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Artigo de método

Identificando biomarcadores moleculares relacionados ao sistema imunológico no transtorno do espectro do autismo usando proteômica de aquisição independente de dados e aprendizado de máquina

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DOI:

10.3791/68949

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26 de setembro de 2025

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1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo usando espectrometria de massa de aquisição independente de dados e aprendizado de máquina que identificou oito proteínas relacionadas ao sistema imunológico como biomarcadores precisos para o diagnóstico precoce do transtorno do espectro do autismo, validado por um ensaio imunoenzimático.

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para identificar biomarcadores de proteínas séricas associados ao transtorno do espectro do autismo (TEA) usando espectrometria de massa de aquisição independente de dados (DIA) combinada com aprendizado de máquina (ML). O DIA permite um perfil imparcial e de alta resolução do proteoma sérico, incluindo proteínas de baixa abundância, garantindo a reprodutibilidade entre as amostras. Abordagens de ML foram aplicadas para selecionar painéis de proteínas diagnósticas e melhorar a robustez do modelo. A análise incluiu soro de 99 crianças com TEA e 70 controles pareados por idade. Proteínas de alta abundância foram esgotadas, peptídeos foram preparados usando procedimentos padronizados de digestão e fracionamento e DIA foi realizado em um espectrômetro de massa de alta resolução. O processamento e quantificação dos dados identificaram proteínas diferencialmente expressas, que foram submetidas à análise de enriquecimento funcional. Oito proteínas relacionadas ao sistema imunológico emergiram como fortes candidatas ao desenvolvimento de biomarcadores. Um modelo de regressão logística treinado nessas proteínas alcançou 95,27% de precisão, um valor Kappa de 0,9025 e uma AUC de 1,000 na validação cruzada. Essas descobertas demonstram o potencial da proteômica baseada em DIA, combinada com o aprendizado de máquina, como uma estrutura robusta para a descoberta de biomarcadores em TEA e para adaptação em pesquisas clínicas mais amplas.

Introdução

O transtorno do espectro autista (TEA) é um grupo de distúrbios do neurodesenvolvimento de início precoce caracterizados pela heterogeneidade na etiologia e apresentação clínica. As principais características incluem déficits persistentes na comunicação e interação social, bem como comportamentos, interesses ou atividades restritos e repetitivos. Nos Estados Unidos, a prevalência é de aproximadamente 2,3% entre crianças de 8 anos e cerca de 2,2% entre adultos, ressaltando seu impacto na saúde pública 1,2,3,4. Os fatores de risco são diversos, incluindo predisposições genéticas, desregulação imunológica e exposições ambientais pré-natais 5,6,7. O diagnóstico e a intervenção precoces podem melhorar significativamente os resultados do desenvolvimento, tornando a identificação de biomarcadores objetivos e confiáveis um dos principais focos da pesquisa sobre TEA 8,9,10. Este protocolo baseia-se em nosso trabalho publicado anteriormente aplicando proteômica de aquisição independente de dados (DIA) e aprendizado de máquina para identificar proteínas relacionadas ao sistema imunológico como potenciais biomarcadores para o diagnóstico precoce de TEA11.

Apesar dos extensos esforços, não existem atualmente biomarcadores específicos e universalmente validados para o diagnóstico clínico de TEA12. Os candidatos propostos - como alterações no microbioma intestinal13, interleucina-6 elevada (IL-6) 14, alterações no fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) 15 e marcadores de estresse oxidativo como a glutationa16 - permanecem preliminares e carecem de reprodutibilidade para uso clínico. A proteômica surgiu como uma abordagem promissora para identificar assinaturas moleculares específicas de doenças, e vários estudos investigaram diferentes amostras biológicas (sangue, saliva, urina, PBMCs) para proteínas diferencialmente expressas 8,17,18,19,20,21,22 . Por exemplo, Bao et al. demonstraram que proteínas inflamatórias identificadas pela proteômica Olink podem ajudar no diagnóstico precoce de TEA (17), enquanto outros estudos sugerem que vias proteômicas e metabólicas compartilhadas podem produzir biomarcadores robustos, apesar da heterogeneidade genética do TEA23.

A espectrometria de massa DIA tem ganhado cada vez mais atenção por seu perfil proteico abrangente e reprodutível. Ao contrário da aquisição dependente de dados (DDA) tradicional, que fragmenta seletivamente os íons mais intensos, o DIA fragmenta todos os íons precursores em janelas m/z predefinidas. Isso fornece uma cobertura de proteoma mais profunda e melhor reprodutibilidade em grandes coortes, uma vantagem importante para comparações clínicas14. Estudos de benchmarking mostram que o DIA detecta peptídeos mais quantificáveis do que o DDA, particularmente para proteínas de baixa abundância, com menor variação entre execuções14.

