É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar

1.5K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos protocolos de imagem de cálcio para um neurônio olfatório larval de Drosophila , usando um adesivo tecidual tópico para imobilização. Este método aumenta a estabilidade, facilitando experimentos in vivo e ex-vivo confiáveis. Os scripts R personalizados analisam os sinais de cálcio, fornecendo uma plataforma eficiente para pesquisas neurofisiológicas detalhadas.

Resumo

A imagem de cálcio é crucial para estudar a dinâmica neural e a função cerebral. No entanto, os métodos atuais para imagens de cálcio em larvas de Drosophila são desafiadores devido a artefatos de movimento e necessidades de equipamentos especializados. Aqui, apresentamos um método prático e de baixo custo para realizar imagens de cálcio in vivo e ex vivo em larvas de Drosophila de terceiro ínstar, usando um adesivo tecidual tópico para imobilizar amostras. Também fornecemos scripts R personalizados e uma estrutura para análise de dados, facilitando as medições das alterações de cálcio em diferentes condições experimentais. Usando essa abordagem, registramos com sucesso transientes de cálcio em um par de neurônios larvais do SNC com artefatos de movimento mínimos, demonstrando reprodutibilidade entre as preparações. O método é compatível com sistemas confocais de disco giratório padrão e pode ser adaptado para configurações de dois fótons DIY ou comerciais, tornando-o acessível a laboratórios com diferentes recursos. Essa abordagem pode aumentar a acessibilidade a estudos de imagem de cálcio larval e pode ser adaptada para examinar os efeitos de estímulos externos, como odores, e estímulos internos, como neuromoduladores.

Introdução

Compreender a dinâmica do cálcio nos neurônios é crucial para desvendar os mecanismos complexos subjacentes à sinalização neural e à função cerebral, pois os íons de cálcio desempenham um papel fundamental na modulação da atividade neuronal e na condução das respostas celulares aos estímulos. A dinâmica neuronal do cálcio pode ser monitorada por meio de imagens de cálcio, que fornecem informações em tempo real sobre a sinalização mediada por cálcio em uma ampla gama de organismos, incluindo a larva de Drosophila. A larva de Drosophila está emergindo como um poderoso sistema modelo para estudar o comportamento subjacente da função do circuito. É um dos três únicos organismos para os quais um conectoma cerebral de resolução sináptica completa foi gerado1. A larva é passível de uma variedade de ferramentas sofisticadas que permitem a imagem e a manipulação de neurônios nos níveis de cérebro inteiro e neurônio único 2,3.

A capacidade de medir a dinâmica do cálcio em neurônios larvais de Drosophila por meio de imagens de cálcio tem sido crucial para o avanço da pesquisa em neurociência4. Avanços recentes na imagem de cálcio permitiram medir a dinâmica do cálcio no nível de sinapses únicas na larva5 a registros multineuronais em larvas de movimento livre6. A imagem de cálcio pode ser realizada in vivo, onde os eventos de cálcio são capturados em contextos fisiológicos naturais de toda a larva 4,7,8,9, ou ex vivo, onde os eventos de cálcio são registrados em tecidos larvais dissecados preservados em condições fisiológicas simuladas10. No geral, os pesquisadores usaram várias iterações do método de imagem de cálcio em larvas de Drosophila para descobrir mecanismos fundamentais de circuitos neurais, sensações, aprendizado e memória e comportamento 8,11,12,13,14,15,16,17 . No entanto, os estudos de imagem de cálcio larval são limitados devido à necessidade de equipamentos especializados e problemas na interpretação dos dados devido a artefatos de movimento.

