionadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 em 1 mL de meio de cultura fresca suplementado com polibrene (8 μg/mL) para aumentar a eficiência da infecção. O inóculo foi removido após 12 horas e substituído por 2 mL de meio completo. Às 72 horas após a infecção, a eficiência da transdução foi verificada pela fluorescência do EGFP sob um microscópio de fluorescência. Para o estabelecimento de linhas celulares estáveis, puromicina (2 μg/mL, pré-titulada) foi aplicada por 3 a 5 dias a partir de 48 horas após a infecção, com trocas de meio a cada 48 horas. A superexpressão de Klotho foi confirmada por RT-qPCR e imunobloting. Todos os procedimentos lentivirais foram realizados sob contenção de nível de biossegurança 2 (BSL-2), e todos os resíduos virais foram inativados com 10% de água sanitária por pelo menos 30 minutos antes do descarte.
3. Grupos experimentais
As células H9C2 foram semeadas em placas de 6 poços (área de crescimento 9,6 cm²) a 3 × 10⁵ células por poço, o que resultou em aproximadamente 70%-80% de confluência após 24 horas, a densidade necessária para o processamento de hipóxia/reoxigenação (H/R) e ensaios subsequentes. Após a fixação durante a noite, as células foram distribuídas em seis grupos experimentais: (1) Grupo Controle, que não recebeu tratamento adicional; (2) grupo H/R, que passou por hipóxia/reoxigenação (H/R) em uma câmara modular de hipóxia selada, seguida de exposição a 5 horas de hipóxia (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) e 1 hora de reperfusão (5% CO₂), conforme descritoanteriormente 18; (3) Grupo Controle Negativo (NC), no qual as células foram transfectadas com um vetor vazio 24 horas antes do tratamento H/R; (4) Grupo Klotho, no qual as células foram transfectadas com vetores lentivirais codificando Klotho 24 horas antes do tratamento H/R; (5) Grupo de tratamento com pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), que foi tratado com 200 mg/L inibidor da via NF-κB PDTC por 24 horas antes do tratamentoH/R 19; (6) Grupo Klotho + LPS, no qual as células foram transfectadas com vetores lentivirais codificando Klotho e posteriormente tratadas com lipopolissacarídeo a 1 mg/L por 24 horas antes do tratamento H/R 20.
4. qRT-PCR
As células H9C2 foram semeadas em placas de 6 poços com densidade de 1 × 10⁶ células por poço. Após o tratamento, o RNA total foi isolado usando um protocolo de extração de fenol-clorofórmio. Brevemente, 1 mL de reagente foi adicionado por poço, seguido pela extração de clorofórmio, precipitação de isopropanol e lavagem com etanol a 75%. O pellet de RNA foi secado ao ar e dissolvido em água livre de RNase. A concentração e pureza do RNA foram determinadas espectrofotometricamente. Para a síntese de cDNA, 1 μg de RNA total foi transcrito reversamente usando um kit comercial de transcrição reversa, de acordo com o protocolo do fabricante, incluindo remoção genômica de DNA e priming aleatório de hexâmeros. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada em um sistema de PCR em tempo real com química SYBR Green sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s. As sequências de primers foram projetadas usando Primer-BLAST (NCBI) e sintetizadas por um fornecedor comercial: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGATGAČ-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTATTATT-3′; (2) β-actina (controle interno): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Os níveis de expressão relativa foram calculados usando o método 2^-ΔΔCT, e a especificidade de amplificação foi confirmada por um único pico de curva de fusão.
5. Western blot
Proteínas foram extraídas das células H9C2 usando um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (200 μL por poço de uma placa de 6 poços) suplementado com um coquetel inibidor de protease sobre gelo. As concentrações de proteína foram medidas por ensaio de ácido bicinconínico (BCA), e quantidades iguais de proteína (20-30 μg) foram carregadas por via em um gel SDS-PAGE de 10% para separação eletroforética. As proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 minutos a 4 °C. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% preparado em TBST por 1h em temperatura ambiente, depois incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Klotho (1:500), fosfo-p65 (1:500), p65 (1:500), fosfo-IκBα (1:500), IκBα (1:500) e β-actina (1:1000). Após três lavagens com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) (1:1000) por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando um sistema aprimorado de detecção de quimiluminescência, e as intensidades do sinal foram quantificadas com o software ImageJ usando configurações de limiar idênticas.
6. Ensaio MTT
As células H9C2 foram semeadas em placas de 96 poços com densidade de 2 × 10³ por poço em 100 μL de meio completo e incubadas durante a noite para permitir a aderência. Um volume de 10 μL de solução de MTT (5 mg/mL em PBS) foi adicionado a cada poço e incubado por 4 horas a 37 °C sob condições umidificadas com 5% de CO₂. Após a incubação, o sobrenadante foi cuidadosamente removido e 100 μL de sulfóxido de dimetil (DMSO) foram adicionados para dissolver os cristais de formazan, seguido de incubação por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. A absorvância foi então medida em 490 nm usando um leitor de microplaca. O resultado visual esperado foi o aparecimento de cristais de formazan roxo em células viáveis antes da adição de DMSO, e uma solução roxa homogênea após a dissolução.
