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Dinâmica de locomoção dependente da idade em Caenorhabditis elegans: uma análise do expoente de Lyapunov

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DOI:

10.3791/68955

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23 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

Neste artigo

Resumo

Este estudo examina o efeito da idade na locomoção em C. elegans medindo o maior expoente de Lyapunov (LLE). À medida que envelhecem, C. elegans mostram um aumento e subsequente declínio no controle motor. Os resultados mostram um pico de LLE em cinco dias, seguido por um declínio à medida que os vermes envelhecem.

Resumo

Este estudo investiga a influência da idade na mobilidade de Caenorhabditis elegans (C. elegans) empregando Difração Óptica Dinâmica (DOD) para estimar o Maior Expoente de Lyapunov (LLE). O LLE, uma métrica chave em sistemas dinâmicos, quantifica a taxa de divergência ou convergência de trajetórias no espaço de fase, indicando a previsibilidade e o caos na dinâmica do sistema, neste caso, os comportamentos locomotores do verme. A luz laser de 632 nm difrata o verme nadador em uma coluna d'água, formando um padrão de difração. Um fotodiodo detecta a luz em um único ponto dentro do padrão de difração, capturando uma série temporal unidimensional à medida que o verme ondula. Esta série temporal serve como uma representação composta de todo o movimento do verme, encapsulando sua dinâmica de locomoção, uma vez que um ponto no padrão de difração é uma superposição de todos os pontos do verme. A série temporal é então incorporada em um espaço de fase de dimensão superior para calcular o LLE. C. elegans normalmente vivem por cerca de 14 dias, seguindo um padrão de aumento e declínio do controle motor com a idade. Para isolar os efeitos específicos da idade, os vermes foram transferidos para placas de ágar fresco contendo E. coli a cada dois dias, garantindo que fossem envelhecidos adequadamente (3 a 12 dias de idade). A análise de uma coorte de 13 C. elegans revelou que o LLE atingiu o pico cinco dias após a eclosão, a uma taxa de 1,34 ± 0,03 1 / s. Este pico significa um ponto crítico no desenvolvimento em que a locomoção dos vermes exibe a maior complexidade e comportamento caótico. Os valores de LLE observados se alinham com a equação de Moore, um modelo bem estabelecido que descreve mudanças relacionadas à idade na atividade voluntária, ligando a diminuição do controle motor e dos níveis de atividade com o aumento da idade em C. elegans.

Introdução

A locomoção de Caenorhabditis elegans (C. elegans), um verme microscópico, tem sido estudada para aprofundar a compreensão da fiação dos neurônios motores, pois esse nematóide é neurologicamente simples, com apenas 302 neurônios1. C. elegans é um organismo modelo que é facilmente mantido com uma vida útil de apenas 14 dias2. Apenas cerca de 72 neurônios de 302 em C. elegans são usados para locomoção e estão localizados em todo o corpo adulto do nematóide1. O movimento de baixa dimensão (ou seja, de um lado para o outro, para frente e para trás)3 de C. elegans os torna um espécime fácil de rastrear intervalos em LLE. O sistema nervoso dos nematóides é compreendido em uma extensão incrível4.

A análise de vídeo ajudou a quantificar a locomoção de C. elegans medindo quantidades como raio de curvatura, frequências de ondulação e comprimento de onda5. Essas medidas estabeleceram variáveis de controle que permitem a comparação das propriedades locomotoras em diferentes ambientes e sob várias condições 6,7. Essas informações formam um modelo em evolução do circuito que impulsiona a locomoção de C. elegans8 e até permite a criação de simulações dinâmicas virtuais e físicas de vermes9.

A Difração Óptica Dinâmica (DOD)10 também tem sido usada para quantificar a locomoção de C. elegans. Durante o DOD, a luz do laser de baixa intensidade se curva ao redor do verme vivo, formando um padrão de difração de campo distante conhecido como padrão de difração de Fraunhofer. A distribuição de intensidade no padrão vivo muda à medida que o nematóide se move. Um ponto na difração é uma superposição de todos os pontos no verme, de modo que a intensidade dependente do tempo no padrão de difração forma uma série temporal unidimensional contendo informações sobre a dinâmica locomotora11. Nós nos concentramos no Maior Expoente de Lyapunov (LLE) dependente da idade da locomoção que calculamos a partir da série temporal unidimensional experimental. O LLE em diferentes estágios de desenvolvimento é comparável a outros estudos relacionados à idade, mostrando que os circuitos neurais se manifestam em padrões locomotores que podem ser medidos usando várias ferramentas, como análise de vídeo ou DOD5.

