Obtendo da coleta de dados tomográficos de alta qualidade usando o microscópio eletrônico de transmissão de 200 kV com sistema de lentes condensadoras duplas

Summary

A tomografia eletrônica permite a obtenção de imagens em nível próximo ao nível atômico de organelas, células e macromoléculas dentro de tecidos em amostras crio-biológicas. Alcançar tal resolução requer condições de imagem estritamente controladas. Aqui, usando um microscópio eletrônico de transmissão de 200 kV com um sistema de lentes condensadoras de dois estágios como exemplo, descrevemos como realizar a coleta de dados de tomografia eletrônica de alta qualidade.

Abstract

A criotomografia eletrônica (crio-ET) surgiu como uma técnica poderosa para elucidar as estruturas de organelas celulares e grandes complexos proteicos em seus ambientes nativos. Diferentemente da microscopia eletrônica convencional à temperatura ambiente, a crio-ET minimiza danos induzidos por radiação e preparação às estruturas internas. Além disso, ao contrário da análise de partícula única (SPA), a crio-ET reduz a necessidade de purificação repetitiva, preservando assim a informação estrutural mais autêntica das amostras. Para alcançar imagens de alta resolução, o crio-ET também impõe exigências rigorosas sobre as condições de imagem do TEM. Apesar da melhoria contínua na eficiência da aquisição de dados crio-ET e do surgimento de inúmeras plataformas de software, a maioria das soluções é proprietária, específica para cada fornecedor e fortemente acoplada a certos modelos de microscópio eletrônico, levando a altos custos de implementação. Neste estudo, instalamos o software de código aberto SerialEM em um microscópio eletrônico de 200 kV (criogénico Glacios 2) com sistema de lentes condensadoras duplas e realizamos calibrações abrangentes para permitir a aquisição de dados tomográficos de alta qualidade. Usando apoferritina como amostra modelo, descrevemos todo o fluxo de trabalho — desde a preparação da crio-amostra até a coleta automatizada de dados crio-ET, seguida pela reconstrução por tomografia e análise sub-tomográfica. Esse método oferece uma solução econômica e acessível para coleta de dados crio-ET, especialmente para laboratórios que utilizam microscópios Glacios sem acesso a software proprietário.

Introduction

A criotomografia eletrônica (crio-ET) surgiu como uma técnica poderosa para estudar as estruturas nativas de complexos macromoleculares e organelos celulares in situ. Uma grande vantagem do crio-ET em relação à análise de partícula única (SPA) é sua capacidade de evitar etapas excessivas de purificação, preservando assim o estado nativo das biomoléculas-alvo em seu contexto biológico. Atualmente, um amplo espectro de especes — incluindo organelas^{purificadas 1,2,3,4}, folhas de membrana celular, complexos macromoleculares⁵, vírus 6, lamelas^{celulares 7} e seções^{de tecido 8,9,10} – pode ser investigado por crio-ET. Dada a diversidade de tipos de amostras e objetivos experimentais, as estratégias de coleta de dados variam substancialmente e devem ser cuidadosamente adaptadas tanto à amostra quanto à configuração específica do instrumento.

A coleta de dados é uma etapa crítica no fluxo de trabalho crio-ET, pois tanto a qualidade dos dados quanto a eficiência da aquisição impactam diretamente o processamento a jusante e o sucesso experimental geral do experimento. Para atender às demandas experimentais em evolução, várias plataformas de coleta de dados foram desenvolvidas. Entre os mais amplamente utilizados estão a Tomografia comercial e o software de código aberto SerialEM^{11, 12 e 13}. A Tomography oferece uma interface altamente integrada e amigável, com curva de aprendizado baixa, mas é menos flexível e requer licença comercial. Em contraste, o SerialEM é um pacote gratuito e de código aberto, que suporta tanto fluxos de trabalho baseados em interface gráfica (GUI) quanto baseados em scripts, oferecendo maior flexibilidade e extensibilidade.

