Análise de dados de microscopia multidimensional usando Cell-ACDC

Summary

A análise precisa de dados de microscopia multidimensional requer fluxos de trabalho complexos. Este artigo demonstra como usar o software Cell-ACDC. Ele aproveita modelos orientados por IA de última geração para segmentação, rastreamento, análise de linhagem celular e quantificação de dados de microscopia. Crucialmente, complementa esses modelos com uma estrutura inovadora para correção semiautomatizada da saída dos modelos.

Abstract

Avanços recentes na microscopia quantitativa para as ciências da vida permitiram que os biólogos experimentais investigassem células com resolução e velocidade sem precedentes. Ao mesmo tempo, a revolução da IA aumentou drasticamente a quantidade de informações que podem ser extraídas de dados de microscopia multidimensional. No entanto, a grande quantidade de dados gerados e a complexidade dos modelos de IA de última geração representam um grave gargalo na fase de análise de imagens. O Cell-ACDC é um software de código aberto e fácil de usar que fornece uma poderosa solução de ponta a ponta para segmentação, rastreamento e análise quantitativa de células únicas em dados de microscopia multidimensional. Ele é adaptado para biólogos experimentais que podem não ter o conhecimento técnico avançado necessário para implementar tais modelos. Este artigo mostra como utilizar a estrutura para aproveitar facilmente os modelos mais recentes, juntamente com muitas ferramentas para correção de dados inteligente e semiautomatizada, para maximizar a quantidade de informações biológicas obtidas. O Cell-ACDC oferece suporte a dados de microscopia multicanal, lapso de tempo e pilha z e fornece um conjunto de ferramentas dedicado adaptado a cada tipo de dimensionalidade de dados. Devido ao seu design modular, que permite que novos modelos sejam perfeitamente integrados e acessados diretamente pelos biólogos, o Cell-ACDC tem o potencial de servir como uma ferramenta de referência para análise de dados de microscopia.

Introduction

A microscopia tornou-se fundamental para acelerar a descoberta biológica em todas as etapas da pesquisa e desenvolvimento, desde a ciência básica ^1,2,3 até a descoberta e teste de medicamentos ^4,5 e em uma notável variedade de tamanhos, de culturas de células a tecidos ^6,7, organoides ^8,9 e organismos inteiros¹⁰. Essas técnicas avançadas de microscopia, no entanto, apresentam duas desvantagens principais. Primeiro, os dados de microscopia são inerentemente grandes¹¹, especialmente quando se adquirem múltiplas dimensões (por exemplo, tempo e volumes). Em segundo lugar, a extração precisa das ricas informações biológicas nos dados requer a implantação de estruturas avançadas de análise de imagem que geralmente se baseiam em modelos de IA. Essa tarefa pode ser assustadora para biólogos experimentais. Portanto, as etapas de manuseio, processamento e análise de dados podem retardar muito a pesquisa científica, reduzindo o potencial de novas descobertas. Idealmente, as estruturas de software para análise de bioimagem devem ajudar o usuário em todas as etapas da análise, desde o manuseio de arquivos de microscopia bruta até a segmentação e rastreamento até a análise downstream para extrair insights biológicos. Na prática, o rápido desenvolvimento de novos softwares para análise de bioimagens, embora seja um resultado positivo, teve o efeito colateral de criar um cenário disperso de ferramentas específicas para uma etapa específica da análise ou exigir conhecimentos avançados de programação. Isso deixa o usuário com a tarefa desafiadora de montar o fluxo de trabalho de análise, muitas vezes resultando em pipelines abaixo do ideal onde os dados são salvos, manipulados e convertidos várias vezes para torná-los compatíveis com a próxima ferramenta. Além disso, o desenvolvimento da análise de bioimagem não é padronizado para uma única linguagem de programação, com muitas ferramentas sendo desenvolvidas como plug-ins ImageJ¹² ou QuPath¹³ (Java), plug-ins Napari (Python)¹⁴ ou scripts Python. Em alguns casos, esse ambiente desafiador leva os cientistas a optar pela análise manual, um processo que não é apenas lento, mas também introduz viés humano e dificulta a reprodutibilidade.

Para resolver isso, foi desenvolvido o Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵, um conjunto de ferramentas de software baseado em GUI de código aberto escrito em Python para analisar dados de microscopia multidimensional. Crucialmente, o Cell-ACDC fornece uma infinidade de modelos de última geração pré-implementados e instalados automaticamente (quando necessário) para segmentação (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, etc.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^,27,28) e rastreamento (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, etc.19,29,30,31,32,33,34). Esses modelos são complementados com uma estrutura para visualização de dados anotados e correções manuais assistidas por computador. Além disso, dentro da mesma estrutura, o Cell-ACDC fornece um módulo para cada etapa do pipeline de análise de imagens, cuidando automaticamente do manuseio, processamento e salvamento de dados (Figura 1). Mais especificamente, ele permite que o usuário execute segmentação de instância (por exemplo, células únicas), rastreamento de objetos, anotação de estados de células (por exemplo, estágio do ciclo celular) e várias formas de quantificação, incluindo análise dos canais de fluorescência disponíveis.

Um dos principais pontos fortes do Cell-ACDC é a análise de dados de microscopia de lapso de tempo de células vivas, o que apresenta desafios significativos devido à necessidade de consistência entre os pontos de tempo. Embora existam vários modelos para segmentação e rastreamento automatizados de células individuais, as correções manuais continuam sendo essenciais para abordar questões biológicas complexas. O Cell-ACDC oferece um conjunto de ferramentas projetadas especificamente para agilizar o processo de correção. Ele integra algoritmos inteligentes para minimizar o número de ajustes manuais. Notavelmente, as correções são propagadas automaticamente em todos os quadros futuros e passados relevantes, preservando a integridade dos dados durante toda a análise. Dado o seu design modular e a crescente base de utilizadores, o desenvolvimento contínuo deste software é uma prioridade, com esforços contínuos focados na integração de novos modelos e na resposta às necessidades em evolução da comunidade.

Protocol

NOTA: O Cell-ACDC foi projetado para ser o mais claro e intuitivo possível para usuários sem experiência em programação. Isso é obtido principalmente dividindo o fluxo de trabalho de análise em etapas menores e fáceis de seguir e fornecendo informações adicionais por meio de dicas de ferramentas e botões de informações. Como o Cell-ACDC abrange uma ampla gama de etapas cuja ordem de execução geralmente não é sequencial, um gráfico de decisão é mostrado na Figura 2. O guia a seguir passará por um exemplo específico. As etapas 10 e 11 podem ser usadas para importar outros dados em vez de usar os dados fornecidos baixados na etapa 3.

