Ensaio de efluxo de fosfolipídios específico para lipoproteína de alta densidade

Resumo

Aqui, descrevemos os protocolos para medir a quantidade de fosfolipídio fluorescente especificamente removido das partículas doadoras de lipídios pela lipoproteína de alta densidade (HDL) presente no plasma ou soro humano total. Mostramos que essa métrica de funcionalidade HDL prevê doenças cardiovasculares incidentes.

Resumo

Os níveis plasmáticos de lipoproteína de alta densidade (HDL)-colesterol (HDL-C) são atualmente uma métrica chave para a avaliação clínica do risco de doença cardiovascular (DCV). A remoção mediada por HDL de lipídios da placa das células e depósitos extracelulares na parede arterial é uma das várias funções antiaterogênicas da HDL que podem ser responsáveis por sua associação inversa com o risco de DCV. A remoção mediada por HDL do colesterol celular in vitro provou recentemente ser um preditor ainda melhor do risco de DCV do que o HDL-C.

O HDL é composto por uma população heterogênea de partículas, que desempenham diferentes funções. As partículas de HDL envolvidas na remoção de lipídios da placa aterosclerótica contêm apolipoproteínas trocáveis, principalmente apolipoproteína A-I, que se dissociam da partícula e, em seguida, removem os lipídios da placa. O HDL nascente é formado pela solubilização e remoção de fosfolipídios e colesterol dos domínios da membrana plasmática celular gerados por ABCA1 por apolipoproteínas trocáveis derivadas do HDL. Esse processo desempenha um papel crítico na prevenção e regressão da placa aterosclerótica.

Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de efluxo fosfolipídico específico para HDL (HDL-SPE) livre de células, que mostramos anteriormente pode prever o risco de DCV incidente. Este ensaio mede especificamente a remoção mediada por apolipoproteína HDL de um fosfolipídio fluorescente não trocável de uma partícula doadora de lipídios. Nossos estudos clínicos de caso-controle estabeleceram que o ensaio HDL-SPE tem um desempenho tão bom e potencialmente até melhor do que o ensaio de capacidade de efluxo de colesterol baseado em células "padrão-ouro", um ensaio trabalhoso e tecnicamente complexo que geralmente utiliza colesterol radioativo.

O objetivo deste protocolo é permitir que pesquisadores básicos e clínicos avaliem a funcionalidade do HDL na mobilização lipídica, usando um ensaio simples, padronizado, livre de células e de alto rendimento. Este ensaio pode ser usado por pesquisadores básicos para obter informações sobre os mecanismos subjacentes ao efluxo lipídico mediado por HDL e para rastrear novos agentes terapêuticos que melhoram a funcionalidade do HDL. O HDL-SPE também pode servir como um ensaio de diagnóstico laboratorial clínico para avaliação de risco de DCV.

Introdução

O ensaio de efluxo de fosfolipídios específico de lipoproteína de alta densidade (HDL-SPE) mede a funcionalidade do HDL e destina-se ao uso em pesquisa biomédica e laboratórios de diagnóstico clínico para (i) obter mais informações sobre os mecanismos subjacentes à remoção de lipídios mediada por HDL de lesões ateroscleróticas, (ii) servir como uma nova plataforma para melhorar a avaliação clínica do risco de DCV e (iii) desenvolver novas terapias para tratar doenças cardiovasculares.

O HDL-colesterol (HDL-C) é um importante determinante do risco de DCV¹, mas sua utilidade está comprometida na medida em que níveis elevados de HDL-C (>80 mg/dL) estão associados a maior risco de DCV 2,3,4,5. Níveis elevados de HDL-C podem representar o acúmulo de HDL disfuncional que tem uma capacidade reduzida de remover lipídios da placa arterial⁶.