O DOD fornece uma série temporal sensível em várias escalas, uma vez que o padrão de interferência pode resolver a locomoção em uma fração do comprimento de onda usado, ao mesmo tempo em que leva em conta mudanças em grande escala na plasticidade (forma) da espécie. Esse recurso é particularmente útil quando um sistema é sensível às condições iniciais, como em sistemas caóticos em que pequenas mudanças levam a mudanças exponenciais na trajetória, também conhecidas como efeito borboleta12. Por esse motivo, é crucial capturar as séries temporais a uma taxa que permita o registro de pequenas mudanças, pois essas mudanças podem resultar em mudanças significativas à medida que o sistema evolui. Um fotodiodo (PD) pode capturar a série temporal mais rapidamente do que muitas câmeras caras de alta velocidade. A combinação da sensibilidade espacial no padrão de difração e uma alta taxa de acúmulo de dados pode capturar a essência de um sistema caótico13,14.

O LLE descreve a divergência exponencial das trajetórias do espaço de fase. O espaço de fase contém todos os estados possíveis de um sistema, descritos por suas variáveis de estado (ou coordenadas) e suas derivadas associadas (ou momentos)15. Diferentes trajetórias descrevem a evolução do sistema para diferentes condições iniciais. Em um sistema caótico, duas trajetórias próximas divergem exponencialmente ao longo do tempo, e essa divergência é quantificada por um LLE positivo. Em sistemas físicos, essa divergência se manifesta como a propagação da incerteza nas condições iniciais do sistema e também como a incapacidade de prever com segurança o estado do sistema após algum tempo, conforme dado pelo LLE14.

Em sistemas experimentais, as variáveis de estado são frequentemente desconhecidas; no entanto, a topologia do espaço de fase pode ser reconstruída a partir de apenas uma variável medida usando o teorema16 de incorporação de Takens, construindo suas versões com atraso de tempo (equivalentes a derivadas de tempo). Cada versão com atraso de tempo é representada em um eixo; Juntos, os atrasos de tempo formam um gráfico de defasagem, que é topologicamente idêntico a um gráfico de fase se a série temporal for infinitamente longa. As séries temporais experimentais são limitadas em comprimento e, portanto, só podem renderizar LLEs estimadas que são limitadas por incertezas experimentais.

A locomoção de C. elegans carrega um LLE10 positivo, um indicador de caos. Um organismo jovem sofre alterações locomotoras aos17 anos. Um LLE maior indica uma menor previsibilidade em comparação com um LLE menor. O LLE fornece um método confiável para quantificar os padrões locomotores de um organismo 10,13,14. As características locomotoras dos nematóides estão relacionadas aos neurônios dentro dos nematóides18. De acordo com Cohen et al.19, a locomoção do nematoide é dependente dos neurônios motores, sugerindo que o estudo da complexidade na locomoção do nematoide também está relacionado ao seu circuito neuronal.

Calibramos o LLE com base na idade para minimizar incertezas para estudos futuros. Estudos anteriores calcularam a média do LLE em nematóides de três a seis dias de idade13. Este estudo monitorou cuidadosamente as idades dos nematóides para facilitar uma análise rigorosa dos declínios associados ao envelhecimento. Além disso, alterações na locomoção foram investigadas para identificar outras alterações biológicas em C. elegans18. A equação de Moore rastreia parâmetros de idade relacionados à locomoção20. Aqui, usamos uma versão modificada da equação de Moore que permite flexibilidade em quando o mecanismo locomotor está no local para ser avaliado, introduzido como um marcador temporal T:

figure-introduction-1, (1)

onde P(t) representa desempenho, t é tempo, a e c representam parâmetros de escala, enquanto b e d são os tempos característicos do crescimento exponencial e declínio, respectivamente. A equação de Moore demonstrou prever as trajetórias de quantidades aparentemente não relacionadas, como velocidade e atividade voluntária, à medida que os organismos envelhecem. As espécies podem ser caracterizadas pela forma da curva conforme especificado pela equação de Moore; ou seja, algumas espécies podem atingir o pico mais cedo do que outras21.