1. Instalando o Cell-ACDC

NOTA: O Cell-ACDC é atualmente distribuído como um pacote Python por meio do Python Package Index (PyPI) e pode ser instalado com o comando pip install "cellacdc[torch]".

1. Configurar Miniforge
   1. Baixe o instalador do site do Miniforge (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).
   2. Instale o Miniforge: Para Windows, execute o instalador baixado e siga as instruções. Para Mac ou Linux, abra o terminal e execute o seguinte comando:
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Quando a instalação estiver concluída, abra o terminal correto seguindo as instruções abaixo:
      1. No Windows, pressione Win + S, digite Miniforge Prompt e pressione Enter.
      2. Para Mac/Linux: abra o aplicativo Terminal.
2. Gerencie o ambiente virtual.
   1. No prompt, digite o comando a seguir para criar um ambiente virtual. Em seguida, pressione Enter para executar o comando.
      conda criar -y -n acdc python=3.12
   2. Ative o ambiente executando:
      conda ativar acdc
3. Instalação
   1. Com o ambiente ativo, instale o Cell-ACDC executando o seguinte comando:
      pip install "cellacdc[tocha]"
   2. Após a instalação, execute Cell-ACDC -y para permitir que o software conclua sua configuração.

2. Executando o Cell-ACDC

1. Abra o terminal correto (consulte a etapa 1.1.3).
2. Ative o ambiente executando o comando:
   conda ativar acdc
3. Inicie o Cell-ACDC executando o seguinte comando:
   Célula-ACDC

3. Baixando dados de amostra

NOTA: Os dados de exemplo serão baixados para "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" no Windows e para "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" no MacOS e Linux. Se o guia de boas-vindas não for exibido, selecione Ajuda > Guia de boas-vindas (Figura 3B) na barra de menus da janela principal do iniciador do Cell-ACDC (Figura 1), .

1. Selecione Baixar e testar com um exemplo de lapso de tempo (Figura 3B).
2. Aguarde até que o download seja concluído.
3. Clique em Não, obrigado para parar de carregar os dados diretamente na GUI.

4. Módulo de preparação de dados

NOTA: Os dados podem ser alinhados antes da segmentação e as regiões de interesse (ROIs) podem ser selecionadas . Essas etapas são opcionais, mas benéficas se o campo de visão for deslocado ao longo do tempo ou se apenas partes dos dados forem de interesse, respectivamente.

1. Clique em Iniciar módulo de preparação de dados... na janela principal para abrir o módulo de preparação de dados (Figura 1A, Módulo de pré-processamento de dados).
2. Selecione a pasta que contém os dados.
   1. Clique no ícone de pasta na barra de ferramentas da nova janela para carregar os dados da microscopia (Figura 4A).
   2. Selecione a pasta que contém os dados e, em seguida, confirme a seleção pressionando Selecionar pasta.
3. Selecione um canal para o processo de alinhamento usando o menu suspenso para selecionar o canal phase_contr . Em seguida, pressione Ok para confirmar a seleção (Figura 4B).
4. Pressione Ok para confirmar as propriedades da imagem (Figura 4C).
   NOTA: Se estiver trabalhando com dados de pilha z, mas apenas uma fatia deve ser usada para segmentação, selecione a fatia z apropriada usando o controle deslizante. Use os botões na barra de ferramentas para aplicar a seleção a outros quadros, se necessário.
5. Execute o processo de alinhamento.
   1. Clique no botão Iniciar , que também está localizado na barra de ferramentas (Figura 5A).
   2. Clique em Sim para iniciar o processo de alinhamento.
      NOTA: Clique em Não para ignorar o alinhamento.
   3. Pressione Ok para confirmar que as informações sobre preenchimento foram confirmadas.
      NOTA: O alinhamento pode levar tempo, dependendo do tamanho dos dados.
   4. Pressione Ok para concluir o alinhamento assim que o processo for concluído.
6. Defina ROIs e ROIs em segundo plano.
   1. Vá para o último quadro do vídeo de segmentação usando o controle deslizante de seleção de quadro na parte inferior da GUI de preparação de dados.
   2. Ajuste o ROI de fundo adicionado automaticamente arrastando-o pela imagem ou redimensionando-o usando os diamantes. Certifique-se de que o ROI em segundo plano não tenha células. Deixe o ROI como está (Figura 5B).
      NOTA: Para definir ROIs adicionais, clique no botão adicionar ROI de corte (localizado na barra de ferramentas) e selecione-os no visualizador. Normalmente, o ROI deve ser o menor possível, abrangendo todas as células de interesse em quadros relevantes. No entanto, para garantir a reprodutibilidade dentro deste protocolo, recomenda-se não modificá-lo.
7. Para cortar as ROIs selecionadas em novos arquivos de imagem, clique no botão Cortar mais à esquerda.
   NOTA: Esta etapa é opcional. Se as imagens cortadas não forem necessárias, a janela pode ser fechada. As coordenadas de todas as ROIs e ROIs em segundo plano são salvas automaticamente e podem ser usadas posteriormente para segmentação. Se o ROI não foi alterado, esses botões não farão nada. As opções de corte incluem direções XY, fatias z ou intervalos de tempo específicos. Cada botão é rotulado com as dimensões que serão cortadas.
8. Salvar os dados alinhados
   1. Feche a janela usando o botão de fechamento da janela (por exemplo, o X no canto superior direito no Windows ou o ponto vermelho no canto superior esquerdo no macOS ou Linux).
   2. Pressione Sim, salvar dados alinhados para salvar os dados alinhados.
   3. Clique em Sim, salvar dados alinhados novamente para confirmar.
9. Salve os dados cortados se a etapa 4.7 não tiver sido ignorada e o ROI não tiver sido modificado.
   1. Selecione Sim, salvar dados cortados para salvar os dados cortados.
   2. Pressione Sim, corte por favor para confirmar o salvamento do corte.
   3. Clique em Ok para confirmar o caminho da pasta padrão.
      NOTA: Selecione uma pasta diferente para manter os dados não cortados.
   4. Selecione Sim, substituir para confirmar se o caminho padrão foi usado antes.
   5. Pressione Ok para confirmar após a conclusão do processo.