Aqui, apresentamos uma metodologia econômica e facilmente implementável para imagens de cálcio in vivo e ex vivo em larvas de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar. Visualizamos a dinâmica do cálcio em Keystone-LN, um neurônio do circuito olfativo inibitório18,19, dentro de preparações larvais inteiras para mostrar imagens de cálcio in vivo e em cérebros de larvas dissecadas para mostrar imagens de cálcio ex vivo. Larvas inteiras e cérebros dissecados permanecem viáveis e responsivos por aproximadamente 10-15 minutos em nossas condições de imagem, permitindo a aquisição de vários testes de estímulo por amostra. Para enfrentar o desafio de imobilizar larvas inteiras ou amostras de tecido, mantendo a viabilidade do tecido e reduzindo a variabilidade experimental, otimizamos o uso do GLUture, um adesivo tecidual tópico de cianoacrilato biocompatível.

Em comparação com os métodos tradicionais de imobilização larval, como incorporação ou fixação de agarose, essa abordagem baseada em adesivo reduz os artefatos de movimento, preservando a viabilidade do tecido 20,21; Em relação aos sistemas de imagem de dois fótons, a configuração do disco giratório reduz os custos de instrumentação e melhora a acessibilidade para laboratórios com recursos limitados. Por fim, descrevemos abordagens de imagem diretas, juntamente com scripts R desenvolvidos sob medida para análises de dados. Nossa abordagem pode aumentar a acessibilidade a estudos de imagem de cálcio larval e pode ser adaptada para examinar os efeitos de estímulos externos, como odores, e estímulos internos, como neuromoduladores.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Preparando larvas de Drosophila de terceiro ínstar para imagens de cálcio

  1. Manter as moscas em alimentos padrão para moscas (ver Tabela de Materiais) a 25 °C, com 50-60% de umidade relativa (UR) e um ciclo claro/escuro de 12 h.
  2. Para expressar a Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) para identificação de neurônios e GCaMP6f (indicador de cálcio) no(s) neurônio(s) de interesse ('X'), cruze fêmeas virgens da linhagem X-Gal4 com machos portadores de UAS-GCaMP6f e UAS-tdTomato22.
    NOTA: Para este estudo, a linha Keystone-Gal4 foi usada para conduzir a expressão de tdTomato e GCaMP6f em um único par de neurônios locais inibitórios (Keystone-LNs) no cérebro larval18,19.
  3. Depois de permitir que moscas machos e fêmeas acasalem e ponham ovos por 48 h, transfira os adultos para um frasco fresco.
  4. Extraia as larvas de terceiro ínstar (aproximadamente 120 h após a postura dos ovos) flutuando-as em uma solução de sacarose a 15%. Use uma micropipeta P1000 para transferir as larvas flutuantes para um copo de vidro de 1.000 mL.
  5. Lave as larvas 3-4x, substituindo a água do copo por 800 mL de água fresca destilada de cada vez. Deixe as larvas descansarem por 10 minutos antes de prosseguir com o restante do protocolo.

2. Protocolo de fome para larvas de Drosophila de terceiro ínstar (se testar condições de fome vs. não famintas)

  1. Prepare duas câmaras de alimentação colocando um pequeno quadrado de lenço de laboratório em placas de Petri de 6 cm. Para condições sem fome, adicione 350 μL de solução de sacarose 0,2 M; para condições de fome, adicione 350 μL de água destilada.
  2. Transfira um número igual de larvas lavadas para cada câmara de alimentação. Deixe as larvas se alimentarem de sacarose (sem fome) ou água destilada (sem fome) por 2 h em temperatura ambiente.

3. Imagem de cálcio in vivo

NOTA: Todos os experimentos envolvendo o adesivo tecidual devem ser conduzidos usando práticas padrão de segurança de laboratório. É necessário equipamento de proteção individual (EPI), incluindo luvas de nitrilo, jaleco e óculos de segurança ou protetor facial; Luvas de algodão devem ser evitadas devido a reações exotérmicas com cianoacrilato. Evite o contato do adesivo com a pele, olhos ou membranas mucosas. Em caso de colagem da pele, mergulhe a área em água morna com sabão e separe suavemente; Em caso de exposição ocular, enxágue com água morna por ≥5 min e procure atendimento médico imediato. O adesivo deve ser mantido longe de chamas abertas e altas temperaturas, pois o adesivo curado pode liberar vapores irritantes se queimado. Armazene o adesivo a ≤30 °C, longe da umidade e da luz solar direta, em um recipiente hermeticamente fechado quando não estiver em uso.