Protocolo

1. Preparação de C. elegans para aquisição de dados

  1. Coloque 0,5 mL de E. coli com OD600 em cada placa de ágar Nematode Growth Medium (NGM) para os nematóides comerem. Espere a E. coli secar em cada prato de ágar.
  2. Adquira uma placa de controle de C. elegans de qualquer fornecedor de materiais biológicos para fazer novas placas de C. elegans para fins de controle de idade.
  3. Esterilize um palito de platina usando uma chama de um bico de Bunsen ou equivalente. Use um microscópio de dissecação para escolher de 5 a 10 C. elegans adultos do tipo selvagem para colocar em cada placa.
  4. Deixe os nematóides botarem ovos por 4-5 h antes de colher os adultos do prato. Incube os nematóides restantes e deixe-os colhê-los no dia desejado.
  5. No dia da coleta de dados, encha uma cubeta de quartzo de grau óptico de 4,5 mL com dimensões de 10 mm x 10 mm x 45 mm com água destilada em temperatura ambiente logo abaixo do topo da cubeta para evitar qualquer derramamento quando uma tampa de plástico for adicionada. Escolha 2-3 nematóides e coloque-os delicadamente na cubeta. Assim que os nematóides estiverem na cubeta, coloque-a de lado para alinhar facilmente o verme no feixe de laser. O C. elegans pode flutuar em direção ao fundo, mas continuará com ondulações nadadoras, desde que esteja totalmente imerso na água5.

2. Coleta de dados

NOTA: O procedimento abaixo para registrar as séries temporais deve ser implementado na mesma hora todos os dias para minimizar as incertezas na idade.

  1. Configure o experimento descrito no artigoanterior 22. Implemente uma pequena modificação na construção de um periscópio com dois espelhos e coloque a cubeta de lado entre os dois espelhos para facilitar a centralização do verme no feixe de laser posteriormente. Em vez da câmera, coloque um PD no padrão de difração (Figura 1).
    1. Alinhe os espelhos verticalmente para construir o periscópio mencionado acima.
      NOTA: Este é o único trabalho de alinhamento a laser que precisa ser concluído.
  2. Ligue o laser HeNe (Helium Neon) e deixe-o aquecer para atingir o equilíbrio térmico (~15 min).
  3. Inicie o osciloscópio digital para iniciar a coleta de dados. Defina os parâmetros do intervalo de tempo e buffer de memória no osciloscópio digital. Defina o intervalo de tempo como 100 s e implemente um buffer de memória de pelo menos 100 kilosamples por segundo (kS).
  4. Defina a resolução para 1 kHz para a taxa de aquisição de dados e 12 bits para resolver as amplitudes, o que ajuda a distinguir a complexidade em pequenas escalas23.
  5. Defina o osciloscópio para centralizar as oscilações de intensidade usando o deslocamento CA automático para centralizar a série temporal em zero volts.
  6. Escolha 2-3 nematóides e coloque delicadamente em uma cubeta cheia de água destilada para que seja mais fácil encontrar e centralizar pelo menos 1 verme no feixe de laser. Não agite a cubeta.
  7. Coloque a cubeta contendo 2-3 nematóides no periscópio e centralize 1 nematóide no feixe de laser.
    1. Quando o C. elegans está centrado no feixe de laser, um padrão de difração de campo distante se formará a cerca de 50 cm do periscópio.
  8. Coloque o fotodiodo no padrão de difração de campo distante quando um C. elegans atravessar o feixe de laser. Certifique-se de que o PD esteja posicionado fora do centro no padrão de difração para capturar a luz difratada em vez do máximo central (feixe de laser transmitido).
  9. Colete pelo menos 10 s de dados para calcular o LLE de forma confiável; ou seja, pelo menos 10.000 pontos de dados são necessários para calcular um LLE estável.
    NOTA: Menos pontos de dados resultam em um LLE que flutua artificialmente.
  10. Repita a coleta de dados acima para cada dia 9 a 15 vezes. Colete dados para idades de 3 a 12 dias na mesma hora do dia.