5. Encontrar o melhor modelo e parâmetros para segmentação

NOTA: O Cell-ACDC oferece uma GUI com feedback em tempo real para encontrar os melhores parâmetros de segmentação (Figura 6). Em geral, esses modelos são fornecidos por terceiros, cada um com sua própria documentação. É responsabilidade do usuário determinar o melhor modelo de segmentação e seus parâmetros ideais, e os usuários devem verificar a documentação do respectivo modelo que estão tentando para obter mais informações.

1. Clique em Iniciar GUI... na janela principal (Figura 1A, Visualize e corrija o módulo).
2. Carregue os dados de exemplo.
   1. Clique no ícone de pasta na barra de ferramentas da nova janela para abrir o menu de seleção de pasta.
   2. Selecione a pasta que contém os dados e pressione Selecionar pasta para confirmar a seleção.
3. Selecione um canal para visualização. Use o menu suspenso para selecionar o canal phase_contr para segmentação e selecione Ok para confirmar.
4. Conclua o carregamento dos dados.
   1. Pressione Ok para confirmar o nome da máscara de segmentação padrão.
   2. Clique em Ok para Posições carregadas para confirmar as propriedades da imagem.
   3. Selecione Não para impedir o carregamento de dados de fluorescência adicionais.
5. No seletor de modo (Figura 6, "Seletor de modo"), selecione o modo Segmentação e rastreamento.
6. Encontre as melhores configurações de pré-processamento.
   1. Navegue até Pré-processamento de > de imagem... na barra de menus superior para abrir a janela de pré-processamento personalizada (Figura 7A).
   2. Selecione Remover Hot Pixels ou outra etapa de pré-processamento desejada no menu suspenso.
   3. Use o ícone de engrenagem para inicializar e alterar as configurações de uma etapa. Use o botão de informações para exibir informações sobre a etapa e os parâmetros disponíveis. Deixe as configurações inalteradas.
   4. Use o ícone de adição para adicionar mais uma etapa.
   5. Selecione Redimensionar intensidades e confirme as configurações repetindo as etapas 5.6.1 e 5.6.2.
   6. Marque a caixa de seleção de visualização para ver os efeitos das etapas em tempo real.
   7. Clique em Aplicar a todos os quadros (Figura 7B).
   8. Pressione Salvar dados pré-processados para iniciar o processo de salvamento.
   9. Pressione Ok para confirmar o nome padrão.
   10. Feche a janela Receita de pré-processamento.
7. Encontre as melhores configurações de segmentação.
   1. Selecione Segmento > quadro exibido do segmento na faixa de opções superior e, em seguida, selecione YeaZ_v2 (Figura 8A).
   2. Pressione Ok para baixar YeaZ_v2 se solicitado.
      NOTA: O download pode levar vários minutos. O progresso é exibido na janela do console. Não feche a GUI durante o download, mesmo que não responda.
   3. Deixe os parâmetros padrão inalterados.
      NOTA: A maioria dos parâmetros tem botões de informações que fornecem orientações detalhadas.
   4. Habilite o pós-processamento verificando os parâmetros de segmentação de pós-processamento (Figura 8B).
   5. Aceite os parâmetros clicando em Ok.
      NOTA: A segmentação pode demorar um pouco, dependendo da complexidade do modelo, do tamanho da imagem e das especificações do computador. Especialmente, a versão 4 do Cellpose pode ser muito lenta.
   6. Se for perguntado sobre a ativação da segmentação automática, selecione Não.
   7. Verifique se a segmentação funciona bem.
   8. Repita a etapa 5.7.1 para reabrir os parâmetros de segmentação.
   9. Se os resultados da segmentação forem os esperados, pressione Salvar todos os parâmetros no arquivo de receita. Caso contrário, altere os parâmetros de segmentação e repita as etapas 5.7.4 a 5.7.8.
   10. Use a entrada de texto para dar à receita de segmentação o teste de nome.
   11. Clique em Ok para aceitar o nome.
   12. Pressione Ok para terminar de salvar o fluxo de trabalho.
   13. Feche a tela de seleção de parâmetros.
8. Fechando a janela da GUI
   1. Feche a janela da GUI.
   2. Pressione Não para não salvar antes de fechar.

6. Segmentação e rastreamento (processamento em lote)

1. Clique em Iniciar módulo de segmentação... na janela principal (Figura 1A, módulo "Segmentar e rastrear").
   1. Selecione os dados de exemplo. Use o seletor de pastas do Cell-ACDC para escolher a pasta que contém os dados e pressione Selecionar pasta para confirmar a seleção.
2. Selecione os parâmetros para processamento em lote.
   1. Selecione o canal phase_contr_preprocessed como o canal para segmentação. Pressione Ok para confirmar a seleção.
      NOTA: Alguns modelos usam um canal adicional como entrada. Esse canal pode ser selecionado posteriormente ao definir outros parâmetros de segmentação.
   2. Confirme as propriedades da imagem clicando em Ok.
3. Defina as configurações do modelo de segmentação.
   1. Escolha YeaZ_v2 como o modelo que deve ser usado para segmentação e confirme a seleção clicando em Ok.
   2. Clique no botão Carregar receita salva... para carregar a receita salva anteriormente.
   3. Selecione segmentation_recipe_test.ini na lista e confirme a seleção clicando em Ok.
   4. Ignore a mensagem de carregamento bem-sucedido pressionando Ok.
   5. Confirme os parâmetros selecionando Ok.
4. Confirme outras configurações de segmentação.
   1. Pressione Ok para aceitar o nome padrão do arquivo de segmentação.
   2. Selecione Não para confirmar que toda a imagem deve ser segmentada.
   3. Selecione Ok para definir o quadro de parada como o quadro final do lapso de tempo.
5. Defina as configurações de rastreamento. Selecione YeaZ como o método de rastreamento a ser usado e confirme a seleção pressionando Ok.
6. Execute a rotina de segmentação e rastreamento.
   1. Clique em Executar agora para executar o pipeline de segmentação e rastreamento.
      NOTA: Isso pode levar várias horas com base no tamanho da imagem, na complexidade do modelo e nas especificações do computador. Em execuções de teste, a segmentação dos dados de teste com YeaZ_v2 levou cerca de 2 minutos em um dispositivo sem uma GPU.
   2. Clique em Ok para concluir a segmentação.

7. Corrigindo erros de segmentação e rastreamento

NOTA: Em geral, as células ausentes no quadro atual em comparação com o anterior são indicadas por um contorno e ID amarelos. As células recém-detectadas aparecem com um ID vermelho e um contorno grosso. As células que foram aceitas como perdidas são mostradas com um contorno verde e ID.

