Desenvolvimento de Linhagens Celulares Resistentes a Medicamentos para Procedimentos Experimentais

Resumo

As linhagens celulares resistentes a medicamentos permitem a compreensão dos mecanismos de resistência ao tratamento e a avaliação não clínica de novos compostos, medicamentos reaproveitados e terapias combinadas. Este artigo apresenta um protocolo para a criação de linhagens celulares resistentes, expondo linhagens celulares parentais a aumentos graduais na concentração do medicamento alvo.

Resumo

O desenvolvimento de linhagens celulares resistentes a medicamentos é essencial para entender os mecanismos de resistência a medicamentos e identificar estratégias para superar o fracasso do tratamento na terapia do câncer. Os modelos de resistência permitem a avaliação pré-clínica de novos compostos, medicamentos reaproveitados e terapias combinadas. Para gerar células resistentes, as linhagens de células cancerígenas parentais são repetidamente expostas a concentrações crescentes do medicamento alvo ao longo de várias semanas. As células que sobrevivem e proliferam em cada estágio são selecionadas, expandidas e expostas a doses mais altas de drogas. O desenvolvimento de resistência é confirmado pela quantificação e comparação dos valores de concentração inibitória semimáxima (IC₅₀) entre células parentais e resistentes usando ensaios de viabilidade celular e análise de regressão não linear. Valores significativamente aumentados de IC₅₀ indicam adaptação bem-sucedida à pressão do medicamento e ao desenvolvimento de resistência. Essas linhagens celulares resistentes a medicamentos estão disponíveis para análises abrangentes, como microarray e sequenciamento de célula única, bem como vários experimentos in vitro ou in vivo . Esses modelos fornecem ferramentas valiosas para investigar possíveis estratégias terapêuticas para superar a resistência aos medicamentos.

Introdução

A quimioterapia é a opção de tratamento mais frequentemente usada para cânceres locais não passíveis de cirurgia ou radioterapia ou cânceres metastáticos. Medicamentos molecularmente direcionados e quimioterapia são usados como tratamentos de primeira linha para muitas malignidades, e sua eficácia é amplamente reconhecida. Alguns cânceres apresentam resistência a certos medicamentos desde o início do tratamento, tornando o tratamento ineficaz. No entanto, em casos mais comuns, o tratamento inicialmente eficaz torna-se ineficaz devido ao desenvolvimento de resistência aos medicamentos, levando à progressão do câncer.

A resistência aos medicamentos é causada por mutações genéticas ou resposta epigenética em células cancerígenas que induzem a expressão de produtos gênicos que escapam dos medicamentos ou auxiliam no crescimento celular ^1,2. Além disso, em muitos casos, essa resistência evolui para multirresistência, onde a célula cancerosa se torna resistente a múltiplas drogas ^3,4. Portanto, identificar os mecanismos de resistência aos medicamentos e desenvolver estratégias para superá-la são de extrema importância para o avanço do tratamento do câncer.

Linhagens celulares resistentes a medicamentos são modelos frequentemente usados para estudar os mecanismos de resistência terapêutica e desempenham um papel importante em experimentos in vitro e in vivo ⁵. Esses modelos são ferramentas essenciais para obter uma compreensão mais profunda das vias de ação dos medicamentos, identificar biomarcadores que influenciam a eficácia terapêutica e encontrar estratégias terapêuticas para inibir a formação de resistência aos medicamentos. O processo básico de criação de uma linhagem celular resistente a medicamentos é induzir resistência expondo uma linhagem celular a níveis crescentes do medicamento alvo ^3,6.

A concentração utilizada e a duração da exposição ao medicamento são componentes críticos desse processo. Em cada nível de concentração, o subconjunto de células que sobrevivem é amplificado e depois exposto à próxima concentração de droga de forma repetitiva. Em última análise, é derivada uma linhagem celular resistente a medicamentos que tem uma concentração inibitória aumentada pela metade máxima (IC₅₀) para o medicamento em comparação com a linhagem celular parental. Este relatório detalha o procedimento para gerar uma linha celular resistente ao paclitaxel (DU145-TxR) a partir da linha celular de câncer de próstata humano DU145, empregando um método passo a passo com exposições intermitentes a drogas.

Protocolo

1. Ensaios de cultura celular e viabilidade celular

NOTA: O paclitaxel é um medicamento anticancerígeno e citotóxico. Ao manuseá-lo, use um avental, óculos de proteção e luvas e trabalhe dentro de um armário de segurança para evitar a inalação no corpo. O DMSO não é altamente citotóxico, mas quando entra em contato com a pele ou membranas mucosas, a permeabilidade dos medicamentos dissolvidos aumenta, portanto, use um avental, óculos e luvas ao manuseá-lo.