O ensaio de capacidade de efluxo de colesterol celular (CEC) foi o primeiro ensaio in vitro desenvolvido para medir a funcionalidade do HDL. Neste ensaio, macrófagos cultivados (camundongos ou humanos), normalmente marcados com ^{colesterol 3}H ou fluorescente, são incubados com plasma ou soro depletados de apoB. O efluxo de colesterol % é calculado com base na quantidade de fluorescência/radioatividade associada à célula e ao meio ^7,8,9. O ensaio CEC demonstrou ser um melhor preditor de DCV incidente do que o HDL-C⁷. O ensaio CEC não é passível de conversão em um ensaio de diagnóstico clínico de rotina, principalmente devido aos seus requisitos de cultura de células e longa duração (por exemplo, dias). Além disso, o ensaio CEC é limitado por sua variabilidade inerente (por exemplo, diferentes tipos de células, técnicas de marcação e depleção de PEG de β-lipoproteínas, que altera a composição do HDL¹⁰).

Vários grupos de pesquisa desenvolveram ensaios de efluxo de colesterol HDL livre de células para uso como ferramentas para obter novos insights sobre a função do HDL e para potencial tradução em um ensaio de diagnóstico clínico para melhor avaliar o risco de DCV^11,12. Esses ensaios de efluxo geralmente envolvem várias etapas e usam uma partícula doadora de lipídios marcada com um colesterol fluorescente e, como o ensaio CEC, requerem depleção de β-lipoproteínas ou, alternativamente, a captura de partículas contendo apoA-I usando anticorpos anti-apoA-I, para medir o efluxo plasmático de colesterol HDL. Embora esses ensaios alternativos tenham sido validados para estarem associados em graus variados ao risco de DCV, até o momento, apenas um¹³, que avalia a taxa de câmbio apoA-I, demonstrou predizer o risco de DCV incidente¹⁴. Curiosamente, a cinética da troca de apoA-I no HDL plasmático e fora dele demonstrou estar independentemente associada à CEC¹⁵ e ser acentuadamente reduzida em pacientes com síndrome coronariana aguda¹⁶. Além disso, várias apolipoproteínas permutáveis em HDL demonstraram mediar tanto o colesterol quanto o fosfolipídio de células que expressam ABCA1 in vitro¹⁷.

Desenvolvemos uma abordagem alternativa para avaliar a funcionalidade da HDL¹⁸. O ensaio simples, rápido e confiável descrito aqui requer apenas dois componentes, a saber, plasma humano inteiro (ou animal) ou amostras de soro (frescas ou congeladas) e uma partícula de doador revestida com lipídios fluorescentes. O ensaio mede a capacidade da apoA-I e de outras apolipoproteínas trocáveis associadas ao HDL no plasma/soro total de remover uma fosfatidiletanolamina fluorescente (PE) não trocável e marcada com o grupo principal de uma partícula doadora revestida de lipídios¹⁸ (Figura 1).

As partículas doadoras neste ensaio consistem em cristais de hidrato de silicato de cálcio (CSH) revestidos com colesterol, fosfolipídio fosfatidilcolina (PC) e um PE fluorescente. As apolipoproteínas associadas ao HDL trocáveis, principalmente apoA-I, liberadas das partículas de HDL ligam-se às partículas do doador e, em seguida, dissociam-se delas junto com os lipídios das partículas do doador, incluindo PE fluorescente. Dessa forma, o HDL, mas não as outras lipoproteínas presentes no plasma/soro total, adquire especificamente o PE fluorescente das partículas doadoras ^18,19. O plasma/soro total é incubado com as partículas doadoras de hidrato de silicato de cálcio revestidas com lipídios fluorescentes (LC-CSH) e solução salina a 37 °C, com agitação por 1 h. Como o LC-CSH tem cerca de duas vezes a densidade da água, as partículas doadoras são prontamente separadas do plasma por centrifugação de baixa velocidade.

O % de efluxo de PE medido em estudos clínicos é normalmente normalizado dividindo-se pelo valor da fluorescência de PE adquirida pelo HDL no sobrenadante da mistura de reação de uma amostra clínica pelo valor obtido pelo HDL em um plasma humano de controle de referência. A normalização para um plasma de referência é realizada para corrigir variações na preparação do reagente. Para aplicações de pesquisa, a % de efluxo de PE pode ser determinada calculando a fluorescência do PE sobrenadante dividida pela fluorescência total (fluorescência do PE sobrenadante + fluorescência LC-CSH). Os valores de medição fluorescente sobrenadante são colados em um modelo em arquivos de planilha para calcular o efluxo de %PE (Tabela Suplementar 1 para medições triplicadas e Tabela Suplementar 2 para medições duplicadas). As instruções para realizar esses cálculos na planilha são fornecidas como arquivos suplementares (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4, Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6, Arquivo Suplementar 7 e Arquivo Suplementar 8), e um exemplo de cálculo é fornecido como Tabela Suplementar 3.