1. Clique em Iniciar GUI... na janela principal (Figura 1A, módulo "Visualizar e corrigir").
2. Carregue os dados de exemplo.
   1. Clique no ícone de pasta na barra de ferramentas da nova janela.
   2. Selecione a pasta que contém os dados e pressione Selecionar pasta para confirmar a seleção.
3. Selecione um canal para visualização. Use o menu suspenso para selecionar o canal phase_contr_preprocessed e selecione Ok para confirmar.
4. Selecione o nome da máscara de segmentação. Selecione Carregar selecionado para carregar o arquivo de segmentação criado na etapa anterior.
5. Conclua o processo de carregamento de dados.
   1. Confirme as propriedades da imagem clicando em Ok para posições carregadas.
   2. Selecione Não para impedir o carregamento de dados de fluorescência adicionais.
6. Use o seletor de modo (Figura 6, "Seletor de modo") para selecionar o modo Segmentação e Rastreamento .
   NOTA: Use as caixas de seleção na parte inferior da GUI para alterar as anotações exibidas. As imagens esquerda e direita podem exibir anotações diferentes.
7. Selecione um rastreador em tempo real. Na barra de menus (Figura 6, "Barra de menus"), navegue até Rastreamento > Selecionar algoritmo de rastreamento em tempo real e selecione o rastreador em tempo real desejado. Use as etapas Cell-ACDC ou Cell-ACDC 2 para levedura em brotamento ou divisão simétrica Cell-ACDC para outros organismos.
8. Corrija a segmentação e o rastreamento.
   1. Use as teclas de seta para a esquerda e para a direita para navegar entre os quadros.
   2. Navegue até o quadro 10.
   3. Pressione a tecla S para ativar a ferramenta manual de separação de botões.
   4. Use o botão direito do mouse para dividir automaticamente a máscara de segmentação da célula 1.
   5. Navegue até o quadro 14.
   6. Pressione a tecla B para ativar o pincel.
   7. Desenhe a máscara de segmentação ausente para o botão usando o botão esquerdo do mouse.
   8. Percorra os quadros subsequentes enquanto corrige erros de segmentação e rastreamento. Use as ferramentas disponíveis (Figura 6, "Editar barra de ferramentas"). Corrija pelo menos até o quadro 42.
      NOTA: A maioria das ferramentas tem uma dica de ferramenta explicando sua funcionalidade. Passe o mouse sobre uma ferramenta para exibir a dica de ferramenta.

8. Anotações do ciclo celular

NOTA: Passe para esta etapa somente depois de concluir as correções de segmentação e rastreamento para todos os quadros de interesse. Use o modo de anotação correto dependendo do tipo de divisão celular (simétrica, por exemplo, células de mamíferos, ou assimétrica, por exemplo, levedura em brotamento). Para os dados de amostra, consulte "Células divididas assimetricamente", etapa 8.1. A etapa 8.2 descreve o fluxo de trabalho geral para células divisórias simétricas.

1. Células que se dividem assimetricamente
   NOTA: Para organismos como leveduras em brotamento, os botões podem ser atribuídos às mães. Ambos os objetos precisam estar presentes no mesmo quadro. Por padrão, o estágio esperado do ciclo celular com base nas anotações para levedura em brotamento é mostrado. O estágio do ciclo celular dos botões é exibido em vermelho, enquanto o de todos os outros objetos é exibido em branco. As mães estão conectadas aos seus botões com uma linha amarela tracejada.
   1. Ative a análise do ciclo celular usando o seletor de modo (Figura 6, "Seletor de modo").
   2. Selecione Sim, vá para o quadro 1 quando solicitado.
   3. Use as teclas de seta para a esquerda e para a direita para navegar entre os quadros.
   4. Navegue até o quadro 41. Clique em Ok para aceitar a inicialização da tabela Anotação do Ciclo Celular quando solicitado.
   5. Clique com o botão direito do mouse na célula 1 ou em seu botão para separar a conexão e anotar o evento de divisão celular.
   6. Continue até que todos os quadros relevantes tenham sido visualizados. Corrija erros nas atribuições automáticas de botões mãe usando as ferramentas disponíveis (Figura 6, "Editar barra de ferramentas").
   7. Ferramentas disponíveis
      NOTA: Essas ferramentas, exceto a ferramenta Break/Rebind Mother-Bud Association , podem ser ativadas usando um atalho personalizável ou pressionando os botões associados na barra de ferramentas.
      1. Atribuir Bud à Mãe (A): Ative a ferramenta Atribuir Bud à Mãe . Pressione e segure o botão direito do mouse no botão. Arraste para a célula-mãe correspondente e solte o botão do mouse.
         NOTA: Use esta ferramenta quando a atribuição automática de botões às mães estiver incorreta.
      2. Anotar histórico desconhecido (U): Ative a ferramenta Anotar histórico desconhecido . Use o botão direito do mouse para clicar na célula que deve ser anotada como tendo um histórico desconhecido.
         NOTA: Use esta ferramenta para anotar manualmente células com um histórico desconhecido, ajudando a corrigir ambiguidades de linhagem onde a inferência automática é insuficiente.
      3. Reinicializar a anotação do ciclo celular
         NOTA: Use esta opção para executar novamente o algoritmo de anotação do ciclo celular a partir do quadro atual. Isso garante a consistência com as correções ou atualizações recentes feitas nos dados de segmentação/rastreamento.
      4. Quebrar/religar a associação mãe-botão: Certifique-se de que nenhuma outra ferramenta esteja selecionada. Clique com o botão direito do mouse em um par mãe-botão existente para quebrar a associação ou clique com o botão direito do mouse novamente para restabelecer a conexão.
2. Células divisórias simétricas
   NOTA: Este recurso está em teste beta e será lançado oficialmente em breve. É possível atribuir duas ou mais células-filhas a uma única célula-mãe. As células-mãe potenciais são aquelas presentes no quadro anterior, mas ausentes no atual, enquanto as células-filhas potenciais são células recém-aparecidas no quadro atual.
   1. Ative a Divisão normal: Árvore de linhagem usando o seletor de modo (Figura 6, "Seletor de modo").
   2. Selecione Sim, vá para o quadro 1 quando solicitado.
   3. Use as teclas de seta para a esquerda e para a direita para navegar entre os quadros.
   4. Corrija erros nas atribuições automáticas de mãe e filha usando as ferramentas disponíveis (Figura 6, "Editar barra de ferramentas").
   5. Propague as alterações quando solicitado clicando em Propagar .
   6. Ferramentas disponíveis
      NOTA: Essas ferramentas podem ser ativadas usando o atalho ou os respectivos botões na barra de ferramentas.
      1. Localizar a mãe para um novo ID de célula (F): Ative a ferramenta Localizar mãe para um novo ID de célula . Clique com o botão direito do mouse na nova célula para percorrer as células-mãe candidatas. Shift + clique com o botão direito do mouse para retroceder pelos candidatos.
         NOTA: Use esta ferramenta para atribuir ou modificar a mãe de uma célula filha.
      2. Definir mãe desconhecida (U): Ative a ferramenta Definir mãe desconhecida . Clique com o botão direito do mouse na célula cuja mãe é desconhecida.
         NOTA: Use esta ferramenta para designar manualmente a mãe de uma célula como desconhecida.