1. Cultivar células DU-145 em uma placa de cultura de células de 10 cm usando meio completo (RPMI-1640 + 1% de penicilina-estreptomicina [pen-strep] + 10% de soro fetal bovino [FBS]) em uma incubadora a 37 ° C a 5% de CO₂ até 80% confluente.
2. Aspire o meio de cultura, lave com DPBS, adicione tripsina a 0,05% e deixe na incubadora por 5 min.
3. Depois de bater e confirmar por microscopia que as células estão separadas da placa e flutuando, adicione 1 mL de meio completo para interromper a ação da tripsina.
4. Conte o número de células e semeie-as a uma densidade de 1,0 × 10⁴/99 μL por poço em meio completo em cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante 2 h para permitir que as células adiram ao fundo da placa. As células devem ser plaqueadas em triplicado ou quadruplicado para cada grupo de teste.
5. Ajuste o paclitaxel e o DMSO a serem adicionados a cada poço. Certifique-se de que a quantidade de DMSO adicionada a cada poço seja a mesma e que a concentração final de DMSO não seja superior a 1%.
   1. Para fazer isso e seguindo nosso protocolo, comece com 10 mM de paclitaxel em DMSO e adicione 87,2 μL de DMSO a 12,8 μL desse medicamento em um tubo para obter 100 μL de paclitaxel a 1.280 μM.
   2. Transfira 50 μL desta solução para outro tubo e dilua-o até a metade da concentração com 50 μL de DMSO (640 μM).
   3. Repita este procedimento para realizar diluição em série e preparar soluções de paclitaxel nas concentrações de 0 (somente DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 e 1.280 μM.
      NOTA: O paclitaxel diluído com DMSO deve ser armazenado congelado para reutilização em experimentos subsequentes (para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento, armazene em alíquotas).
6. Diluir 1 μL da solução de paclitaxel preparada anteriormente com 9 μL de meio completo em um tubo separado e adicionar 1 μL a cada poço 2 h após a semeadura das células. As concentrações de paclitaxel em cada poço serão de 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 e 1.280 nM, com cada poço contendo 100 μL de meio.
   NOTA: Ao definir a concentração de medicamentos usados em ensaios de viabilidade celular, verifique os valores de IC₅₀ publicados em artigos anteriores e certifique-se de que a concentração esteja dentro da faixa³. A concentração de DMSO em cada poço foi de 0,1% (menos de 1% é desejável).
7. Incubar durante 48 h. Adicione 10 μL de reagente de proliferação celular WST-1 a cada poço (100 μL de meio de cultura) e incube por mais 0,5 a 4,0 h.
   NOTA: O tempo ideal de incubação depende da linhagem celular e da densidade celular. Neste estudo, cultivamos células por aproximadamente 1,5 h. Se o tempo de incubação for muito curto ou muito longo, a absorbância de cada poço será muito baixa ou muito alta na próxima etapa. Como resultado, não será possível confirmar a diferença na viabilidade celular. Assim, para o teste inicial, deve-se testar vários tempos de incubação para confirmar o tempo de incubação apropriado.
8. Meça a absorbância do WST-1 usando um leitor de microplacas.
   NOTA: A absorbância alvo é de 450 nm (recomenda-se 420-480 nm) e a absorbância de fundo é de 650 nm (recomenda-se 600 nm ou superior).

2. Cálculo da viabilidade celular e valor da concentração inibitória semimáxima (IC₅₀)

1. Calcule a viabilidade celular a partir da absorbância. A absorbância é (A450nm-A650nm).
   Viabilidade celular (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
   Como: absorbância da amostra (células tratadas com medicamentos)
   Ab: absorbância em branco (apenas meio, sem células)
   Ac: controle de absorbância (células não tratadas com medicamentos)
2. Resuma a viabilidade celular calculada na seção anterior em um software de planilha.
3. Calcular e registar o IC₅₀ para as células parentais por análise de regressão não linear.
   NOTA: O modelo logístico de quatro parâmetros (4PL) geralmente é um método de cálculo adequado. Ferramentas de cálculo IC₅₀ online estão disponíveis⁷. No entanto, o modelo 4PL não deve ser usado quando a eficácia do composto estiver fora da faixa de concentração e os dados não puderem representar totalmente as assíntotas inferior e superior da curva sigmóide.
   1. Para evitar esse aumento, meça a viabilidade celular no maior número possível de pontos de concentração. Se uma curva sigmóide não puder ser obtida, use um modo de dois ou três parâmetros com valores mínimos e máximos fixos⁷.
   2. Se não estiver usando software de cálculo ou software estatístico, incluindo os disponíveis na web, use a seguinte fórmula:
      IC₅₀=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      R: O valor mais baixo entre as concentrações do medicamento medidas com uma viabilidade celular de ≤50%
      B: O valor mais alto entre as concentrações de drogas medidas com uma viabilidade celular de >50%
      C: Viabilidade celular em B
      D: Viabilidade celular em A
      NOTA: Esta fórmula pressupõe que o gráfico entre os dois pontos que intercalam o valor IC₅₀ é uma linha reta.