Figura 1: Ensaio HDL-SPE. O efluxo de fosfolipídios específico para HDL é analisado em placas de 96 poços. Cristais de hidrato de silicato de cálcio salinos (cinza) revestidos com lipídios (LC-CSH), incluindo fosfatidiletanolamina marcada com lissaminerodamina não trocável (LRh-PE; camadas de membrana vermelha) e até 30 amostras inteiras de plasma/soro (amarelo; em triplicata) são carregadas em placas de 96 poços. Após misturar por 1 h a 37 °C em um termomisturador, as placas são centrifugadas brevemente para granular as partículas doadoras LC-CSH. Alíquotas dos sobrenadantes, contendo HDL especificamente marcado com LRh-PE, são transferidas para uma placa preta contendo detergente (para solubilizar Lh-Rh-PE) e solução salina. A fluorescência PE é então medida com um fluorímetro. Solução salina (controle negativo; NC), para correção de fundo e plasma humano saudável agrupado (Controle Positivo; PC) para normalização da placa, são carregados em vez de plasma/soro de amostra no último conjunto de poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

A coleta de sangue é realizada seguindo as regras da Declaração de Helsinque de 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), revisada em 2013, e deve estar em conformidade com as diretrizes institucionais sobre consentimento informado.

1. Preparação de partículas lipídicas de doadores marcadas com fosfolipídios fluorescentes

1. Formação de filme lipídico
   CUIDADO: Prepare e dispense soluções de estoque em uma capa química. Use jaleco, luvas e óculos de proteção. Descarte as soluções de clorofórmio em resíduos químicos orgânicos, soluções Triton X-100 (sem plasma) em resíduos químicos e soluções contendo plasma em resíduos de risco biológico/médicos.
   1. Compre soluções de estoque de lipídios em clorofórmio de um fornecedor ou faça-as no laboratório:
      25 mg/ml: 1,2-Dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC):
      10 mg/mL: Colesterol
      1 mg/ml: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissaminerodamina B sulfonil) [LRh-PE]
      NOTA: Use tubos de vidro herméticos com tampa de rosca. Tampa de vedação com fita de Teflon.
      Armazene a -20 ^oC.
   2. Determine a quantidade de LC-CSH que será necessária e prepare o número apropriado de tubos de vidro.
      Em uma capela de exaustão química, adicione o seguinte a cada tubo de vidro borossilicato de 10 mm e 150 mm: 472 μL de solução-mãe de DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μL de solução-mãe de colesterol (8,8 μmol, 3,39 mg) e 305 μL de LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Vórtice brevemente para misturar.
   3. Em uma capela de exaustão química, seque a mistura lipídica em um tubo de vidro sob um fluxo suave de N₂ por 1 h, para formar uma película lipídica seca no fundo do tubo.
      NOTA: O fluxo de N₂ deve causar apenas uma ligeira ondulação na superfície do fluido.
   4. Para ensaios que requerem várias placas de 96 poços ao longo de dias ou semanas, faça um grande lote de LC-CSH que pode ser aliquotado em tubos ou usado para fazer placas LC-CSH prontas para uso, que são armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Consulte as etapas 2.2.1 a 2.2.2 abaixo.
2. Revestimento de hidrato de silicato de cálcio com filme lipídico fluorescente