9. Salvando dados

1. Navegue até Arquivo > Salvar na faixa de opções superior.
2. Clique em Definir medidas... para selecionar as medidas desejadas.
3. Marque a caixa de seleção ao lado de métricas mCitrine ou quaisquer outras medidas desejadas.
4. Clique em Ok para confirmar.
5. Clique em Sim para salvar as medidas.
6. Clique em Ok para confirmar o quadro até o qual as medições devem ser salvas.
7. Clique em Não quando solicitado sobre a concatenação de dados.

10. Crie a estrutura de dados

NOTA: Esta seção discute a preparação dos dados de microscopia para segmentação e rastreamento. Isso pode ser ignorado quando os dados de demonstração são usados, que são baixados em "Download de dados de exemplo". A estrutura de dados que será gerada é descrita na Figura 9.

1. Coloque o(s) arquivo(s) de microscopia em uma pasta vazia.
   NOTA: Formatos de microscopia como .czi (Zeiss), .lif (Leica) e .nd2 (Nikon), bem como arquivos de .tif único e .png, são suportados.
2. Clique no módulo 0. Criar estrutura de dados... na janela principal (Figura 1A, módulo "Criar estrutura de dados").
3. Selecione BioIO ou Fiji Macro.
   1. Se o Windows for usado, clique em Usar BioIO, enquanto para usuários de MacOS e Linux , selecione Usar macro de Fiji.
      NOTA: A seguir, presume-se que o Windows seja usado.
   2. Se solicitado a instalar o BioIO, pressione Ok para instalar.
   3. Selecione o arranjo do arquivo de microscopia. Selecione a opção que corresponde à organização dos arquivos de microscopia usando o menu suspenso e pressione Ok para confirmar.
4. Selecionar pastas de origem e destino e estratégia de carregamento de dados
   1. Pressione Concluído para confirmar se os arquivos estão em uma pasta vazia.
   2. Use o seletor de pastas do Cell-ACDC para escolher a pasta que contém o(s) arquivo(s).
   3. Pressione Selecionar pasta para escolher uma pasta.
   4. Pressione Selecionar pasta novamente para escolher a mesma pasta da pasta de destino.
      NOTA: O arquivo de microscopia bruto não é excluído.
   5. Selecione Sim, carregar toda a posição de uma vez.
5. Se solicitado a instalar um subpacote BioIO, pressione Ok para instalar.
6. Defina os metadados para o arquivo de entrada.
   1. Corrija os metadados.
      NOTA: Verifique novamente a "Ordem das dimensões" clicando no ícone de olhinho ao lado dos campos Nome do canal . Outros metadados que não puderam ser carregados do arquivo bruto são destacados.
   2. Pressione Ok para confirmar os metadados.
   3. Pressione Sim para confirmar a ordem das dimensões.
7. Aguarde a conclusão do processo.
8. Pressione Sim para fechar a janela quando o processo for concluído.
   NOTA: A criação da estrutura de dados pode levar horas, dependendo do tamanho dos dados.

11. Utilitários de pré-processamento de dados

NOTA: Várias opções para processar imagens antes de passar para a análise estão disponíveis na janela principal. Para acessar essas ferramentas, vá para o menu suspenso Utilitários na barra de menus da janela principal (Figura 1B, "Utilitários"), passe o mouse sobre Pré-processamento de imagem e selecione a opção que deve ser usada. Dois exemplos são:

1. Combinar canais: use isso para mesclar dois ou mais canais de imagem.
   NOTA: Por exemplo, dois canais de fluorescência podem ser calculados em média.
2. Redimensionar imagens: use isso para reduzir o tamanho de conjuntos de dados de imagem muito grandes.
   NOTA: Isso pode acelerar significativamente o tempo de processamento e, em muitos casos, tem pouco ou nenhum impacto na qualidade da segmentação.

12. Solução de problemas

1. Se o Cell-ACDC falhar, crie um relatório de bug na página do GitHub do Cell-ACDC navegando até a guia Problemas e clicando no botão verde Novo problema . Siga o modelo fornecido para incluir todos os detalhes relevantes necessários para diagnosticar e resolver o problema. Alternativamente, sinta-se à vontade para procurar ajuda no fórum image.sc usando a tag #cell-acdc ou entrar em contato com um dos autores correspondentes. Em muitos casos, especialmente após a instalação de um pacote, simplesmente reiniciar o software pode resolver o problema.
2. Se o Cell-ACDC congelar ou parar de responder, verifique se há atualizações de progresso no console. Longos tempos de segmentação, especialmente ao usar modelos computacionalmente intensivos, como o Cellpose versão 4, ou processar grandes conjuntos de dados, são normais. Se o Cell-ACDC não responder, consulte a etapa 12.1 para obter mais instruções.
3. Se a segmentação automática incluir incorretamente o plano de fundo, verifique se uma etapa de pré-processamento pode ter suavizado excessivamente o plano de fundo. Muitos modelos de segmentação são treinados em imagens brutas (não pré-processadas) e podem ter um desempenho ruim quando o plano de fundo não tem textura suficiente.