  1. Prepare o tampão de imagem de cálcio com a seguinte composição: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glicose 10 mM e HEPES 10 mM. Conservar a 4 °C quando não estiver a ser utilizado.
    NOTA: A solução salina modificada contendo 110 mM de NaCl é uma formulação amplamente aceita para dissecção e imagem larval do SNC e se enquadra na faixa típica usada em estudos de eletrofisiologia e imagem (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.
  2. Em uma lamínula de microscópio de 24 x 50 mm (1,5 mm de espessura), crie um poço usando vaselina dispensada de uma seringa.
  3. Coloque uma pequena gota de adesivo tecidual tópico (60% 2-octil e 40% n-butilcianoacrilato) no centro da lamínula. Espalhe o adesivo uniformemente em uma camada fina e uniforme usando uma haste de vidro.
  4. Transfira cuidadosamente uma única larva para o adesivo usando um pincel ou arame fino. Pressione suavemente o lado ventral da larva sobre o adesivo. Deixe o adesivo secar, garantindo que a larva esteja totalmente imobilizada.
  5. Uma vez que a larva esteja imobilizada, coloque a lamínula no microscópio invertido (Figura 1A).

4. Imagem de cálcio ex-vivo

  1. Prepare o tampão de dissecção larval com a seguinte composição: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glicose 10 mM e HEPES 10 mM. Conservar a 4 °C quando não estiver a ser utilizado.
  2. Dissecar as dissecações cerebrais conforme descrito por Ishimoto e Sano10. Resumidamente, usando uma escova ou fio fino, transfira uma única larva para uma placa de Petri de 3,5 cm com elastômero de silicone em camadas na parte inferior.
  3. Sob um microscópio de dissecação, posicione a larva com o lado ventral voltado para cima e localize o cérebro. Usando uma tesoura de dissecação, faça um corte de cerca de um terço da extremidade anterior da larva. Faça outro corte nos ganchos da boca. Preserve o cérebro enquanto remove os ganchos do corpo e da boca (adaptado de Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identifique o aglomerado de nervos contendo neurônios motores do cordão ventral. Usando uma pinça, afaste suavemente o cérebro do resto da larva dissecada. Apare qualquer excesso de tecido do cérebro.
    NOTA: Manuseie suavemente a força excessiva pode causar danos aos tecidos, pois o cérebro é frágil.
  5. Prepare uma lamínula de microscópio com o adesivo tecidual para imagens de cálcio, conforme descrito nas etapas 3.2 a 3.3.
  6. Usando uma micropipeta P10, aspire cuidadosamente o cérebro dissecado com 5 μL de solução de dissecção da placa de Petri. Expulse lentamente o cérebro para o adesivo. Antes que o adesivo seque, oriente o cérebro em uma posição dorsal para cima (com os dois lobos cerebrais voltados para baixo e o cordão ventral dorsal voltado para cima).
  7. Usando uma micropipeta P200, transfira 100 μL do tampão de imagem de cálcio sobre o cérebro larval imobilizado na lamínula.
  8. Coloque a lamínula com o cérebro no microscópio invertido, conectada a um módulo de scanner confocal de disco giratório e uma câmera CCD para imagens de cálcio (Figura 1B).
    NOTA: Para preparações ex-vivo, certifique-se de orientar o cérebro corretamente enquanto a cola ainda estiver molhada. Para obter a melhor qualidade de imagem, posicione o cérebro de forma que a ROI fique mais próxima da objetiva do microscópio e evite aplicar excesso de cola perto da ROI.