   CUIDADO: Use jaleco, luvas, máscara facial e óculos de proteção ao manusear o hidrato de silicato de cálcio.
   1. Insira um cone de papel de pesagem no tubo de vidro contendo os lipídios secos. Adicione 80 mg de pó de hidrato de silicato de cálcio (CSH) (reagente de remoção de lipídios) ao tubo de vidro usando o cone de papel de pesagem para direcionar o pó para a base do tubo. Adicione imediatamente 2 mL de solução salina normal ao tubo de vidro contendo os lipídios secos e o CSH. Cubra a parte superior do tubo com parafilme.
   2. Vórtice manualmente para desalojar a maior parte do lipídio do fundo do tubo de vidro. Insira o tubo de vidro em um orifício feito em uma plataforma de isopor presa ao topo de um vórtice. Prenda o tubo à plataforma do vórtice usando fita reforçada.
      NOTA: Pré-ajuste a velocidade do vórtice para permitir que a mistura suba cerca de metade do tubo de vidro.
   3. Vórtice por 10 min. Após o vórtice, confirme se nenhum lipídio permanece na parede do tubo. Se necessário, vórtice manualmente conforme necessário até que não haja mais lipídio. Transferir o volume total do tubo de vidro para um tubo de plástico cónico de 15 ml, utilizando uma pipeta de 1 ml. Lave as paredes do tubo de vidro com 3 mL de solução salina adicional e transfira para o mesmo tubo de plástico cônico de 15 mL.
3. Lavagem LC-CSH
   1. Centrifugue o tubo de plástico de 15 ml contendo o CSH REVESTIDO DE LÍPIDOS (LC-CSH) durante 2 min a 935 × g a 4 °C para peletar as partículas doadoras. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração a vácuo usando uma ponta de pipeta longa e muito fina.
   2. Comece na parte superior do sobrenadante e, enquanto desliza lentamente a ponta da pipeta ao longo da lateral do tubo, incline o tubo à medida que o sobrenadante está sendo removido. Deixe uma pequena quantidade (≈ 200 μL) de solução salina para evitar a aspiração acidental do LC-CSH do pellet. Adicione solução salina suficiente para elevar o volume total para 5 mL.
   3. Repita as etapas 1.3.1-1.3.2 quatro vezes. Após a lavagem final, adicione solução salina suficiente para trazer o volume final para 2,5 mL.
      NOTA: Armazene as preparações LC-CSH a 4 ° C por 2 semanas ou a -20 ° C ou -80 ° C por até 6 meses.
4. Preparação de grandes lotes para placas LC-CSH prontas para uso
   NOTA: Essa abordagem permite a preparação de placas de medição com composição uniforme de reagentes do mesmo lote LC-CSH, minimizando assim a variabilidade de medição entre placas.
   1. Prepare 12 tubos LC-CSH (2.5 mL x 12 tubos) conforme descrito nas etapas 1.1.1-1.3.2 acima. Combine todo o conteúdo de todos os 12 tubos em um tubo de plástico cônico de 50 mL (volume total de 30 mL). Cuidadosamente vórtice para obter uma distribuição homogênea de partículas LC-CSH e dispense 6 mL em um tubo cônico de plástico de 15 mL. Repita quatro vezes para obter um total de 5 tubos cônicos de plástico, cada um contendo 6 mL de LC-CSH.
   2. Cada tubo fornecerá LC-CSH suficiente para fazer 5 placas LC-CSH prontas para uso (contendo 50 μL por poço para todos os 96 poços em uma única placa). Consulte as etapas 2.2.1 a 2.2.2 abaixo.

2. Incubação de amostras de plasma/soro com partículas lipídicas de doadores marcadas com fosfolipídios fluorescentes (LC-CSH)