3. Análise dos dados

NOTA: Para a análise dos dados, a série temporal é incorporada no espaço de fase usando um gráfico de defasagem16 e, em seguida, estima o LLE calculando a divergência das trajetórias.

  1. Escolha seções na série temporal em que o nematóide nada livremente dentro do feixe de laser, examinando cuidadosamente a série temporal. A Figura 2A mostra uma série temporal viável com um sinal contínuo de pelo menos 20 s.
  2. Filtre a série temporal para uma baixa relação sinal-ruído (Figura 2B). Estabeleça o nível de ruído gravando uma série temporal sem o verme na cubeta. Os recursos da série temporal, não apenas a amplitude, devem ser mais do que o dobro do nível de ruído.
  3. Exclua quaisquer dados saturados da série temporal relevante (Figura 2C). Se houver muitos dados saturados para extrair informações úteis, retorne à seção Coleta de dados acima, repita as etapas 2.7.1 a 2.9 e ajuste o nível de intensidade movendo o fotodiodo para longe do máximo central.
  4. Determine a frequência média dada por
    figure-protocol-1(2)
    onde f é a frequência e P é o espectro de potência (Figura 3). Isso pode ser feito computacionalmente usando uma Transformada Rápida de Fourier (FFT) e, em seguida, calculando a média das frequências. Muitos programas computacionais têm uma função integrada para calcular a frequência média de um conjunto de dados.
  5. Reconstrua a topologia do espaço de fase usando um método de atraso de tempo. Escolha uma série temporal X e atrase a série temporal por um atraso temporal τ para resolver as trajetórias (Figura 4). O atraso de tempo ideal é determinado pela identificação do primeiro mínimo local na informação mútua (IM)24:
    figure-protocol-2(3)
    onde N é o número de pontos, Xi é um ponto na série temporal X, enquanto Xi + τ é um ponto com atraso de tempo na mesma série temporal. p(Xi) é a probabilidade de o ponto Xi ocorrer, e p(Xi+τ) é a probabilidade de Xi+τ ocorrer. p(Xi, Xi+τ) é a probabilidade conjunta25 da série temporal Xi e da série temporal defasada Xi+τ coincidindo.
  6. Identifique o primeiro mínimo no gráfico MI entre 0,140 e 0,240 s (140 e 240 pontos de dados), conforme mostrado na Figura 5. Não há um número exato para o atraso; O objetivo principal é resolver as trajetórias de fase o suficiente para determinar a divergência.
  7. Use a série temporal Xi e suas versões defasadas por τ, conforme determinado pela minimização do IM na etapa anterior.
  8. Determine a dimensão de incorporação. A dimensão de incorporação mais adequada é a dimensão mais baixa para a qual os falsos vizinhos mais próximos (FNN) se estabilizam no mínimo (Figura 6)26. Utilize o método desenvolvido por Abarbanel et al.27,28.
  9. Use o algoritmo de Rosenstein29 para reconstruir o sistema dinâmico em um espaço de fase e rastrear a divergência de trajetórias próximas ao longo do tempo. Em particular, utilize a rotina MATLAB de Merve Kizilkaya, conforme postado no fórum MATLAB30, para calcular o LLE. Essa rotina requer a seguinte entrada: a série temporal, a frequência média do atrator, o intervalo de tempo τ, a taxa de aquisição de dados para a série temporal e o intervalo para ajustar a divergência.
  10. Repita o procedimento acima para 9 a 15 conjuntos de dados para reduzir a incerteza das estimativas de LLE. Calcule a média dos LLEs para cada dia e, em seguida, ajuste a curva de Moore (Figura 7).

Resultados

Ao medir o LLE versus idade, também medimos outras quantidades frequentemente associadas a sistemas dinâmicos complexos, como a frequência do atrator, IM e FNN. Coletamos dados do estudo de idade dos dias 3 a 12. Os vermes são muito pequenos e imaturos antes dos 3 dias de idade para serem manuseados manualmente. Aos 12 dias, os vermes envelhecem e mal se movem, pois seus circuitos neuronais se deterioram e seu sistema nervoso diminui31.