Com base nesses avanços, aplicamos a análise proteômica baseada em DIA a amostras de soro de 99 crianças com TEA e 70 controles, após a depleção de proteínas de alta abundância. Nossos achados destacam o potencial das proteínas relacionadas ao sistema imunológico como marcadores moleculares para o diagnóstico precoce de TEA e demonstram o valor da proteômica baseada em DIA na descoberta de biomarcadores quando combinada com metodologia rigorosa11.

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Protocolo

O protocolo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e o protocolo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital de Saúde Materno-Infantil de Changsha; O consentimento informado foi obtido dos sujeitos.

1. Identificação de crianças com autismo com DSM-5

  1. Coletando histórico médico e informações básicas
    1. História do desenvolvimento
      1. Colete informações sobre o desenvolvimento inicial do paciente, incluindo progressão de linguagem, habilidades sociais e motoras.
      2. Observe quaisquer atrasos ou anormalidades no desenvolvimento (por exemplo, atraso na linguagem, dificuldades na interação social).
    2. História familiar
      1. Informe-se sobre qualquer histórico familiar de autismo ou outros distúrbios do neurodesenvolvimento.
    3. Nível funcional atual
      1. Avalie o desempenho do paciente na vida diária, incluindo aprendizado, trabalho, interações sociais e habilidades de vida independente.
  2. Usando critérios diagnósticos do DSM-5
    1. Déficits persistentes na comunicação social e interação social
      1. Certifique-se de que pelo menos dois dos três critérios a seguir sejam atendidos:
        1. Déficits na reciprocidade socioemocional - procure a falta de contato visual normal, expressões faciais ou linguagem corporal e dificuldade em formar amizades ou relacionamentos apropriados à idade.
        2. Déficits em comportamentos comunicativos não verbais - procure desafios no uso de gestos, expressões faciais ou tom de voz para transmitir emoções e uma compreensão limitada de sinais não verbais de outras pessoas.
        3. Déficits no desenvolvimento, manutenção e compreensão de relacionamentos - procuram dificuldade em se adaptar a diferentes contextos sociais e falta de interesse nos colegas ou incapacidade de se envolver em brincadeiras imaginativas.
    2. Padrões restritos e repetitivos de comportamento, interesses ou atividades
      1. Certifique-se de que pelo menos dois dos quatro critérios a seguir sejam atendidos:
        1. Movimentos motores estereotipados ou repetitivos (por exemplo, bater as mãos, balançar o corpo ou uso repetitivo de objetos).
        2. Insistência na mesmice ou padrões ritualizados de comportamento - procure extrema angústia por pequenas mudanças na rotina.
        3. Interesses altamente restritos e fixados - procuram um foco anormalmente intenso em tópicos ou atividades específicas.
        4. Hiper ou hiporreatividade à entrada sensorial - procure respostas atípicas a estímulos sensoriais, como sons, luzes ou toque.
  3. Avaliação do início e gravidade dos sintomas
    1. Momento dos sintomas - confirme que os sintomas estavam presentes na primeira infância (geralmente antes dos 3 anos de idade), mesmo que se tornem mais aparentes mais tarde.
    2. Impacto dos sintomas - confirme que os sintomas causam prejuízo significativo no funcionamento social, ocupacional ou em outras áreas importantes do funcionamento.
    3. Níveis de gravidade
      NOTA: De acordo com o DSM-5, a gravidade do TEA é categorizada em três níveis (Tabela Suplementar S1).
      1. Categorize como nível 1 se o paciente precisar apenas de suporte leve.
      2. Categorize como nível 2 se o paciente precisar de suporte substancial (moderado).
      3. Categorize como nível 3 se o paciente precisar de suporte muito substancial (grave).
  4. Exclusão de outras causas potenciais
    1. Exame médico Realize as avaliações médicas necessárias (por exemplo, testes genéticos, imagens cerebrais) para descartar outras condições que possam causar sintomas semelhantes (por exemplo, síndromes genéticas, deficiências auditivas, deficiências intelectuais).
    2. Avaliação de comorbidade: Avalie a presença de comorbidades (por exemplo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, transtornos de ansiedade, depressão, epilepsia, etc.).