3. Exposição a drogas

NOTA: Uma visão geral dos procedimentos descritos nesta seção é mostrada na Figura 1.

1. Semear células parentais em placas de cultura de células (2,0 × 10⁶ células/placa para placas de 100 mm).
2. Adicione paclitaxel a uma concentração inibitória da viabilidade celular de ~ 10-20% (IC_10-20, ~ 0,5 nM neste caso) ao meio e cultive em uma incubadora por 2 dias.
3. Substitua por meio sem paclitaxel e incube por vários dias.
4. Uma vez que as células tenham crescido e se tornado 80% confluentes, passe-as para uma nova placa de cultura de células. Criopreserve as células restantes.
5. Adicione paclitaxel às células passadas a uma concentração de ~ 1,5-2,0 vezes a concentração inicial (0,75-1 nM). Incubar em incubadora por 2 dias.
6. Substitua por meio sem paclitaxel e incube por vários dias.
7. Se as células crescerem de forma semelhante, repita as etapas 3.4-3.6, aumentando a concentração de exposição ao paclitaxel passo a passo.
   NOTA: O aumento na concentração do medicamento (1,5-2,0 vezes) pode ser definido livremente pelo experimentador, e o experimento deve ser repetido nessa concentração. Recomendamos congelar e armazenar as células cada vez que a concentração do medicamento for aumentada. Se a concentração de paclitaxel continuar a aumentar ainda mais, a proliferação celular pode não se recuperar e as células podem morrer. Nesses casos, descongele as células que proliferaram na concentração antes da morte, reduza o aumento do paclitaxel para 1,1-1,5 vezes (recomenda-se 1,2 vezes) e repita a cultura.
8. Aumente gradualmente a resistência da linhagem celular ao medicamento e, em seguida, calcule e registre o IC₅₀ usando WST-1 e software conforme descrito na Seção 2.
   NOTA: Se for observado um aumento no IC₅₀ de pelo menos 3-5 vezes, pode-se determinar que a cepa é uma linhagem celular resistente a medicamentos.

4. Manutenção da resistência aos medicamentos

1. Para manter o fenótipo resistente da linhagem celular resistente a medicamentos, incubar com uma concentração de IC_10-20.
   NOTA: Recomenda-se que o IC₅₀ em um ensaio de sobrevivência celular seja medido periodicamente, pois a resistência aos medicamentos pode mudar.

Resultados

Usando este método, anteriormente passamos 9 meses estabelecendo com sucesso células DU145 resistentes ao paclitaxel (DU145-TxR). Os resultados do ensaio de viabilidade celular mostraram que o valor de IC₅₀ do paclitaxel para a linhagem parental DU145 foi de 1,1 nM, enquanto o valor de IC₅₀ para DU145-TxR foi 149,6x maior que o da linhagem parental (IC₅₀: 164,6 nM) (Tabela 1 e Figura 2). Este resultado indica que o DU145-TxR adquiriu uma resi...

Discussão

O desenvolvimento de linhagens de células cancerígenas resistentes a medicamentos é um método estabelecido para investigar a toxicidade de drogas e mecanismos de resistência, mas o primeiro desafio que os pesquisadores enfrentam é selecionar um modelo apropriado para expressar resistência. Um método comum para criar linhagens celulares resistentes a medicamentos in vitro é expor a linhagem celular ao medicamento alvo, mas é necessário considerar como definir a concentração de exposição (...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054
10 mL Pipeta sorológica descartável	Fisher scientific	13-678-11E
prato de 100 mm	Corning	353003
tubo cônico de 15 mL	Frascos criogênicos	Corning 352097
2,0 mL Placa
	Corning	353072
Cell Counting Chamber slide	Invitrogen	C10228
Reagente de Proliferação Celular WST-1	Sigma	5015944001
Centrifuge 5702 R	eppendorf
incontáveis II	Invitrogen		Contador de células
Dimetilsulfóxido	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	Linha celular de câncer de próstata
EVOS FLc	Thermo Fisher Microscópio		Digital Científico Invertido
FBS	Gibco	A5670701
Paclitaxel	Selleck	S1150
Penicilina– estreptomicina	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek		Microplate Reader
Trypan Blue solution 0,4%	Invitrogen	15250061

de cultura de células de 96 poços Corning 431386