Results

Quantificação do volume nuclear em esferoides tumorais em 3D

A microscopia 3D automatizada (z-stacks) permite que os cientistas visualizem sistemas multicelulares complexos, como organoides. Para quantificar as propriedades morfológicas e do sinal de fluorescência no nível de célula única, a segmentação celular em 3D é frequentemente necessária. O exemplo a seguir demonstra como o Cell-ACDC pode segmentar os núcleos em organoides contendo milhares de células do canal de coloração nuclear e quantificar seu volume (dados da ^Ref.9). A segmentação foi realizada usando um modelo Cellpose personalizado que foi treinado e publicado na ^Ref.9. O modelo Cellpose treinado pode ser usado diretamente no Cell-ACDC, fornecendo o caminho do arquivo de pesos na GUI ao selecionar os parâmetros do modelo para o Cellpose v2. A segmentação foi realizada usando o segundo módulo do Cell-ACDC para processar em lote todas as imagens (Figura 1A, módulo "Segmentar e rastrear"). Em seguida, o resultado foi visualizado na GUI do terceiro módulo (Figura 1A, módulo "Visualizar e corrigir"). Este módulo foi otimizado para visualizar milhares de objetos únicos com várias opções de anotação (por exemplo, contornos, máscaras de segmentação sobrepostas ou IDs de texto). Depois que as medições das máscaras 3D foram calculadas, todas as medições disponíveis foram documentadas diretamente na GUI. Eles podem ser acessados acessando a barra de menu superior (Figura 6, "Barra de menus"), selecionando o menu Medidas e, em seguida, Definir medidas.... A caixa de diálogo pop-up permite que os usuários obtenham informações específicas da medição nos botões de informações e selecionem quais medições salvar. Para os resultados representativos da Figura 10, foi utilizado "cell_vol_fl_3D", que é o volume de cada objeto calculado multiplicando-se o total de voxels no objeto pelo tamanho do pixel ao quadrado e pela profundidade do voxel. Essas propriedades são extraídas automaticamente do arquivo raw de microscopia ou fornecidas pelo usuário. O cálculo das medições desta GUI requer o carregamento das imagens brutas. Assim, para agilizar o processo e habilitar o processamento em lote, as medições também podem ser calculadas no menu Utilitários (Figura 1B, "Utilitários"), acessando o submenu Medições e, em seguida, Calcular medições para um ou mais experimentos. Finalmente, a distribuição do volume nuclear foi plotada como um resultado representativo (Figura 10). Esta análise revela uma fração significativa de pequenos núcleos, provavelmente devido a artefatos de segmentação. Eles podem ser facilmente removidos filtrando pequenos objetos da máscara de segmentação. Ao mesmo tempo, os núcleos muito grandes podem ser devidos a núcleos fundidos durante a segmentação. É sempre recomendável traçar a distribuição de volume de objetos (por exemplo, células individuais) para identificar artefatos e extrair informações biológicas adicionais sobre o tamanho da célula.

Quantificação dos dados de microscopia de lapso de tempo

Com a microscopia de lapso de tempo, a dinâmica celular pode ser observada diretamente no nível de uma única célula. Além da segmentação celular, a extração da dinâmica temporal requer análises adicionais, incluindo rastreamento celular e anotação de linhagem celular. Devido à interdependência desses estágios de análise, os erros introduzidos no início do pipeline podem se propagar para etapas posteriores. Como resultado, são necessárias a visualização e correção contínuas de erros de segmentação, rastreamento e anotação. O seguinte demonstra que o Cell-ACDC é adequado para lidar com essas tarefas. Dois conjuntos de dados de dois organismos modelo diferentes foram selecionados: 1) levedura em brotamento (cepa DCY001-1 da ^Ref.35, onde as duas proteínas histonas H2B, Htb1 e Htb2, são marcadas com mCitrine) e 2) células-tronco embrionárias de camundongo (mESCs, dados da ^Ref.22).

Esses dois conjuntos de dados destacam dois modos de anotação disponíveis no Cell-ACDC: divisão celular assimétrica e simétrica (ou seja, citocinese simétrica ou "normal"). Como o modo de divisão é diferente, os dois organismos requerem uma estrutura de rastreamento e anotação diferente.

Na divisão assimétrica, a célula-mãe forma um botão que cresce e eventualmente se separa para se tornar uma célula-filha. Após a divisão, a célula-mãe mantém seu ID de célula original e seu número de geração aumenta em um, enquanto a célula-filha recebe um novo ID de célula e seu número de geração é definido como um. A fase de brotamento corresponde às fases S/G2/M do ciclo celular e é anotada como tal no Cell-ACDC. Essas opções de anotação ajudam a abordar questões biológicas típicas relacionadas ao ciclo celular em leveduras em brotamento.

No caso de divisão "simétrica" (por exemplo, células de mamíferos), a célula-mãe se divide em duas células-filhas. A célula-mãe, ou seja, seu ID, desaparece após a divisão, e as duas células-filhas recebem novos IDs. Além disso, o número de geração das células-filhas é aumentado em um em relação à célula-mãe. O Cell-ACDC também rastreia o ID pai, o ID raiz (a célula ancestral original no início de uma linhagem) e o ID irmão.

Para ambos os modos de anotação, foi desenvolvido um framework inovador para corrigir erros de anotação, onde a correção é propagada automaticamente para todos os pontos de tempo relevantes passados e futuros. A visualização, anotação e correção foram realizadas na GUI do terceiro módulo (Figura 1A, módulo "Visualizar e corrigir" e Figura 6). Para segmentar e rastrear as células no conjunto de dados 1, o modelo YeaZ_v2²⁶ foi aplicado ao canal de contraste de fase, enquanto para o canal nuclear (histona), foi utilizado o modelo StarDist²⁵ . Em seguida, usando o utilitário Rastreamento e linhagem > Rastrear e/ou contar objetos subcelulares (Figura 1B, barra de menu Utilitários ), o Cell-ACDC atribuiu a cada núcleo o ID da célula correspondente, garantindo a consistência entre as tabelas geradas a partir das máscaras de célula e núcleo.

Para o conjunto de dados 2, foi utilizado o modelo de segmentação DeepSea²² . Todos os três modelos já estão disponíveis no Cell-ACDC, apresentando a vantagem de integrar vários modelos de segmentação ao software.

Uma vez que os erros de segmentação e rastreamento foram corrigidos, os pedigrees das células foram anotados, as características numéricas foram calculadas e a análise a jusante foi realizada. Para o conjunto de dados 1, a coluna TaYFP_amount_autoBkgr e o número de núcleos segmentados (Figura 11A) foram plotados em relação ao tempo. "TaYFP" é o nome do canal nuclear. "amount_autoBkgr" é um proxy para a quantidade total de proteína celular extraída de imagens de epifluorescência³⁶. É calculado como a diferença entre a intensidade média de fluorescência em cada máscara celular e a mediana de fundo, multiplicada pela área da célula (em pixels). Aqui, a mediana do plano de fundo é calculada a partir de todos os pixels que não são segmentados como células. Como esperado, a quantidade de H2B começa a aumentar na emergência dos botões (Figura 11A-ii) e atinge um valor constante antes da divisão nuclear (Figura 11A-iii). Este é um importante controle de qualidade na homeostase das proteínas histonas, pois espera-se que a quantidade de proteínas histonas seja dependente do ciclo celular. Além disso, traçar o número de núcleos ao longo do tempo confirma que as quantidades de proteínas histonas atingem o máximo aproximadamente em torno da divisão nuclear.