2. Preparação da amostra para análise de espectrometria de massa DIA

  1. Conformidade ética e coleta de amostras
    1. Obtenha o consentimento informado dos pais ou responsáveis legais de crianças de 3 a 7 anos diagnosticadas com Transtorno do Espectro do Autismo (TEA).
    2. Classifique os pacientes nos níveis de gravidade 1 a 3 de acordo com os critérios diagnósticos descritos no DSM-5 americano para autismo (etapa 1.3.3).
    3. Colete amostras de soro dos participantes. Certifique-se de que todas as amostras sejam processadas dentro de quatro horas após a coleta de sangue para evitar a degradação da proteína. Mantenha as amostras no gelo durante o processamento.
  2. Remoção de proteínas de alta abundância
    1. Use um kit comercial para esgotar proteínas de alta abundância de 60 μL de soro por amostra, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, equilibre a coluna de depleção com o tampão de ligação, carregue a amostra de soro e deixe-a passar pela coluna sob fluxo de gravidade. Colete o fluxo, que contém a fração de proteína de baixa abundância.
    2. Meça a concentração total de proteína usando um ensaio de BCA. Normalize todas as amostras para uma concentração final de 0,5-1,0 μg/μL antes da digestão em solução. Certifique-se de que cada amostra contém pelo menos 100 μg de proteína para análise subsequente.
  3. Digestão de proteínas
    NOTA: A digestão das proteínas foi realizada pelo método FASP descrito por Wisniewski et al.24.
    1. Adicione o detergente, Ditiotreitol (DTT) e Iodoacetamida (IAA) no tampão UA (tampão de ureia) para bloquear a cisteína reduzida.
    2. Digerir a suspensão proteica com tripsina numa proporção de 50:1 durante a noite a 37 °C.
  4. Dessalinização de peptídeos, limpeza e fracionamento de fase reversa de alto pH
    1. Centrifugue as misturas de peptídeos a 16.000 × g por 15 min a ° C para remover detritos insolúveis.
    2. Transfira o sobrenadante (contendo peptídeos digeridos) para um novo tubo de microcentrífuga de baixa ligação para minimizar as perdas de adsorção.
    3. . Prepare microcolunas C18 (embaladas internamente com resina C18) pré-condicionando com 100% de metanol (20 μL) e equilibrando com 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (tampão A; 20 μL).
    4. Carregue a amostra de peptídeo na microcoluna. Lave a coluna com 20 μL de tampão A para remover sais, detergentes e contaminantes não peptídicos.
    5. Eluir peptídeos purificados com 20 μL de acetonitrila a 80% contendo 0,1% de TFA.
    6. Seque os peptídeos eluídos sob vácuo usando um concentrador centrífugo a vácuo. Conservar os péptidos secos a -8 °C até nova utilização.
    7. Reconstitua peptídeos secos em ácido fórmico a 0,1% antes da análise de LC-MS/MS.
    8. 2.4.8.Quantificar a concentração de peptídeos medindo a absorbância a 280 nm (OD280) utilizando um espectrofotómetro, tendo em conta as contribuições dos resíduos de triptofano e tirosina para uma quantificação precisa.
      Para fracionar misturas de peptídeos usando HPLC de fase reversa de pH alto, use uma coluna C18 (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) em um sistema de HPLC com uma taxa de fluxo de 0,3 mL / min, fase móvel A: 10 mM de formiato de amônio em água, pH 10 (ajustado com hidróxido de amônio), fase móvel B: 10 mM de formiato de amônio em acetonitrila a 90%, pH 10. Realize uma eluição de gradiente para coletar 60 frações por amostra durante ~ 60 min.
    9. Combine cada terceira fração para reduzir a redundância, resultando em 20 frações agrupadas por amostra. Seque cada fração agrupada sob vácuo para análise a jusante.
      NOTA: As frações peptídicas resultantes estão agora prontas para análise nano-LC-MS/MS.