O algoritmo de Rosenstein seleciona um ponto vizinho em um intervalo de pelo menos um período médio para cada ponto na trajetória incorporada. Começando com o vetor de separação entre os dois pontos nas duas trajetórias vizinhas (Figura 8), o algoritmo rastreia a evolução da divergência. A separação das trajetórias aumenta inicialmente exponencialmente devido à natureza caótica do sistema32, e depois se estabiliza desde que a trajetória é delimitada. Traçar o logaritmo da divergência média ao longo do tempo rastreia a separação das trajetórias (Figura 8 e Figura 9). A inclinação dos mínimos quadrados lineares ajustados à primeira parte da curva antes de se achatar resulta em uma estimativa confiável para o LLE33 do sistema. Observe que a incerteza está envolvida na escolha do intervalo para o ajuste de mínimos quadrados e o ajuste em si. A sensibilidade às condições iniciais faz com que a região de ajuste linear exiba um comportamento oscilatório à medida que a divergência é rastreada no atrator. A variação biológica entre os vermes, que foram calculadas em média para cada faixa etária, supera a variabilidade no ajuste linear do LLE para um único ensaio, conforme mostrado em publicação anterior10.

A série temporal (Figura 2A) mostra que os picos e vales coincidem com os aspectos da locomoção do verme, como mudanças na frequência, forma e orientação da natação. A série temporal é aperiódica; As oscilações na série temporal nunca se repetem, mas permanecem limitadas em intensidade. A frequência é estável enquanto flutua ligeiramente, indicando complexidade e limitação na frequência. A Figura 10 mostra uma tendência de declínio nas frequências de natação à medida que o verme envelhece, que se decompõe no dia 12. A frequência média salta após o dia 12 para a maioria dos vermes. Isso é provavelmente uma indicação de quebra do circuito neural. Em contraste, a defasagem média τ, determinada pelo primeiro mínimo do IM, aumenta à medida que a população envelhece, uma vez que o ciclo se alonga (Figura 11).

No nosso caso, o IM representa a sobreposição estatística entre duas séries temporais defasadas. Se o IM for mínimo, então há sobreposição mínima entre as trajetórias. Teoricamente, trajetórias caóticas nunca se sobrepõem; No entanto, na prática, com dígitos significativos limitados e algum ruído experimental, alguns pontos se sobrepõem dentro de alguma tolerância24. Nosso objetivo é minimizar a possibilidade de sobreposição, minimizando o IM. A diferença entre um IM minimizado e um IM significativamente maior é ilustrada na Figura 4.

A dimensão de incorporação é determinada pelos falsos vizinhos mais próximos (FNNs). O número de FNNs se estabiliza com 5% ou menos FNNs em torno das dimensões de incorporação 3 ou 4. Na Figura 6, a idade dos nematóides não afeta a dimensão de inclusão, exceto no dia 12, quando o verme está quase no fim de sua vida útil.

A trajetória do LLE segue a curva de Moore (Figura 7) com um pico em 5 dias, indicando que a locomoção mais imprevisível (e possivelmente complexa) ocorre quando os C. elegans estão recém-maduros. Na Figura 7, um gráfico de LLEs dos dias 3 a 12 mostra um aumento linear com um pico em 5 dias, seguido por uma diminuição após o dia 5. As barras de erro na Figura 10 representam o desvio padrão da média 4,34 e refletem vários fatores, incluindo a diversidade dentro das espécies biológicas e a estimativa do LLE. A variação entre os vermes tende a superar as incertezas na rotina de adaptação do LLE. A variabilidade entre os dias, como os dias 5 e 7, não se sobrepõe, portanto, os dados são claramente distinguíveis. A tendência dos LLEs com a idade se aproxima de uma equação de Moore de um estudo anterior18, que descreve os efeitos da idade na memória e locomoção em outros organismos vivos.

Os LLEs na Tabela 1 são consistentes, mostrando uma tendência de aumento lento e depois decrescente com a idade. Os valores são consistentes com os resultados publicados anteriormente usando DOD10 e análise de vídeo34,35.