7. Citometria de fluxo
As células foram colhidas 24 horas após o tratamento por tripsinização e coletadas por centrifugação a 1.500 × g por 5 minutos a 4 °C. O pellet celular foi ressuspenso em 100 μL de buffer de ligação 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4). Anexina V-APC e iodeto de propidium (PI) foram misturados em proporção 1:2 para preparar uma solução de coloração de 15 μL, que foi adicionada à suspensão celular. A mistura foi incubada por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Após a incubação, 400 μL do mesmo tampão de ligação foram adicionados, e as amostras foram analisadas imediatamente usando um citômetro de fluxo. Um total de 10.000 eventos por amostra foram coletados. Os dados foram analisados usando o software FlowJo. As células foram inicialmente direcionadas com base no espalhamento direto (FSC) e no espalhamento lateral (SSC) para excluir detritos, seguidas pelo gate de quadrantes de Annexin V vs. PI para distinguir células viáveis (Annexin V-/PI-), células apoptóticas iniciais (Annexin V+/PI-) e células apoptóticas/necróticas tardias (Annexin V+/PI+). A coloração V-positiva/PI-negativa da Anexina indicou apoptose precoce, enquanto a coloração duplamente positiva da Anexina V/PI indicou apoptose ou necrose tardia.
8. Imunofluorescência
As células H9C2 foram semeadas em coberturas de vidro estéreis em placas de 6 poços com densidade de 1 × 10⁵ células por poço e submetidas a tratamentos. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos, e bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Os coverslips foram incubados durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) e IL-6 (1:100). Após três lavagens em PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários marcados com ficoeritrina (PE) (1:500) por 1 hora em temperatura ambiente, no escuro. Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI por 5 minutos. Os coverslips eram montados em lâminas de vidro com meio de montagem antidescoloração, e os sinais de fluorescência eram visualizados usando um microscópio de fluorescência. As imagens foram analisadas com o ImageJ (versão 1.54). A fluorescência vermelha indicava expressão de citocinas, enquanto a fluorescência azul marcava núcleos.
9. Análise estatística
Todos os dados foram analisados usando o software SPSS. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (DS) de pelo menos três experimentos independentes. Para comparações de múltiplos grupos, foi aplicada a análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste post hoc de Tukey. Um valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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A superexpressão do klotho melhora a sobrevivência celular e atenua a lesão inflamatória mediada por NF-κB
Para confirmar a eficiência da entrega de genes, a expressão do Klotho foi quantificada tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína. Células que superexpressam klotho apresentaram um aumento robusto em comparação com os grupos controle hipóxia/reoxigenação (H/R) e negativos (p < 0,05;
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Neste estudo, foi investigado o papel protetor do Klotho em cardiomiócitos expostos à lesão por hipóxia/reoxigenação (H/R), e a superexpressão do Klotho foi encontrada como melhora significativa da viabilidade celular, redução da apoptose e suprimição da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Esses efeitos foram acompanhados por redução da fosforilação de p65 e fosforilação aprimorada de IκBα, sugerindo que a inibição da sinalização NF-κB contribui para o fenótipo protetor. A inibição...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldeído | Biosharp | XG1050 | |
| Solução de Coloração Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit de Síntese de cDNA | Qiagen | 205410 | |
| Solução DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit de Reagentes de Detecção ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Fonte de Alimentação por Eletroforese (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Citômetro de Fluxo (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscópio de Fluorescência (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Solvente formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticorpo Anti-Coelho IgG conjugado com HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-κ Agonista da Via B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Leitor de Microplacas (Modelo K3) | Termodinâmica | K3 | |
| Câmara Incubadora Modular (Câmara da Hipóxia) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| Solução MTT | Cayman | 21795 | |
| PDTC (NF-κ Inibidor da Via B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticorpo IgG Anti-Coelho Conjugado com PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polibrena (brometo de hexadimetrina) | Invitrogen | X2351 | |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Rabbit Anti-Rat IL-1 e beta; Anticorpo | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticorpo Anti-Rato do Coelho IL-6 | ZEN BIO | 384702 | |
| Coelho Anti-Rato Iκ Bα Anticorpo | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticorpo Anti-Rato Klotho do Coelho | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticorpo Anti-Rato de Coelho p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Phospho-I&kappa de Coelhos Anti-Rato; Bα Anticorpo | Biorbyt | orb223035 | |
| Phospho-NF-& kappa do Coelho Anti-Rato; Anticorpo B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Rabbit Anti-Rat TNF-& alpha; Anticorpo | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticorpo Anti-Rato & beta-actina do Coelho | Huabio | ET1702 | |
| Sistema de PCR Quantitativo em Tempo Real (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Buffer de Lise RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit de Preparação de Gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit de Reagentes Trizol | Tecnologias de Vida | 15596-018 |
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