3. Submissão para análise de espectrometria de massa DIA

  1. Análise de espectrometria de massa DIA
    1. Cravar o peptídeo de aquisição dependente de dados (DDA) da fração HPRP com peptídeos padrão iRT e separá-los usando cromatografia líquida de alta resolução de fase reversa (RP-HPLC) em um sistema nano-HPLC com uma coluna (75 μm x 150 mm; 2 μm C18 grânulos, 120 Å) a uma taxa de fluxo de 300 nL / min com fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água, fase móvel B: ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila a 95%.
    2. Eluir os peptídeos ao longo de 60 min com um gradiente linear do tampão B definido da seguinte forma: 0 - 2 min, gradiente linear de 2% a 5% do tampão B; 2 - 42 min, gradiente linear de 5% a 20% tampão B; 42 - 50 min, gradiente linear de 20% a 35% tampão B; 50 - 52 min, gradiente linear de 35% a 90% tampão B; 52 - 60 min, tampão B mantido em 90%.
    3. Analise os peptídeos eluídos no espectrômetro de massa referenciado. Adquira dados de MS usando um método top20 dependente de dados, escolhendo dinamicamente os íons precursores mais abundantes da varredura de pesquisa (350 - 1500 m/z) para fragmentação de HCD.
    4. Execute o instrumento com o modo de reconhecimento de peptídeos ativado. Use uma massa de bloqueio de 445,120025 Da como padrão interno para calibração de massa. Adquira as varreduras MS completas com uma resolução de 70.000 em m/z 200 e 17.500 em m/z 200 para varredura MS/MS. Defina o tempo máximo de injeção para 50 ms para MS e 30 ms para MS/MS, a energia de colisão normalizada para 28, a janela de isolamento para 1,6 Th e a duração da exclusão dinâmica para 30 s.
  2. Análise LC-MS/MS para aquisição independente de dados (DIA)
    1. Crave os peptídeos de cada amostra com iRT igualmente e separadamente.
    2. Execute LC-MS/MS em um espectrômetro de massa quadrupolo acoplado a um sistema nano-HPLC. Defina a condição LC da mesma forma que para o método DDA acima. Realize uma varredura de pesquisa de 400 a 1.200 m/z com resolução de 60.000 com alvo AGC de 3E6 e tempo de injeção de 30 ms. Adquira as varreduras DIA MS/MS com resolução de 15.000 com uma janela de isolamento de 20 m/z e com um alvo AGC de 1E6 e tempo de injeção de 50 ms. Defina a energia de colisão normalizada para 30.
    3. Registre os espectros de varreduras completas de MS e DIA nos tipos de perfil e centróide, respectivamente.
  3. Pesquisa de banco de dados de sequência
    1. Analise os dados do DDA MS usando o software DIA2.
    2. Pesquise os dados de MS no banco de dados humano UniProtKB (186.532 entradas totais, baixadas em 10/2019), enriquecido com proteínas que consistem em 11 sequências de peptídeos iRT.
    3. Selecione tripsina como enzima de digestão. Defina os dois locais máximos de clivagem perdidos e a tolerância de massa de 4,5 ppm para íons precursores e 20 ppm para íons fragmentos para pesquisa em banco de dados. Defina carbamidometilação de cisteínas como uma modificação fixa e acetilação da proteína N-terminal e oxidação de metionina como modificações variáveis para pesquisa em banco de dados.
    4. Filtre os resultados da pesquisa do banco de dados e exporte-os com <1% de taxa de descoberta falsa (FDR) nos níveis de proteína e correspondência com o espectro de peptídeos, respectivamente.
  4. Executar processamento de dados brutos
    1. Analise os dados do DIA MS foram analisados com o software DIA [34, 35] para uma geração de biblioteca espectral a partir dos resultados da pesquisa. Use as configurações padrão para a pesquisa e o iRT dinâmico para previsão do tempo de retenção. Certifique-se de que a correção de interferência para varredura MS/MS esteja ativada.
    2. Exporte os resultados com <1% de FDR no nível do peptídeo.

4. Análise diferencial de proteínas

  1. Realizar teste de hipóteses usando o teste t de Student combinado com mudança de dobra (FC) em http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
    1. Faça login na plataforma de nuvem e navegue até a ferramenta Análise de Teste de Hipóteses . Carregue o arquivo de dados de quantificação de proteínas pré-processado (por exemplo, formato CSV ou TXT).
    2. Nas configurações de parâmetro, selecione o teste t de Student como método estatístico e o limite de significância no valor de p < 0,05. Defina o limite de alteração de dobra como FC > 1,5 ou FC < 1/1,5. Clique em Executar Análise e aguarde a geração dos resultados.
    3. Baixe o arquivo de saída contendo valores p, log2(FC) e status de significância para cada proteína.
      NOTA: Esta abordagem de critério duplo equilibra significância estatística com relevância biológica, garantindo uma identificação robusta de proteínas diferencialmente expressas (DEPs).