1. Placas individuais para uso imediato.
   1. Pipete 75 μL de solução salina em cada poço de uma placa de 0,3 mL de 96 poços usando quantos poços forem necessários para o conjunto de amostras a ser analisado. Pipete 100 μL de solução salina em poços de controle negativo (NC) triplicados e 75 μL de solução salina em poços de controle positivo (PC) duplicados (Figura 2). Use uma pipeta de vários poços para dispensar.
   2. Antes de dispensar LC-CSH, vortex o tubo de estoque de plástico de 15 mL 3 vezes, 10 s cada. Usando uma pipeta de poço único, dispense 50 μL de LC-CSH ao longo do lado direito dos poços contendo solução salina. Dispense rapidamente 50 μL cada para apenas 3 poços. Repita o protocolo de vórtice antes de dispensar LC-CSH nos próximos 3 poços.
      NOTA: Este procedimento é fundamental para garantir que o LC-CSH pesado, que sedimenta espontaneamente, seja suspenso de forma homogênea, permitindo assim que quantidades iguais sejam dispensadas a cada poço.
   3. Gire a placa de 96 poços em 180° para que o lado esquerdo dos poços fique agora para a direita. Pipetar 25 μL de amostras de plasma/soro ao longo do lado direito do poço (Figura 2). Para os alvéolos PC, adicionar 25 μL de plasma/soro normolipidêmico humano padrão de referência. O volume total por poço para o ensaio é de 150 μL.
      NOTA: Este procedimento evita a contaminação cruzada do plasma/soro com LC-CSH, uma vez que são dispensados ao longo de lados opostos dos poços.
   4. Feche bem a placa com filme adesivo. Incubar a placa selada de 96 poços no escuro durante 1 h a 37 °C a 1200 rpm num termomisturador. Após a conclusão da incubação, remova a placa do termomisturador e coloque-a no gelo. Centrifugue a placa durante 2 min a 4 °C (para interromper a reacção de transferência) a 935 g para granular as partículas doadoras.
2. Placas LC-CSH prontas para uso
   1. Para uso, descongele as placas prontas para uso congeladas (consulte as etapas 1.4.1-1.4.2 para a preparação da placa) no frio (4 °C a 10 °C) por 2 h (ou durante a noite, se necessário). Centrifugue durante 2 min a 4 °C a 935 × g para recolher todo o material (125 μL) em conjunto. Remova cuidadosamente o filme adesivo para não respingar o conteúdo dos poços.
   2. Dispense 25 μL de plasma / soro samples, solução salina e plasma humano de referência, em triplicata, para os poços apropriados (Figura 1) da placa pronta para uso, no gelo, e sele com filme adesivo. Incubar os 96 poços selados no escuro durante 1 h a 37 °C a 1200 rpm num termomisturador. Retire a placa do termomixer e coloque-a no gelo. Centrifugar a placa durante 2 min a 4 °C (para interromper a reacção de transferência) a 935 × g (para granular as partículas doadoras).

Figura 2: Dispensação de reagentes em poços sem contaminação cruzada. Dispense plasma/soro e LC-CSH nas paredes opostas dos poços. A contaminação cruzada é minimizada se a placa for girada em 180° após a primeira distribuição de LC-CSH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Medição do efluxo de fosfolipídios fluorescentes para HDL plasmático / sérico