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Figura 1: Configuração experimental de difração de campo distante (não desenhada em escala). Os espelhos de direção formam um periscópio. A cubeta contendo o C. elegans é colocada entre os espelhos de direção. O feixe de laser é difratado pelo verme e viaja em direção ao PD através do segundo espelho de direção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Série temporal de intensidade. A série temporal do DOD mostra flutuações de intensidade à medida que o nematóide se move no feixe de laser com (A) uma série temporal viável para análise de dados. (B) Esta série temporal indica que o intervalo entre 11 e 30 s não apresenta sinal; ele apenas exibe o nível de ruído do sistema, já que as amplitudes constantes mais curtas se originam principalmente da luz espalhada. (C) Esta série temporal tem alguns exemplos de dados saturados. Cada ponto de dados representa um pico significativo no gráfico que é cortado e achatado nos picos e vales. Neste exemplo, os picos ficam achatados à medida que a intensidade varia de -100 a 100 UA entre 45 e 50 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Espectro de potência. O espectro de potência mostra um máximo em torno de 0,95 Hz. As frequências estão espalhadas, pois a frequência nas trajetórias do atrator muda e nunca se repete exatamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Dados experimentais incorporados em gráficos de atraso 3D com dois atrasos diferentes da mesma série temporal de um worm de 9 dias. Esta série temporal mostra que a locomoção é um atrator limitado consistente com a teoria do caos. (A) A trajetória é resolvida usando o primeiro mínimo local (MI ≈ 2,11), dando uma defasagem de cerca de 0,183 s (183 pontos de dados). Os cruzamentos de trajetória visíveis são resultado de uma projeção em um espaço bidimensional. (B) Este gráfico de defasagem permanece não resolvido por uma defasagem inadequada de 0,002 s (2 pontos de dados, (MI > 7)), pois os pontos estão muito próximos para serem distinguíveis e não mostram divergência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: A diminuição exponencial da informação mútua. O primeiro mínimo no MI determina o atraso do conjunto de dados em 0,161 s (161 pontos de dados) neste caso específico para resolver a trajetória da fase. Esse atraso muda o valor da série temporal para reconstruir o atrator no espaço de fase. O atraso só precisa estar próximo do primeiro mínimo, o suficiente para resolver as trajetórias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: As dimensões médias de incorporação nos dias 3, 5, 9 e 12, respectivamente. Uma visualização ampliada da dimensão de incorporação é usada para mostrar a diferença específica entre as dimensões de incorporação de cada dia. Apenas o dia 12 apresenta uma diferença notável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: A média dos LLEs estimados entre os dias 3 e 12. O LLE atinge o pico em 5 dias. Por até 5 dias, os nematóides exibem uma trajetória de crescimento consistente com a transição da imaturidade para a maturidade. Após esses 5 dias, os nematóides experimentam um declínio na divergência. As incertezas são medidas do desvio padrão da média, que é dominada por variações entre vermes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Representação da divergência presente na teoria do caos. Um LLE positivo fará com que as trajetórias inicialmente próximas diverjam ao longo do tempo. t é um intervalo de tempo, d é a divergência e x(t) é um ponto no espaço de fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Divergência de trajetória de fase em escala logarítmica. O LLE estimado é a inclinação do ajuste linear (1,08 1 / s) na região ascendente antes de se achatar devido à delimitação do atrator entre 0,96 e 1,01 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: A frequência média média de cada dia. A média do dia 12 denota uma mudança significativa nos sinais neurológicos que impulsionam a locomoção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-11
Figura 11: O atraso médio para cada dia. O IM leva, em média, a atrasos mais baixos entre os dias 3 e 6, enquanto um atraso médio mais alto aparece entre os dias 7 e 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Idade (dias)Número de conjuntos de dadosLLE (1/s)Desvio padrão da média (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tabela 1: O número de conjuntos de dados e LLE médio para cada dia do estudo de idade. Os LLEs são consistentes com dados anteriores coletados por meio do DOD e mostram a trajetória crescente e decrescente da curva de Moore da Figura 7. 9-15 conjuntos de dados foram coletados para cada dia de dados. Os conjuntos de dados diminuíram à medida que os vermes envelheceram devido à natureza de sua degradação muscular e declínio neuronal, causando diminuição da locomoção.

Discussão

Categorizamos a locomoção de C. elegans avaliando o LLE em diferentes idades, apoiado por parâmetros como frequência de natação, informação mútua (MI) e falsos vizinhos mais próximos (FNN) - cada um dos quais oferece informações adicionais sobre as propriedades dinâmicas do sistema. As propriedades determinísticas e não lineares deste sistema são estudadas usando métodos de dados substitutos e gráficos de recorrência36.