Para o conjunto de dados 2, a área celular ao longo do tempo para uma célula selecionada em divisão celular foi plotada. Como esperado, a área celular aumenta até atingir um valor máximo (Figura 11B-i). Em seguida, diminui até a divisão celular (Figura 11B-ii) à medida que a célula se contrai. Finalmente, o ciclo é reiniciado para as duas células-filhas. Esta é outra análise recomendada, pois a verificação das mudanças no tamanho das células ao longo do ciclo celular é essencial para confirmar que as células estão crescendo e se dividindo conforme o esperado (ou não no caso de mutantes específicos).

Figura 1: Módulos Cell-ACDC. (A) Visão geral dos 4 módulos principais que podem ser lançados a partir do lançador principal Cell-ACDC. Depois de segmentar, rastrear e anotar os dados de microscopia, os recursos numéricos podem ser calculados a partir do terceiro módulo ("Visualizar e corrigir") ou de (B) o menu Utilitários na barra de menu superior. Os "Utilitários" são as rotinas que podem ser executadas automaticamente em vários conjuntos de dados sem a entrada do usuário. Além de calcular as medições, outros utilitários incluem a concatenação de várias tabelas de saída em uma única tabela, rastreamento de objetos subcelulares e pré-processamento de imagens. O Cell-ACDC suporta dados 2D, 3D (z-stack ou time-lapse) e 4D (z-stacks ao longo do tempo), com qualquer número de canais adicionais. A tabela de saída com os recursos numéricos pode então ser usada para análise downstream e descoberta biológica (Figura 10 e Figura 11). Para isso, estão disponíveis blocos de anotações Jupyter na página do GitHub do Cell-ACDC, que incluem exemplos de gráficos que podem ser obtidos na tabela de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxograma de decisão Cell-ACDC. Um fluxograma descrevendo o módulo a ser usado, dependendo do tipo de conjunto de dados e dos requisitos de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Baixe dados de exemplo. (a) Abra o Guia de boas-vindas. (B) Baixe os dados de exemplo necessários para replicar o protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Carregar dados para preparação de dados. (A) Carregue os dados na GUI de preparação de dados. (B) Selecione o canal a ser carregado. (C) Edite e confirme os metadados da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Execute o processo de preparação de dados. (A) Inicie o processo. (B) ROIs de posição (para corte) e ROIs de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: GUI do terceiro módulo para visualizar e corrigir resultados. Captura de tela da GUI do terceiro módulo ("Visualizar e corrigir" na Figura 1A) com itens destacados. Observe que a maioria dos botões nas barras de ferramentas tem uma dica de ferramenta (acessível passando o cursor do mouse sobre o botão) explicando como usar essa função específica. O seletor de modo pode ser usado para alternar entre 5 modos: "Visualizador", "Segmentação e rastreamento", "Análise do ciclo celular" (para células que se dividem assimetricamente), "Divisão normal: Árvore de linhagem" (para células que se dividem simetricamente, por exemplo, células de mamíferos) e "Anotações personalizadas". Observe que uma barra de ferramentas ou barra de menus geralmente está presente nas outras GUIs (por exemplo, módulo "Pré-processamento de dados", Figura 1). A barra de ferramentas Editar contém todas as funções que podem ser usadas para editar e corrigir erros de segmentação e rastreamento (por exemplo, pincel, borracha, ID de edição, etc.). A imagem carregada é exibida em uma visualização de dois painéis, o que é útil quando diferentes opções de anotação são necessárias (por exemplo, informações do ciclo celular na imagem à esquerda e IDs na imagem à direita). A imagem à direita também pode ser desativada (clique com o botão direito do mouse na imagem e desmarque Mostrar imagem espelhada). Cada painel de imagem inclui um controle deslizante LUT na lateral para ajustar rapidamente os níveis de intensidade. Ao clicar com o botão direito do mouse no controle LUT, o usuário pode selecionar diferentes mapas de cores para as imagens de intensidade. Além disso, no lado direito, há um seletor LUT para a cor dos rótulos de segmentação a serem sobrepostos nas imagens de intensidade (opção de anotação chamada Segm. máscaras). No lado esquerdo das opções de anotação da imagem à esquerda, há alternâncias adicionais para controlar algumas configurações, como salvamento automático, tamanho da fonte, etc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Visualize o pré-processamento na GUI principal. (A) Abra a caixa de diálogo de pré-processamento. (B) Diálogo de pré-processamento com parâmetros usados no protocolo inicializado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Visualize a saída de segmentação na GUI principal. (A) Selecione um modelo de segmentação. (B) Configure parâmetros de segmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Estrutura de pastas exigida pelo Cell-ACDC. Para trabalhar com o Cell-ACDC, os dados devem ser organizados em uma estrutura de pastas específica. Embora o Cell-ACDC forneça um módulo para gerar automaticamente essa estrutura, é importante entender como essa estrutura deve ser. Primeiro, todos os arquivos devem estar dentro de uma pasta chamada Imagens. Em seguida, todos eles precisam começar com o mesmo nome, o chamado "basename_". O conjunto mínimo de arquivos necessários é um arquivo TIFF de canal único (2D, 3D z-stack ou 3D+time) e um arquivo CSV que termina com "_metadata.csv". Esse arquivo deve ser uma tabela com duas colunas, a primeira coluna chamada Descrição e a segunda coluna chamada valores, e deve conter pelo menos entradas para SizeT e SizeZ para o número de quadros e z-slices, respectivamente. Se um arquivo de imagem não tiver z-slices, SizeZ deverá ser definido como 1. O mesmo vale para imagens sem lapso de tempo, em que SizeT deve ser 1. Sendo um arquivo CSV, uma entrada é uma única linha de Descrição,valor, separada por uma vírgula, por exemplo, SizeZ,1. Para vários canais, um arquivo TIFF por canal deve ser gerado. A pasta Imagens deve então ser colocada dentro de uma pasta chamada "Position_1". Várias posições são permitidas e precisam ser nomeadas com um número consecutivo. Ao carregar dados em qualquer um dos módulos Cell-ACDC, o usuário pode selecionar uma pasta Position específica ou toda a pasta do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Quantificação 3D de organoides tumorais. Captura de tela de um organoide tumoral representativo (dados de⁹) carregado na GUI do terceiro módulo do Cell-ACDC (à esquerda), exemplo de z-slices com contornos vermelhos destacando as máscaras de segmentação (centro) e histograma da distribuição de volume celular calculada a partir das máscaras de segmentação 3D (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Quantificação de dados de microscopia de lapso de tempo. (A) Captura de tela dos dados de microscopia de lapso de tempo de células de levedura carregadas na GUI do terceiro módulo do Cell-ACDC (à esquerda) e quantificação da quantidade de proteína H2B da histona ao longo do tempo em um ciclo celular representativo (à direita). As imagens ampliadas mostram a célula de exemplo e seu botão (setas brancas) no início do ciclo celular (i), na emergência do botão (ii) e na divisão nuclear (iii). Os dados são retirados de Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Captura de tela de dados de microscopia de lapso de tempo de células-tronco embrionárias de camundongos carregadas na GUI do terceiro módulo do Cell-ACDC (esquerda) e área celular (μm²) plotada em função do tempo de uma célula representativa em divisão celular. As imagens ampliadas mostram a célula de exemplo e suas filhas na área máxima da célula antes da divisão (i), divisão em duas células-filhas (ii) e o último quadro analisado após a divisão (iii). Os dados são de Zargari et ^al.22,33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A análise de dados de microscopia multidimensional geralmente requer o uso de modelos de ponta orientados por IA. No entanto, essas ferramentas são desenvolvidas rapidamente e têm uma barreira de entrada significativa para adoção. Além disso, os biólogos geralmente precisam visualizar o resultado para uma correção eficaz de erros. Aqui, é demonstrado como os cientistas podem usar o Cell-ACDC para enfrentar esses desafios.