5. Protocolo de imagem

  1. Abra o software para imagens de cálcio usando o microscópio confocal. Capture imagens usando uma objetiva de 10x/1,4 NA com filtro alternando entre laser GFP (excitação 488 nm, intensidade 70%, emissão 525 nm/50 m, OD8) e laser RFP (excitação 561 nm, intensidade 50%, emissão 610 nm/75 m, OD8). Defina a exposição entre 100 ms e 1.000 ms, o ganho em 50% do valor de exposição correspondente e um fator de binning de 2 durante a captura de imagem.
  2. Ajuste o microscópio para uma ampliação de 10x e localize o cérebro sob iluminação de campo claro.
  3. Identifique o neurônio de interesse procurando o sinal tdTomato com o laser RFP (excitação definida para 561 nm).
    NOTA: Selecione saturação e reduza gama para definir o valor de exposição correto.
  4. Assim que a região de interesse (ROI) for identificada, mude para o laser GFP (excitação definida para 488 nm) para capturar sinais GCaMP6f. Certifique-se de que os sinais tdTomato e GCaMP colocalizem antes de capturar imagens de pilha de ambos os canais.
    NOTA: Ajuste as configurações de imagem para gravações de pilha tdTomato e GCaMP6f para maximizar a fluorescência.
  5. Capture duas gravações de séries temporais separadas de sinais tdTomato e GCaMP6f simultaneamente a uma taxa de 0,5 quadros/s (para um total de 2 min).
    NOTA: O cérebro larval dissecado permanece viável por aproximadamente 10 min sob essas condições de buffer; Após esse período, os sinais se degradarão.
  6. Quando a amostra estiver pronta para a imagem, capture duas gravações de séries temporais separadas de sinais tdTomato e GCaMP6f simultaneamente a uma taxa de 0,5 quadros/s (para um total de 2 min).
    NOTA: O cérebro larval dissecado permanece viável por aproximadamente 10 min sob essas condições de buffer; Após esse período, os sinais se degradarão.
    NOTA: Ao realizar análises quantitativas, recomendamos aumentar a potência do laser e ajustar o ganho de exposição do detector conforme necessário, mantendo a escala de intensidade linear.