O uso do DOD para quantificar os efeitos do envelhecimento na locomoção é uma técnica complementar à microscopia tradicional. Não substitui a inspeção visual das espécies microscópicas; Ele fornece uma maneira consistente e eficiente de quantificar a locomoção além das técnicas tradicionais. Como o DOD ignora a análise de vídeo, uma parte da carga de trabalho computacional é inerentemente gerenciada pela técnica óptica, pois a difração mapeia diretamente a distribuição de intensidade no espaço de Fourier. A superposição do campo óptico durante a difração rastreia toda a espécie microscópica. Idealmente, a resolução é governada pelo comprimento de onda λ da luz usada, neste caso, 632 nm. Mesmo uma mudança de uma fração do comprimento de onda resultará em uma mudança na intensidade. Por esse motivo, a resolução é governada pelo alcance e resolução do fotodetector, bem como pela potência do laser. Por exemplo, se o detector detectar um sinal de série temporal que flutua entre duas tensões, Vmin e Vmax, e a resolução for n bits (consulte a etapa 2.4 do protocolo), a resolução máxima será λ / n ou, no nosso caso, 632 nm / 12. Em teoria, esse método pode ser aplicado a qualquer corpo que mude de forma; no entanto, o DOD é particularmente adequado para espécies microscópicas, pois lasers baratos com os comprimentos de onda apropriados estão prontamente disponíveis e são econômicos.

Para garantir um padrão de difração claro e consistente, o verme deve ser cuidadosamente rastreado e mantido centralizado dentro do feixe de laser enquanto nada. Se o worm sair do alinhamento, o sinal pode se degradar ou ser totalmente perdido. Para mitigar problemas de saturação de fotodiodo e reduzir o ruído estocástico, um filtro de densidade neutra é usado para atenuar a intensidade do laser. Essa filtragem ajuda a manter a faixa dinâmica do fotodiodo e evita a supersaturação nas séries temporais registradas. No entanto, quaisquer segmentos dos dados que apresentem saturação excessiva ou baixas relações sinal-ruído são excluídos da análise final para manter a qualidade dos dados.

Uma deriva na frequência de natação produz um espectro de frequência contínua, um marcador inicial estabelecido de caos13. A relação inversa entre a frequência média e o IM sugere que aproximadamente 1/8 de um ciclo resolve a trajetória com precisão suficiente para estimar o LLE, semelhante à resolução necessária para analisar uma forma de onda senoidal.

A baixa porcentagem de FNNs em torno das dimensões de incorporação 3 e 4 na Figura 6 implica baixos níveis de ruído tanto na locomoção de C. elegans quanto no sistema óptico. No entanto, em vermes de 12 dias, a porcentagem de FNNs aumenta ligeiramente, mas permanece bem abaixo de 5%, não necessariamente devido a um aumento na verdadeira dimensão de incorporação, mas provavelmente devido ao aumento do ruído no sinal locomotor, atribuído à degradação neural em organismos envelhecidos34,37.

Mudanças no LLE ao longo do desenvolvimento mostram que o grau de caos na locomoção varia com a idade, correspondendo às previsões da equação de Moore. Um pico no LLE no início da vida é consistente com as características de espécies selecionadas por R, como C. elegans, que devem desenvolver funcionalidade neuromuscular rapidamente na ausência de cuidado parental. Notavelmente, 70% das conexões neuronais de longo alcance são formadas quando o verme tem apenas 20% de seu tamanho adulto 37,38. Em contraste, as espécies selecionadas por K, como os humanos, exibem um desenvolvimento neurológico mais lento, apoiado pelo investimento dos pais, resultando em padrões motores atrasados, mas mais complexos. Essas diferenças se refletem no momento do pico de LLE entre as espécies.