5. Análise do caminho do sinal

  1. Visualização do gráfico do vulcão
    1. Navegue até a ferramenta em http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 e, em seguida, até a página da ferramenta de plotagem de vulcão .
      1. Carregue o arquivo de resultados da análise DEP da seção 4.
      2. Configure o parâmetro de visualização: Eixo X: log2(Fold Change) - indica a direção da mudança; Eixo Y: -log10(p-valor) - reflete significância estatística; Código de cores: Vermelho : proteínas significativamente reguladas positivamente (p < 0,05 e FC > 1,5); Azul : proteínas significativamente reguladas negativamente (p < 0,05 e FC < 0,667); Gray : proteínas não significativas (p ≥ 0,05 ou 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
      3. Clique em Gerar imagem e baixe a imagem de alta resolução (formato PDF/SVG) para publicação.
  2. Mapa de calor de clustering hierárquico
    1. Navegue até a ferramenta em http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. Acesse a ferramenta de mapa de calor de clustering .
      2. Carregue a matriz de expressão DEP filtrada.
      3. Defina os seguintes parâmetros: Método de normalização: pontuação Z em linha para eliminar diferenças de escala; Métrica de distância: distância euclidiana; Método de agrupamento: agrupamento hierárquico de ligação completa; Opcional: habilite o clustering de colunas e/ou linhas, dependendo do agrupamento de amostras.
      4. Clique em Executar para gerar o mapa de calor.
      5. Baixe e salve o mapa de calor como uma imagem pronta para publicação.
        NOTA: O mapa de calor representa visualmente a semelhança e divergência dos padrões de expressão de proteínas entre as amostras.
  3. Anotação funcional GO e análise de enriquecimento
    1. Instale e carregue os pacotes R necessários:
      biblioteca (clusterProfiler)
      biblioteca (org. Hs.eg.db)
      biblioteca(ggplot2)
    2. Converta IDs de proteínas (por exemplo, Uniprot ou símbolos de genes) em IDs Entrez:
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. Execute a análise de enriquecimento GO:
      go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
    4. Visualize os resultados usando gráficos de pontos:
      1. dotplot(go_enrich, showCategory = 20)
        Fórmula:
        Fator rico = (a/b) / (c/d)
        Onde:
        a = número de DEPs anotados no termo;
        b = número total de DEPs;
        c = número de proteínas de fundo anotadas no termo;
        d = número total de proteínas de fundo.
  4. Anotação da via KEGG e análise de enriquecimento
    1. Realize a análise de enriquecimento KEGG:
      kegg_enrich <- enriquecerKEGG(gene = entrez_ids$ENTREZID, organismo = "tem")
    2. Visualize os resultados da via KEGG:
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. Personalize gráficos usando ggplot2 para formatação de publicação.

6. Triagem inicial de proteínas usando análise de curva ROC

  1. Preparação de dados: Carregue o conjunto de dados proteômicos contendo todas as proteínas diferencialmente expressas (DEPs) identificadas nos grupos de transtorno do espectro do autismo (TEA) e controle. Certifique-se de que o conjunto de dados inclua valores de expressão de proteínas para ambos os grupos, com rótulos claros indicando TEA e amostras de controle.
  2. Execute a análise da curva ROC.
    1. Use o pacote pROC em R para realizar a análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para cada proteína.
    2. Avalie a capacidade de cada proteína de distinguir entre os grupos ASD e controle calculando a Área Sob a Curva (AUC).
      AUC = 0,5: Sem discriminação (equivalente ao acaso).
      0,7 ≤ AUC < 0,8: Discriminação aceitável.
      0,8 ≤ AUC < 0,9: Excelente discriminação.
      AUC ≥ 0,9: Discriminação pendente.
      NOTA: A AUC representa a probabilidade de um indivíduo selecionado aleatoriamente do grupo ASD ter um nível de proteína mais alto do que um indivíduo selecionado aleatoriamente do grupo controle. Uma AUC mais alta indica melhor desempenho diagnóstico, com valores acima de 0,8 geralmente considerados clinicamente significativos em estudos de biomarcadores.
    3. Registre os valores de AUC para todas as proteínas.
  3. Selecione biomarcadores candidatos.
    1. Identifique proteínas com uma AUC superior a 0,7 como biomarcadores candidatos.
    2. Exporte a lista de biomarcadores candidatos para análise posterior.
  4. Visualize os resultados.
    1. Use o pacote ggplot2 em R para criar visualizações das curvas ROC para as proteínas de melhor desempenho.
    2. Inclua os valores de AUC nas legendas do gráfico para maior clareza.