6. Tratamento e análise dos dados

  1. Abra e importe as pilhas de sinais tdTomato e GCaMP6f para o ImageJ (NIH)28.
  2. Para identificar a região de interesse (ROI) correta, mescle os sinais tdTomato e GCaMP6f para confirmar a colocalização. Após a verificação, divida os canais tdTomato e GCaMP6f.
  3. No menu superior, selecione Plug-ins | Novo e clique em Macros para iniciar uma nova macro. Em seguida, importe as macros personalizadas baseadas em ROI para o ImageJ. Selecione a pilha GCaMP6f e clique em Executar para análise de cálcio.
  4. Processe os sinais de fluorescência usando uma macro ImageJ personalizada (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). A macro primeiro gera projeções de intensidade máxima, executa a correção de movimento usando o plug-in StackReg (modo de registro rígido )29 e aplica a correção de branqueamento.
  5. Um pop-up "Ação necessária" aparecerá solicitando a seleção manual do ROI, que permite aos usuários desenhar manualmente um ROI amplo. Clique em OK para continuar a análise. Para realizar a correção de movimento, certifique-se de que a caixa retangular cubra toda a ROI em todos os quadros para uma correção de movimento precisa, mantendo a forma espacial e de ROI local entre os quadros.
    NOTA: As gravações foram registradas no ImageJ usando o StackReg. Quando o movimento no plano era grande (deslocamento XY cumulativo > 1 μM) ou o desvio Z axial levava à perda de foco, o registro se tornava não confiável ou a amostra era totalmente perdida da janela de imagem. Assim, as amostras que mostraram deriva extrema ou sinais de cálcio em declínio (>30%) foram automaticamente marcadas e excluídas da análise a jusante para garantir medições precisas da atividade neuronal. Esses limiares são consistentes com as práticas de controle de qualidade comumente aplicadas em estudos de imagem de cálcio 30,31,32,33. A exclusão também garantiu que apenas registros estáveis com transientes de cálcio ligados a estímulos confiáveis fossem usados para análises.
  6. Para a análise, extrair traços de fluorescência de ROIs circulares definidas manualmente, guiadas por autocorrelação de pixels; esses ROIs abrangerão todo o campo de neurônios trapezoidais.
    1. Extraia os dados brutos de intensidade de fluorescência para dois fluoróforos: GCaMP6f/GFP e tdTomato/RFP, usando macros personalizadas no ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte a Tabela de materiais).
    2. Aplique uma janela deslizante com um ROI de 20 x 20 pixels e um tamanho de etapa de 10 pixels no campo de visão. Para cada ROI, a macro calculará: (1) a intensidade em todos os quadros, (2) a diferença de flutuação da linha de base (ou seja, a diferença entre os valores de intensidade máxima e mínima durante os primeiros 10 quadros) e (3) a mudança máxima de intensidade quadro a quadro (ΔF). As ROIs que mostram flutuações de intensidade inferiores a 10 unidades serão eliminadas e apenas os valores de ΔF mais nítidos serão selecionados para análise posterior.
    3. Normalize os traços de fluorescência usando os seguintes métodos:
      1. Normalização Fmax e Fmin: Calcule o Δ normalizado usando a fórmula:
        figure-protocol-1
        Onde F é a fluorescência bruta em cada ponto de tempo, Fmin é a fluorescência mínima (linha de base) e Fmax é a fluorescência máxima durante a gravação.
      2. Normalização ΔF/F 0: Além disso, executea normalização ΔF/F o, onde Fo (linha de base) é determinado pelos primeiros 10 quadros de cada gravação, usando a fórmula:
        figure-protocol-2
        Onde Ft é a fluorescência no tempo t e F0 é o valor da linha de base calculado a partir dos primeiros 10 quadros.
  7. Depois de extrair os sinais GCaMP6f, clique com o botão esquerdo e selecione tudo, recorte e cole para transferir todos os valores para uma nova planilha do Excel. Na barra de menu superior, selecione Dados | Texto para colunas. Um pop-up do assistente "Texto para coluna" aparecerá. Na etapa 1, selecione Delimitado e clique em Avançar. Na etapa 2, em Delimitadores, selecione Tabulação e vírgula e clique em Avançar. Na etapa 3, selecione Concluir.
    OPCIONAL: Para plotar os sinais de cálcio normalizados, realce Fnorm_FminFmax e selecione Gráfico de dispersão.
  8. Procure um arquivo .csv gerado contendo: (1) valores brutos de fluorescência F, (2) ΔF/Fo e (3) Fnorm (intensidade de fluorescência normalizada). Organize o conjunto de dados final em quatro colunas: (1) tempo (quadros), (2) condição da amostra (faminto ou alimentado), (3) ID de replicação (amostra individual) e (4) intensidade normalizada (valores Fnorm dimensionados de 0 a 1).
  9. Por fim, execute a análise e a visualização de dados em R usando scripts R personalizados (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte Tabela de materiais).
    1. Importe o script R personalizado para um novo projeto R. Verifique se os pacotes R necessários, incluindo ggplot2, dplyr e readr, estão instalados e atualizados antes de executar a análise.
    2. A partir da linha 1 do script R personalizado, pressione Executar continuamente para realizar a análise de cálcio. Certifique-se também de que a saída inclua mapas de calor que ilustram a intensidade de cálcio normalizada para os primeiros 30 quadros, 60 quadros e todos os quadros da gravação de série temporal e boxplots para mostrar a mediana das intensidades normalizadas.
    3. Avalie a significância da intensidade de cálcio normalizada usando o teste U de Mann-Whitney.