A coleta de dados tomográficos a partir de crio-lamelas apresenta desafios únicos. Lamelas de alta qualidade são difíceis de preparar, e sua instabilidade mecânica e alta sensibilidade à irradiação de elétrons complicam ainda mais a coleta de dados. Para enfrentar esses desafios, Fabian Eisenstein desenvolveu o fluxo de trabalho^{PACEtomo 14}, uma melhoria do SerialEM que introduz o deslocamento da imagem do feixe para adquirir múltiplos tomogramas por série de inclinação, reduzindo assim a frequência dos ajustes de foco e acompanhamento. Essa estratégia maximiza a quantidade de dados utilizáveis de cada seção, minimizando a exposição desnecessária a elétrons. Funcionalidades semelhantes também estão disponíveis no software comercial Tomography5.

Em contraste, a coleta de dados de organelos criofixados ou folhas de membrana geralmente é mais simples, pois essas amostras são tipicamente preparadas em grades de carbono com buracos, oferecendo ampla área para foco e^{rastreamento 15,16}. Nesses casos, os fluxos de trabalho de aquisição criogénica de ET integrados pela SerialEM — acessíveis diretamente via sua interface gráfica — oferecem uma opção conveniente e sem scripting, especialmente adequada para iniciantes ou laboratórios menores. No entanto, do ponto de vista da eficiência, ainda recomendamos estratégias baseadas em deslocamento de imagem de feixe sempre que possível.

Dado o alto custo dos microscópios crioeletrônicos, otimizar estratégias de coleta de dados para maximizar a utilização dos instrumentos é essencial. Um TEM de 200 kV equipado com um sistema de lentes condensadoras de dois estágios oferece uma penetração de elétrons ligeiramente menor para amostras espessas do que um instrumento de 300 kV, mas permanece totalmente viável para crio-ET quando devidamente calibrado. No entanto, sua faixa relativamente estreita de condições de feixe paralelo e tamanho fixo de pontos entre ampliações o tornam geralmente menos adequado para crio-ET de alta resolução, a menos que o sistema esteja precisamente otimizado.

Nosso sistema de microscopia eletrônica é equipado com uma câmera Falcon 4i de detecção direta de elétrons, que oferece vantagens substanciais em capacidade de contagem de elétrones únicos e imagem contínua em alta velocidade. Para explorar plenamente o desempenho desse detector, o TEM deve ser operado sob condições de imagem bem otimizadas. Para TEMs que empregam um sistema de condensador de dois estágios, a calibração precisa das condições de iluminação para luz paralela é um fator importante para melhorar a qualidade da imagem^17,18. Em sistemas modernos de condensador de dois estágios, o ponto focal da lente condensadora de segundo estágio deve coincidir com o plano focal frontal da lente objetiva superior para garantir que o caminho óptico que intersecta com o plano da amostra seja paralelo. Condições de luz paralelas estabelecidas com precisão são cruciais para garantir que os valores de subfoco e a ampliação permaneçam consistentes em posições locais nas imagens coletadas.

Neste estudo, focamos em estabelecer um fluxo de trabalho crio-ET de alta qualidade usando apoferritina como amostra. Como o sistema de microscópio eletrônico de transmissão de 200 kV não é licenciado para o software comercial de tomografia, instalamos e calibramos a plataforma SerialEM de código aberto. Ao otimizar cuidadosamente os parâmetros do feixe paralelo para o sistema de lentes condensadoras de dois estágios do microscópio, alcançamos a coleta automática de dados tomográficos através da interface gráfica SerialEM — sem a necessidade de scripts Python ou configurações complexas. Essa abordagem oferece uma solução amigável e econômica para aquisição eficiente de dados crio-ET em instrumentos de 200 kV, como o Glacios.