7. Triagem secundária usando Random Forest

  1. Prepare os dados de entrada.
    1. Use a lista de biomarcadores candidatos obtidos da análise ROC como entrada para análise de floresta aleatória.
    2. Certifique-se de que o conjunto de dados esteja formatado adequadamente, com linhas representando amostras e colunas representando valores de expressão de proteína.
  2. Treine o modelo de Floresta Aleatória.
    1. Aplique o algoritmo de floresta aleatória usando o pacote randomForest em R.
    2. Defina o número de árvores (ntree) para 500 e o número de variáveis amostradas aleatoriamente em cada divisão (mtry) para a raiz quadrada do número total de feições.
    3. Avalie a importância do recurso usando a métrica MeanDecreaseAccuracy, que mede a redução na precisão do modelo quando um recurso específico é removido.
    4. Treine um modelo de floresta aleatória usando o pacote randomForest em R:
      R. biblioteca(randomForest)
      # Exemplo: grupo de previsão (por exemplo, TEA vs. controle) usando níveis de proteína
      rf_model <- randomForest(x = protein_data,
      y = as.factor(grupo),
      importance = TRUE, # Necessário para calcular a importância do recurso
      ntree = 500) # Número de árvores
    5. Extraia métricas de importância de recursos usando a função importance():
      R. importance_scores <- importância(rf_model)
    6. Recupere os valores de MeanDecreaseAccuracy e classifique-os em ordem decrescente:
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "MeanDecreaseAccuracy"]
      importance_rank <- sort(mean_dec_acc, decrescente = TRUE)
    7. Visualize a importância do recurso usando a função varImpPlot() integrada:
      R. varImpPlot(rf_model, main = "Importância do recurso (diminuição média na precisão)")
      NOTA: A métrica MeanDecreaseAccuracy reflete o quão essencial cada recurso é para o desempenho preditivo do modelo. Uma grande diminuição na precisão após a remoção indica alta importância. Essa abordagem é particularmente útil para a descoberta de biomarcadores, pois ajuda a priorizar proteínas ou genes com o maior poder discriminatório entre os grupos.
    8. Exporte as pontuações de importância para relatórios ou análise downstream:
      R. importance_table <- dados.frame(
      Característica = nomes(importance_rank),
      MédiaDiminuiçãoPrecisão = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", row.names = FALSE)
    9. Classifique as proteínas com base em suas pontuações MeanDecreaseAccuracy.
    10. Selecione as 15 principais proteínas com as pontuações mais altas de MeanDecreaseAccuracy como os recursos mais significativos para modelagem subsequente.
    11. Exporte a lista dessas proteínas para validação adicional.
      NOTA: Proteínas com baixos valores de AverageDecreaseAccuracy podem ter impacto mínimo no desempenho do modelo se removidas.
    12. Destacar a relevância biológica das proteínas selecionadas, particularmente aquelas relacionadas às funções imunológicas ou vias implicadas no TEA.

8. Combine os resultados para a seleção final do biomarcador.

OBSERVAÇÃO: verifique se o R está instalado com os seguintes pacotes: pROC, randomForest e ggplot2. Certifique-se de que o conjunto de dados proteômicos seja pré-processado e normalizado antes da análise. Salve as listas de biomarcadores candidatos e gráficos de visualização como arquivos separados para referência.

  1. Integre as descobertas.
    1. Faça referência cruzada dos resultados da análise ROC e da triagem aleatória da floresta para identificar proteínas sobrepostas.
    2. Priorize as proteínas que aparecem em ambas as análises como biomarcadores candidatos altamente confiáveis.
    3. Execute etapas de validação adicionais, como validação cruzada leave-one-out (LOOCV), para confirmar a robustez dos biomarcadores selecionados.
    4. Use modelos de regressão logística para avaliar a precisão preditiva do conjunto combinado de biomarcadores.
    5. Crie curvas ROC e gráficos de recuperação de precisão para o conjunto final de biomarcadores usando o pacote ggplot2.
    6. Inclua métricas como AUC e valores de recordação de precisão para demonstrar o potencial diagnóstico dos biomarcadores selecionados.