7. Eliminação e descontaminação de resíduos

  1. Após os experimentos, remova os detritos grosseiros das ferramentas e superfícies em água corrente e desinfete com etanol a 70% ou alvejante a 10% seguido de água estéril. Trabalhe em uma superfície desinfetada e lave as mãos após a remoção da luva; Não coma ou beba no laboratório.
  2. Coloque o tecido larval e os descartáveis contaminados em sacos de risco biológico e autoclave antes do descarte.
  3. Descarte os resíduos adesivos totalmente curados no lixo geral; O adesivo não curado e os descartáveis contaminados devem ser coletados em um recipiente de resíduos químicos perigosos lacrado e rotulado.
  4. Coloque todos os objetos cortantes (lâminas, agulhas, vidros quebrados) em um recipiente resistente a perfurações.
  5. Recolha solventes inflamáveis (etanol, acetona) em recipientes de resíduos inflamáveis rotulados.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Para demonstrar nossa abordagem de imagem de cálcio larval, nós a aplicamos com sucesso a preparações in vivo e ex-vivo das larvas de Drosophila (Figura 2 e Figura 3, Vídeo 1, Vídeo 2, Vídeo 3 e Vídeo 4). Medimos a dinâmica do cálcio em larvas de Drosophila de terceiro ínstar expressando GCaMP6f e Td-Tomato em um único par de Keystone-LNs no cérebro larval18,...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, descrevemos uma abordagem para imagens de cálcio in vivo e ex-vivo em larvas de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar. Imageamos a dinâmica do cálcio em Keystone-LN, um neurônio local inibitório na larva de Drosophila . Medimos a dinâmica do cálcio Keystone-LN em preparações larvais inteiras (in vivo) e em preparações dissecadas do cérebro larval (ex vivo) (Figura 1).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos ao Dr. Jeffrey Harper, que disponibilizou o microscópio confocal de disco giratório de seu laboratório para esses experimentos. Somos gratos pelo presente da linha de mosca: w; UAS-GCaMP6f/CyO, chorar; UAS-tdTomato do Dr. Jung Hwan Kim. Este trabalho foi apoiado por fundos da National Science Foundation sob os números de premiação 2341202 e 2129234. A Figura 1 foi criada usando Biorender.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Estoques e Ações de Mosca Manutenção
Ração para moscas nutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoPresente do Dr. JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Protocolo de Reagentes para Fome
Placa de Petri de 6 cmGenesee Scientific32-106G
SacaroseMillipore SigmaS0389-500G
Reagentes para tampão de Imagem e Dissecação
Cloreto de cálcioJ.T. Baker, Ciências Avantor.JT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-glicoseThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil]-ácido etanossulfônicoJ.T. Baker, Ciências Avantor.JT4018-1CAS: 4018-01, 100g
Cloreto de magnésioVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
Cloreto de potássioThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
Cloreto de sódioEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Ferramentas e Reagentes para Dissecação
Amortecedor de DissecaçãoComposição fornecida no texto
Placas de Petri Olympus, 60 x 15mm ventiladasGenesee Scientific32-105
Sylgard 184 Elastomer BaseCiências da Microscopia Eletrônica24236-10A
Agente de Cura Base de Elastomer Sylgard 184Ciências da Microscopia Eletrônica24236-10B
Pinça Estilo 5, EMSCiências da Microscopia Eletrônica78320-5
Tesoura de mola Vannas - Corte de 3mmFerramentas Científicas Finas15000-00
Equipamentos/Reagentes de Imagem e Montagem
Módulo de Scanner ConfocalYokogawaCSU-W1Conectado ao microscópio
Buffer de ImagemComposição fornecida no texto
Microscópio InvertidoLeica MicrosystemsDMi8 Conectada a um módulo de scanner confocal de disco giratório e a uma câmera CCD
Vidro de Cobertura de Microscópio, 24mm x 50mm, # 1,5 EspessuraGlobe Scientific Inc.1415-15
Adesivo Tópico MWI Veterinary GLUTUREFisher ScientificNC0632797
Vaselina PuraWalgreens912556
Links para Recursos Públicos Disponíveis
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Vídeo do protocolo Janelia Flylighthttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Referências

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Larva de DrosophilaImagem In VivoImagem Ex VivoConfocal de Disco GiratórioCorreção de MovimentoFluorescência GCaMP6fImobilização de TecidoAnálise de ROI
Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.