Protocol

1. Preparação e carregamento de amostras criogênicas

1. Para preparar o Vitrobot, ligue-o e ajuste a temperatura para 10 °C. Ajuste a umidade para 100%. Troque o papel de filtro.
2. Coloque uma grade de carbono R1.2/1.3 com furos quantifoil de 300 malhas R1.2/1.3 no sistema de descarga glow. Ajuste as condições de descarga de brilho para 15 mA por 60 s com pressão de vácuo de 0,39 mBar, carga negativa. Realize a descarga de brilho para hidrofilizar a superfície da grade.
3. Defina os parâmetros do Vitrobot da seguinte forma: Tempo de drenagem: 3 s, Tempo de espera: 0 s, Força de Drenagem: 2, Temperatura: 8 °C, Umidade: 90%.
4. Prepare o etano líquido em um copo de etano embrulhado em nitrogênio líquido, resfriando com nitrogênio líquido.
5. Aplique 3 μL de amostra de apoferritina na grade de descarga glow. Imediatamente vitrifice a amostra em etano líquido
6. Transfira a amostra do etano para uma caixa de armazenamento pré-resfriada em nitrogênio líquido. A preparação da crio-amostra já está concluída.
   ATENÇÃO: Os seguintes protocolos de segurança devem ser rigorosamente seguidos ao manusear nitrogênio e etano líquidos: Equipamentos de proteção individual (por exemplo, luvas criogênicas e óculos de segurança) são necessários para prevenir congelamento durante as operações; Antes da condensação do etano, certifique-se de que o copo receptor esteja livre de nitrogênio líquido para evitar respingos causados por fervura rápida; Após o uso, feche firmemente as válvulas principais e reguladoras de pressão do sistema de gás etano para evitar vazamentos; O etano residual e o nitrogênio líquido devem ser descartados em equipamentos de ventilação designados dentro da sala de preparação após a preparação da amostra.

2. Determinar as condições de luz paralela para microscopia eletrônica

1. Antes de realizar o alinhamento paralelo do feixe, ajuste primeiro os seguintes parâmetros do telescópio: estágio na altura eucêntrica, lente objetiva no foco, inclinação do feixe nP ppX/ppY, ponto de pivô livre de coma X/Y, coma e estigma.
2. Usando uma grade de rede transversal, confirme que a amostra está em altura eucêntrica e foco adequado com ampliação de SA 73.000× (sem filtro de energia) no modo nano-sonda.
3. Mude para o modo de difração (comprimento da câmera: D750 mm) e insira a abertura objetiva de 100 μm (Figuras 1A, 1B).
4. Clique na aba Ajustar para a abertura do objetivo e use os botões multifunções X e Y para deslocar a abertura do objetivo para deslocar o centro do objetivo, de modo que a borda da abertura sobreponha os anéis de difração dourada e oclua parcialmente o ponto central (Figura 1C).
5. Traga o plano focal traseiro da lente objetiva para a vista ajustando o foco de difração usando o botão de foco até que a borda da abertura do objetivo fique o mais nítida possível (Figura 1D).
6. Ajuste a intensidade do feixe (força C2) até que a largura dos anéis de difração de ouro seja minimizada.
7. Centralize a abertura do objetivo. Aumente o comprimento da câmera de difração até que apenas o ponto central fique visível (Figura 1E).
8. Clique na aba de Difração no painel do Stigmator e use os botões multifunções X e Y para ajustar o formato do ponto central enquanto se alterna acima e abaixo do ponto de cruzamento para tornar o feixe circular (Figura 1F).
9. Ajuste a intensidade do feixe até que o ponto central seja minimizado. Isso estabelecerá condições de iluminação paralelas. Como as condições de iluminação paralela podem variar com diferentes tamanhos de pontos, documente as configurações correspondentes de C2 para cada tamanho de ponto comumente usado para facilitar a configuração rápida em experimentos futuros.
   NOTA: O tamanho específico do ponto usado durante a aquisição de dados depende da ampliação e da configuração da abertura C2; Precisamos garantir que a imagem seja realizada na taxa de dose ideal para a câmera.

3. Coleta de dados de alta qualidade por tomografia eletrônica para amostras de apoferritina

NOTA: Esta seção descreve um procedimento padronizado para aquisição de dados tomográficos de alta produtividade, adequado tanto para usuários experientes quanto para novos pesquisadores.