9. Seleção de recursos bidirecionais

  1. Prepare os dados e defina o modelo.
    1. Carregue o conjunto de dados contendo valores de expressão de proteína e rótulos correspondentes (por exemplo, ASD vs. controle). Verifique se o conjunto de dados está pré-processado e normalizado.
    2. Defina o modelo inicial: Use um modelo linear generalizado (GLM) com uma família binomial para classificação.
    3. Use AIC como a métrica de avaliação para comparar modelos durante a seleção de recursos.
  2. Execute a seleção de recursos para frente.
    1. Comece com um modelo vazio contendo apenas o termo de interceptação.
    2. Adicione um recurso por vez com base na maior redução no AIC.
    3. Registre o valor AIC após cada adição. Pare quando nenhuma redução adicional no AIC for observada.
  3. Execute a seleção de recursos para trás.
    1. Treine um modelo usando todos os recursos disponíveis.
    2. Remova um recurso de cada vez com base no menor aumento no AIC.
    3. Registre o valor AIC após cada remoção. Pare quando nenhuma redução adicional no AIC for observada.
    4. Combine passos para frente e para trás.
  4. Alterne entre a seleção para frente e para trás.
    1. Execute uma rodada de seleção de recursos para frente, seguida imediatamente por uma rodada de seleção de recursos para trás. Repita esse processo até que nenhuma melhoria adicional no AIC seja observada.
    2. Abordagem alternativa: comece com a seleção de recursos para trás e, em seguida, execute a seleção de recursos para frente. Avalie o efeito de adicionar recursos removidos anteriormente de volta ao modelo.
  5. Finalize os recursos selecionados.
    1. Exporte a lista final de recursos selecionados e seus coeficientes correspondentes (Figura Suplementar S1).

10. Validação cruzada da seleção de características bidirecional usando regressão logística com método leave-one-out

NOTA: Certifique-se de que o R esteja instalado com os seguintes pacotes: caret, pROC e ggplot2. O conjunto de dados proteômicos deve ser pré-processado e normalizado antes da análise. Salve a matriz de confusão, a curva ROC e o resumo do modelo como arquivos separados para referência.

  1. Prepare os dados e defina o modelo.
    1. Carregue o conjunto de dados contendo valores de expressão de proteína e rótulos correspondentes (por exemplo, ASD vs. controle) do arquivo GLMSTEP/bothFitModel.txt. Verifique se o conjunto de dados está pré-processado e normalizado.
    2. Defina o modelo inicial usando um modelo linear generalizado (GLM) com uma família binomial para classificação.
    3. Use a precisão e o coeficiente Kappa como métricas de avaliação para avaliar o desempenho do modelo durante a validação cruzada.
  2. Execute a validação cruzada leave-one-out.
    1. Inicialize a validação cruzada usando o pacote de acento circunflexo no R para implementar a validação cruzada leave-one-out (LOOCV).
    2. Ajuste o modelo de regressão logística usando os oito recursos selecionados.
    3. Registre a precisão e o coeficiente Kappa para cada iteração de validação cruzada.
  3. Analise os resultados da validação cruzada.
    1. Resuma os resultados.
      NOTA: Os resultados do processo LOOCV serão semelhantes (como neste estudo): Modelo Linear Generalizado, 169 amostras, 8 preditores, 2 classes: 'A', 'B', Reamostragem: Validação Cruzada Leave-One-Out, Resumo dos tamanhos das amostras: 168, 168, 168, 168, 168, ... , Resultados da reamostragem: Precisão Kappa 0,9526627 0,9024531.
    2. Interprete as métricas.
      NOTA: Aqui, o modelo alcançou uma precisão de 0,9527 e um coeficiente Kappa de 0,9025, indicando excelente concordância entre os resultados previstos e observados.
      1. Observe o coeficiente Kappa para medir o poder preditivo do modelo. O coeficiente Kappa varia de -1 a 1, onde 0 indica previsão aleatória e 1 indica concordância perfeita.
        NOTA: Neste estudo, o valor Kappa de 0,9025 reflete o forte poder preditivo do modelo.
  4. Avalie os coeficientes do modelo.
    1. Examine os coeficientes do modelo de regressão logística para entender a contribuição de cada recurso. Avalie o desvio nulo, o desvio residual e o AIC para confirmar o ajuste do modelo.
      NOTA: Por exemplo, neste estudo, obtivemos desvio nulo: 2,2928e + 02 em 168 graus de liberdade, desvio residual: 2,2378e-07 em 160 graus de liberdade, AIC: 18, número de iterações de pontuação de Fisher: 25.
  5. Visualize os resultados.
    1. Crie uma matriz de confusão para visualizar o desempenho preditivo do modelo.
    2. Plote a curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para avaliar o desempenho de classificação do modelo.
    3. Interprete o resultado s. Calcule a área sob a curva (AUC) para obter o índice de desempenho de classificação do modelo.
      NOTA: A curva ROC demonstra o trade-off entre a taxa de verdadeiros positivos e a taxa de falsos positivos. A área sob a curva (AUC) deve estar próxima de 1, indicando excelente desempenho de classificação. A curva ROC reflete as mudanças na taxa de verdadeiros positivos e na taxa de falsos positivos do modelo em diferentes limites. Quanto maior o valor da AUC, melhor será o desempenho do modelo.