Uma etapa crítica do protocolo apresentado é selecionar o modelo de segmentação ideal. O Cell-ACDC inclui uma GUI que permite a seleção visual (Figura 1A, módulo "Visualizar e corrigir"). Ferramentas para preparar dados e processamento em lote de vários conjuntos de dados também são fornecidas (Figura 1A, Criar estrutura de dados, Pré-processamento de dados, módulos Segmentar e Rastrear e Utilitários). Os usuários são incentivados a relatar problemas e fornecer feedback no fórum image.sc (usando a tag #cell-acdc) ou abrindo um problema na página do GitHub do Cell-ACDC.

Embora o Cell-ACDC já tenha sido usado em dados relativamente grandes, como esferóides em imagens com milhares de núcleos⁹, ou dados de lapso de tempo de leveduras em brotamento com centenas de células por quadro, o programa deve carregar todos os dados de canal único na RAM para funcionar corretamente. Recomenda-se aproximadamente três vezes o tamanho do arquivo de imagem na memória disponível para garantir um desempenho estável. No momento, os conjuntos de dados que excedem a memória disponível do sistema não podem ser processados, mas o suporte para carregamento fora do núcleo (lento) está planejado por meio da integração do OME-Zarr³⁷.

Atualmente, uma das principais limitações do Cell-ACDC é o suporte parcial para conjuntos de dados 3D+tempo, já que a maioria das ferramentas foi desenvolvida para dados 3D z-stack ou 2D+time. Portanto, as versões futuras do Cell-ACDC estenderão seus recursos com suporte total para dados 3D+time. Além disso, estamos trabalhando para estender a estrutura de anotação do pedigree celular para células que se dividem "simetricamente" (por exemplo, células de mamíferos), que são aquelas células em que a célula-mãe se divide em duas células-filhas (em oposição à levedura em brotamento, onde a célula-mãe, uma vez por ciclo celular, dá origem a uma única célula-filha por meio de brotamento). Finalmente, a partir de agora, o Cell-ACDC está limitado a dados cujos dados de canal único se encaixam inteiramente na RAM. Portanto, planejamos implementar o carregamento lento conforme mencionado acima.

Desde o seu lançamento, o Cell-ACDC tem sido constantemente aprimorado, por exemplo, adicionando novos modelos de segmentação e rastreamento, novas estruturas de anotação (por exemplo, para células de mamíferos, atualmente em teste beta) e várias melhorias de desempenho. Graças a esses desenvolvimentos, os cientistas puderam empregar o Cell-ACDC para acelerar a pesquisa e permitir a descoberta científica 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. O que torna esta estrutura de software única em comparação com os métodos existentes 14,27,50,51 é sua capacidade de alavancar e complementar os modelos existentes, beneficiando-se, portanto, dos desenvolvimentos da comunidade. O desenvolvimento contínuo do Cell-ACDC é mantido ativamente para estabelecê-lo como uma estrutura de referência para a análise de dados de microscopia multidimensional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEBÊ	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	Software de segmentação e rastreamento, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Rastreador bayesiano	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	Softwares de rastreamento, opcionais, podem ser instalados automaticamente com o Cell-ACDC
Cell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Software
Núcleos da linha germinativa do cellpose	Cristina Piñ eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGY.001062	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Cellpose versão 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Cellpose versão 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Cellpose versão 4 (Cellpose-SAM)	Marius  Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Computador	-	-	Veja as especificações recomendadas abaixo
Computador - CPU	Qualquer	-	Mínimo recomendado de 4 núcleos, 2,5Ghz
Computador - GPU	Nvidia (preferido)	-	(Opcional) Mínimo recomendado de 8GB de VRAM
Computador - Espaço no disco rígido	Qualquer	-	4GB + 3 x tamanho do arquivo de microscopia
Computador - Sistema Operacional	Microsoft, Apple, outros	-	Windows, MacOS e Linux são suportados
Computador - RAM	Qualquer	-	3 x tamanho de arquivo de uma única posição, mínimo 16GB
DeepSea	Abolfazl  Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Software de segmentação e rastreamento, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
DeLTA & nbsp;	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Software de segmentação e rastreamento, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Link para baixar o instalador no site da Miniforge: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
SAM (Modelo de Segmento de Qualquer Coisa)	Alexander Kirillov	10.48550/arXiv.2304.02643	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
ANTA	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	Softwares de rastreamento, opcionais, podem ser instalados automaticamente com o Cell-ACDC
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Softwares de rastreamento, opcionais, podem ser instalados automaticamente com o Cell-ACDC
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	Softwares de rastreamento, opcionais, podem ser instalados automaticamente com o Cell-ACDC
YeastMate	David Bunk	10.1093/bioinformática/btac107	O software de segmentação, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC
YeaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	Software de segmentação e rastreamento, opcional, pode ser instalado automaticamente com o Cell-ACDC