O curto ciclo de vida de C. elegans, aproximadamente 14 dias, com rápido desenvolvimento durante os dois primeiros dias em quatro estágios larvais2, torna-o particularmente adequado para estudar o pico de complexidade na locomoção. Embora estudos anteriores tenham se concentrado no declínio da estrutura neuronal para explicar as mudanças relacionadas à idade na locomoção34,39, nosso trabalho conecta essas mudanças físicas à dinâmica caótica subjacente do sistema. A integração do DOD com a dinâmica não linear permite a caracterização quantitativa precisa em várias escalas de comprimento, oferecendo novos insights sobre os impulsionadores neuronais do comportamento. O LLE consistentemente positivo em todos os estágios de desenvolvimento apóia fortemente a presença de comportamento caótico no sistema locomotor.

Este estudo oferece uma nova estrutura metodológica para examinar as mudanças comportamentais relacionadas à idade em C. elegans, estendendo assim a compreensão atual dos correlatos biológicos e dinâmicos do declínio motor. Além disso, valida o uso do LLE como um biomarcador sensível para alterações neurológicas associadas à idade e demonstra que o LLE é uma medida quantitativa confiável da dinâmica locomotora afetada pelo envelhecimento.

O DOD é um método poderoso e não invasivo para quantificar a locomoção e o caos em organismos microscópicos, melhor visto como complementar à análise de vídeo do que como um substituto. Em sua implementação atual, o experimento exige que os nematóides tenham pelo menos três dias de idade, uma vez que os vermes mais jovens são pequenos demais para produzir sinais de difração confiáveis. A série temporal unidimensional extraída de um único ponto no padrão de difração necessariamente comprime informações espaciais, o que pode obscurecer a dinâmica localizada ao longo do corpo do organismo. As abordagens multicanal ajudam a resolver essa limitação, verificando a consistência dos parâmetros em todo o campo de difração, embora heterogeneidades espaciais sutis ainda possam ser negligenciadas. A estimativa precisa do LLE depende ainda da obtenção de séries temporais suficientemente longas e sem ruído; desafios práticos, como o movimento do sem-fim para fora do feixe ou flutuações ambientais, podem comprometer a qualidade dos dados e reduzir a confiança nos valores de LLE. Como em todos os métodos experimentais, o ruído de medição e as decisões subjetivas durante o ajuste do LLE introduzem incerteza adicional, que para medições únicas normalmente permanece em cerca de 15%.

Trabalhos futuros se concentrarão na medição do LLE sob várias condições experimentais, permitindo comparações entre LLEs modeladas e medidas. Isso facilitará o desenvolvimento de modelos neurológicos preditivos que podem aprofundar nossa compreensão de como o controle motor complexo surge e se deteriora com o tempo. Também continuaremos a explorar a consistência de nossas descobertas, explorando outros métodos computacionais, como o cálculo do plano de Entropia-Complexidade para verificar novamente a natureza determinística desse sistema biológico40.

Divulgações

O autor não tem nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Vassar College e ao Lucy Maynard Salmon Research Fund pelo apoio financeiro. Também agradecemos à Dra. Kathleen Susman, ao Dr. Juan Merlo e à Dra. Susannah Zhang por fornecerem sua visão e assistência durante todas as etapas desta pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 Espelhos de alumínio de superfície frontalThorlabsPF10-03-F01
Laser HeNe de 632 nmNewportLGX1Qualquer laser de luz vermelha
Placa de Petri vaziaCarolina971632Placas plásticas de Petri nas quais despejamos o ágar de crescimento do nematoide
Escherichia coli K12, hospedeiro vivo e bacteriófagoCarolina124500Usado como fonte de alimento para a C. elegans; OD600
Microscópio Leica S9iLeica MicrosystemsLED2500Microscópio Dissecador
IsqueiroIsqueiros BicQualquer tipo de ferramenta de esterilização usada para esterilizar o picareta antes e depois de colher cada verme
MATLABMathWorksRosenstein Algorithm-Routine no fórum MATLAB criado por Merve Kizilkaya
Ágar de Crescimento NematoideCarolina173520Garrafa de Mídia Preparada, 135 mL
FotodiodoThorlabsDET36ADetector polarizado de Si de 350-1100 nm
Picoscope5204Tecnologia PicoPP376Osciloscópio de PC www.picotech.com
Palheta PlatinumUsado para capturar C. elegans; É uma pequena palheta feita à mão com uma peça de vidro portátil e uma pá de platina.
Cuvette de quartzoCélulas de Starna21/G/5Preenchido com água destilada, coloca C. elegans dentro

Referências

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