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Resultados

O estudo incluiu 99 crianças com TEA e 70 controles pareados por idade (3-7 anos), com distribuição equilibrada por sexo (Tabela Suplementar S2). O soro foi coletado após jejum noturno usando protocolos padronizados: o sangue foi coletado em tubos separadores de soro, deixado coagular em temperatura ambiente por 30 min e, em seguida, centrifugado a 1.500 × g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi aliquotado e armazenado a -80 ° C até processamento posterior. Prot...

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Discussão

O protocolo descrito neste manuscrito descreve uma abordagem abrangente para identificar biomarcadores moleculares relacionados ao sistema imunológico no transtorno do espectro do autismo (TEA) usando espectrometria de massa de aquisição independente de dados (DIA) e técnicas de aprendizado de máquina. As etapas importantes do protocolo garantem resultados confiáveis e reprodutíveis, ao mesmo tempo em que destacam áreas onde modificações ou solução de problemas podem ser necessárias (

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Obrigado a todos os membros do laboratório central e àqueles que ajudaram neste projeto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes e produtos químicosAcetonitrila (grau HPLC)Fisher CientíficoResposta A18-50
Reagentes e produtos químicosBicarbonato de amônio (NH? HCO?)Sigma-Aldrich38939
Reagentes e produtos químicosFormato de amônioSigma-Aldrich90265
Reagentes e produtos químicosAlbumina de soro bovino (BSA)Thermo Fisher Científico23212
Reagentes e produtos químicosDitiotreitol (TDT)Sigma-Aldrich43815
Reagentes e produtos químicosÁcido fórmico (0,1%)Thermo Fisher Científico28905
Reagentes e produtos químicosIodoacetamida (IAA)Sigma-AldrichI1149
Reagentes e produtos químicosMetanol (grau HPLC)Fisher CientíficoResposta 452-4
Reagentes e produtos químicosÁcido trifluoroacético (TFA)Sigma-AldrichT6508
Reagentes e produtos químicosUreiaSigma-AldrichU5378
Kits e Reagentes EspecializadosKit de ensaio de proteína BCAThermo Fisher Científico23227
Kits e Reagentes EspecializadosC18 Sep-Pak CartuchosÁguasWAT023590
Kits e Reagentes EspecializadosC18 StageTips (caseiro)3M Empore™
Kits e Reagentes EspecializadosKit de Depleção de Proteína de Alta AbundânciaMillipore Sigma122642
Kits e Reagentes EspecializadosPeptídeos padrão iRTBiognosys AG
Kits e Reagentes EspecializadosKit ELISA de lisozimaWuhan Fine Biotech Co.Ltda.
Kits e Reagentes EspecializadosMistura enzimática de tripsina / LysCPromegaV5071
EquipamentoCentrifugaEppendorf5430R
EquipamentoSistema Easy-nLC 1200Thermo Fisher Científico
EquipamentoNanodrop One EspectrofotômetroThermo Fisher CientíficoND-UM-W
EquipamentoEspectrômetro de massa Q Exactive HF-XThermo Fisher Científico
EquipamentoConcentrador SpeedVacThermo Fisher CientíficoSPD131DDA
EquipamentoCentrífuga de rotor de caçamba de swinningVário
EquipamentoColuna Waters XBridge BEH130ÁguasC18, 3,5 μ m, 2.1× 150 milímetros
EquipamentoSistema de HPLC Agilent 1260Agilent1260 Infinito II
Software e ferramentas onlineBiocondutor (pacotes R)bioconductor.org
Software e ferramentas onlineacento circunflexo (pacote R)CRANcaret_6.0-93
Software e ferramentas onlineclusterProfiler (pacote R)Biocondutor4.0.5
Software e ferramentas onlineDIA-NNSoftware DIA-NNv1.8
Software e ferramentas onlineggplot2 (pacote R)CRAN3.4.0
Software e ferramentas onlineMaxQuantInstituto Max Planck1.6.17
Software e ferramentas onlineomickits.comPlataforma de nuvem OmiKitshttp://www.omickits.com
Software e ferramentas onlinepROC (pacote R)CRAN1.18.0
Software e ferramentas onlinerandomForest (pacote R)CRAN4.7-1.1
Software e ferramentas onlinePulsar X do EspectronautaBiognosys AG17
Software e ferramentas onlineBanco de dados humano UniProtKBuniprot.orgVersão 2019_10
Outros materiaisTubos de microcentrífuga de baixa ligaçãoEppendorf30120094
Outros materiaisTubos separadores de soro (SST)BD Biociências367988
Outros materiais3M Empore™ Discos C183M

Referências

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