1. Transferência para uma placa preta e medição de fluorescência
   1. Remova cuidadosamente a película adesiva para não perturbar o pellet LC-CSH.
      NOTA: Se ocorrer interrupção do pellet, centrifugue novamente.
   2. Transfira 50 μL de sobrenadante da placa de reação de 96 poços para os poços de uma placa de fundo plano de poliestireno preto de 96 poços para medições de fluorescência. Use uma pipeta de vários poços.
      NOTA: Não aspire nenhum LC-CSH. Se isso acontecer, injete de volta no poço e centrifugue novamente.
   3. Encha um reservatório com solução salina normal. Adicione 50 μL de solução salina a cada poço usando uma pipeta de vários poços.
   4. Prepare 1% de TX-100 adicionando 90 mL de água destilada a 10 mL de solução estoque Triton X-100 a 10% em um frasco plástico Erlenmeyer de 125 mL. Encha um reservatório com 1% de Triton-X 100.
   5. Adicione 100 μL de Triton X-100 a 1% em temperatura ambiente a cada poço e misture pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes usando uma pipeta de vários poços. Evite formar bolhas. Estoure todas as bolhas com ar de uma pipeta de transferência de 3 mL.
   6. Meça a fluorescência da lissaminerodamina com fluorímetro (excitação de 540 nm/emissão de 600 nm).
2. Cálculo do efluxo de %PE
   1. Cálculo do efluxo de PE
      1. %Efluxo de PE = ([Plasma Sobrenadante Total ou FLU Sérica - FLU NC Sobrenadante]/FLU Total)) × 100
         FLU = unidades de fluorescência; NC = controle negativo. Uma vez que apenas 50 μl dos 150 μl da mistura de reacção sobrenadante são utilizados para medir a fluorescência por alvéolo, é necessário corrigir do seguinte modo:
      2. FLU sobrenadante total/poço = FLU medida de 50 μL (placa preta) × 3
      3. FLU total por mistura de reação de 150 μL/poço = FLU total emitido por 50 μL de LC-CSH.
         NOTA: A fluorescência LC-CSH é calculada conforme descrito abaixo (etapa 4.2.5).
   2. Cálculo de efluxo de %PE normalizado
      1. Use o efluxo %PE normalizado para corrigir a variação entre os ensaios realizados em diferentes condições (ou seja, experimento realizado em dias diferentes, diferenças de lote).
      2. Use esta fórmula para calcular o efluxo de %PE normalizado:
         Efluxo de %PE normalizado = Valor de efluxo de %PE sobrenadante de amostra (FLU)/Valor de FLU de efluxo de %PE sobrenadante de controle de referência positivo.
      3. Utilizar plasma humano combinado idêntico de dadores saudáveis com um perfil lipídico normal como controlo de referência. Não há necessidade de calcular o sobrenadante total FLU/poço, pois esse valor é o mesmo para a amostra e a referência.
      4. Para amostras triplicadas, cole os dados brutos obtidos na etapa 3.1.6 na planilha (Tabela Suplementar 1). Para amostras duplicadas, cole os dados brutos obtidos na etapa 3.1.6 na planilha (Tabela Suplementar 2).

4. Curva padrão LC-CSH

NOTA: A curva padrão LC-CSH é usada para calcular a quantidade de sinal fluorescente PE presente na alíquota de LC-CSH por poço. Normalmente, 50 μL de LC-CSH/poço são usados. Este valor pode ser usado para calcular o efluxo de %PE para HDL em uma amostra normalizada para o FLU total (consulte a etapa 3.2.1) presente na mistura de reação.

%Efluxo de PE = ((unidades de fluorescência de amostra sobrenadante [FLU] - FLU salina sobrenadante)/(GRIPE LC-CSH total)) x 100.

1. Diluição em série de LC-CSH
   1. Preparar diluições de 10 e 100 vezes de LC-CSH de reserva (conforme preparado nos passos 1.1.1-1.3.3):
      Diluição de 10 vezes: 100 μL de LC-CSH + 900 μL de Triton X-100 a 1%
      Diluição de 100 vezes: 100 μL de LC-CSH diluído em 10 vezes + 900 μL de Triton X-100 a 1%
   2. Dispense amostras triplicadas de LC-CSH diluído em 10 e 100 vezes em uma placa de incubação de 96 poços para a curva padrão (consulte a Figura 3).
   3. Adicione volume suficiente de 1% de Triton X-100 aos poços contendo LC-CSH para levar a um volume final de 200 μL (ver Tabela 1).
2. Solubilização de LC-CSH para medição de fluorescência
   1. Selar a placa com película adesiva e incubar durante 1 h a 24 °C com agitação a 1200 rpm. Centrifugar a placa durante 2 min a 4 °C a 935 × g. Remova cuidadosamente o filme adesivo.
   2. Usando uma pipeta de vários poços, misture as amostras pipetando para cima e para baixo 2-3x. Transfira 100 μL de LC-CSH por poço para uma placa de fundo plano de poliestireno preto de 96 poços para medições de fluorescência, usando uma pipeta de vários poços.
   3. Adicione 100 μL por alvéolo de Triton-X a 1% à temperatura ambiente a cada poço, usando uma pipeta de vários poços. Misture pipetando para cima e para baixo 2-3x.
   4. Meça a fluorescência com um fluorímetro (excitação de 540 nm/emissão de 600 nm).
   5. Cole os valores de fluorescência medidos usando o fluorímetro no modelo de Análise de Regressão Linear na Tabela Suplementar 1 , conforme delineado no Arquivo Suplementar 3. As concentrações finais de LC-CSH na placa de medição da curva padrão são mostradas na Tabela 2.

Figura 3: Placa para curva padrão LC-CSH. O LX-CSH marcado com LRh-PE diluído em série é dispensado em uma placa de 96 poços, conforme mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Concentração Final	10 vezes diluído	100 vezes diluído	1% Tritão X-100	Total
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Detergente	Volume
(μL/poço)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabela 1: Volumes de reagentes adicionados aos poços da placa de incubação para a curva padrão LC-CSH.

Solubilizado	Salino	Total	Adicionado	Medido
LC-CSH	Volume	Volume	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/poço)	(μL/poço)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabela 2: Volumes de reagentes adicionados aos poços da placa de medição para a curva padrão LC-CSH.

Resultados

Métodos analíticos

Conforme observado acima, as análises de amostras HDL-SPE podem ser modificadas para diferentes aplicações, conforme demonstrado abaixo. Antes de realizar estudos com amostras de pesquisa, os ensaios de validação da curva padrão LC-CSH, reprodutibilidade e concentração plasmática são realizados primeiro para dominar as técnicas necessárias. Primeiro, execute a análise da curva padrão LC-CSH para avaliar a qualidade das prepa...

Discussão

O HDL-C é um determinante chave usado para avaliar clinicamente o risco de doença cardiovascular (DCV) e, portanto, a necessidade de hipolipemiantes ou outros tratamentos preventivos potenciais¹. A função do HDL no efluxo de colesterol celular in vitro demonstrou ser um preditor ainda melhor de doença cardiovascular incidente do que o HDL-C⁷. Infelizmente, este ensaio celular não é passível de conversão em um ensaio de laboratório ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Research	850345	Solution de clorofórmio 14:0 PC (DMPC)
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) (sal de amônio)	Avanti Research	810150-C	Solução de Clorofórmio LRh-PE
Filme adesivo	Biossistemas Aplicados	4306311	MicroAmp Transparente Filme Adesivo
Fita de Teflon de Alta Densidade Bay Corporation 1/2 polegada x 520	Soluções de Testes Médicos	86732
Tubos de vidro borosilicato de 20 mm e agudos; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Centrífuga	Termo Científica	Série Sorvall X Pro
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	366927	adequado para HPLC, ≥ 99.8%
Pó de Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Hidroxi-5-colesteno, 5-Colesteno-3β-ol
Papel de pesagem de vidreina	Cole-Palmer	UX-01338-02	Para manuseio do LC-CSH
Placa de incubação	USA Scientific & nbsp;	1402-9700	TempPlate 96 Poços Semi Saia 0,2mL PCR Placas
Agente Remotório de Lípidos (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Placa de medição	Greiner bio-one	655076	Microplaca, PS, 96 poços, F-BOTTOM (POÇO DA CHAMINÉ), PRETA; FLUOTRAC, ENCADERNAÇÃO MÉDICA
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Versão 2507
Pontas de Pipeta MultiFlex	Fisher Scientific	50-550-206	Para aspiração de sobrenadante durante lavagens LC-CSH
Leitor de placas multirótulo	Perkin Elmer	1420-050	Contador Multirótulo Victor3 Wallac1420
Soro fisiológico normal	Biológico de Qualidade	114-055-101	Para múltiplos usos
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Para cobrir o tampo do tubo de vidro durante o vórtice
Frascos Erlenmeyer policabonados	Fisher Scientific	10-041-8	Para solução de 10% do Triton-X
Plasma humano acumulado (derivado do sangue) Li Heparina)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Plasma de referência, controle positivo (PC) e nbsp;
Surfact-Amps x 100	Termo Científica	28314	10% Triton X-100, diluído 10x com água destilada
Termomisturador	Eppendorf	5382000023	Termomisturador C com termobloco de 96 poços
Smartblock termomisturador	Eppendorf	5306000006	SmartBlock de 96 poços
Pipetas de transferência (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Para remover bolhas do topo do poço
Misturador de vórtice	Daigger	3030A	Suporte de afixo para tubo de vidro no topo