1. Para clipar a grade e carregar a amostra criogênica preparada no microscópio eletrônico, coloque o anel O na ferramenta de alinhamento, com a grade preparada colocada no centro do anel O. Use a caneta mola para prender o anel C no anel de vedação, fixando a amostra entre eles.
2. Insira a Autograde verticalmente na ranhura da cassete, transfira-a para o nanocup através da estação de trabalho e depois a carregue no microscópio eletrônico.
3. Para capturar uma montagem completa de toda a grade usando o SerialEM, lance o software SerialEM. Ative o modo Baixa Dose. Defina o modo Busca com ampliação de 115×.
   NOTA: A ampliação de busca é normalmente usada para adquirir mapas de grandes áreas. Essa ampliação é ajustada ao mínimo possível para acelerar o processo de mapeamento, garantindo ainda a precisão da costura da imagem.
4. Abra o arquivo do Navegador. Vá para o Navigator > Montagens & Grids > configure montagem completa. Na caixa de diálogo, defina Usar Modo de Busca; Salve as imagens no formato bin4. Clique em Start em Controles de Montagem.
5. Para calibrar os campos de busca e visualização, no modo Busca, localize um ponto de referência altamente reconhecível (Figura 2A). Clique em adicionar marcador no navegador. Clique em Ir para Marcador para mover até o local do marcador.
6. Mude para o modo Visualização (2600×) e localize o mesmo ponto de referência. Clique no ponto de referência. Vá até o Navegador, clique em Shift para Marcador para alinhar os campos (Figura 2B). Seguindo os prompts na caixa de diálogo, os deslocamentos de feixe de ambas as ampliações são atribuídos a todos os marcadores no mapa de busca, e os valores de deslocamento são salvos (Figura 2C).
   NOTA: A ampliação de vista geralmente é ajustada para a menor ampliação da Área Selecionada (SA) para garantir que tanto a visualização quanto o Registro estejam no mesmo modo, facilitando o processo de centralização durante a troca de ampliação.
7. Para calibrar os campos de visualização e registro (Figura 3). No modo View, localize um ponto de referência altamente reconhecível. Mude para o modo Gravar (120k×). Use o mouse para centralizar o ponto de referência no modo Gravar.
   NOTA: A configuração da ampliação de registro depende da resolução estimada do alvo (onde a resolução do alvo é o dobro do tamanho do pixel) e do tamanho da amostra.
8. Volte para o modo Visualização e tire uma foto. Arraste o objeto-alvo sob a ampliação de visão até a mira que representa o centro do campo de visão usando o botão direito do mouse.
9. Clique em Definir ao lado de Shift na seção Desfocar para alinhar os campos.
10. Para selecionar o quadrado alvo e capturar um mapa de ampliação média, 5.1 na montagem completa, clique em Adicionar Polígono para delinear a área a ser capturada. Após delinear uma área, clique em Parar de Adicionar para finalizar a seleção.
11. Repita o passo 3.10 para todas as áreas desejadas. Para cada polígono no Navegador, marque as opções Adquirir (A) e Novo Arquivo em Item.
12. Na caixa de diálogo que aparece após marcar Novo Arquivo em Item, selecione o seguinte: Imagens montadas; Ajustar montagem ao polígono; Feche o arquivo quando o próximo novo arquivo for aberto. Clique em OK.
13. Na nova caixa de diálogo, selecione o seguinte: Mover estágio em vez de mudar a imagem; Use os parâmetros de Visualização no modo Baixa Dose. Salve a imagem no local especificado.
14. Para capturar o mapa de ampliação média, no menu Navegador, clique em Adquirir em Itens. Verifique as seguintes opções: Adquirir e salvar imagem ou montagem; Faça o mapa do Navigator.
15. Na seção Ação Primária Relacionada, marque o modo Usar Visualização para capturar imagens. Na seção Tarefas antes ou depois do Primário, verifique Eucentricidade Aproximada. Clique em IR para começar a capturar o mapa de média ampliação.
16. Para selecionar pontos no mapa de ampliação média. Abra o mapa de ampliação média na interface do Navegador. Clique em Adicionar Ponto e clique com o botão esquerdo nos Objetos-Alvo no mapa.
17. Repita para todos os pontos desejados. Após selecionar todos os pontos, clique em Impedir Adicionar para finalizar a seleção.
18. Para alinhamento da abertura, use alinhamentos diretos na interface do microscópio para ajustar a inclinação do feixe nP ppX/ppY e o ponto de pivô sem coma X/Y, minimizando o balanço do ponto do feixe no campo de visão.
19. Execute o escopo de sintonia usando um script da biblioteca de scripts SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Para iniciar a coleta de dados de tomografia, na interface do Navegador, localize o ROI e verifique a Série de Inclinação. Na caixa de diálogo, selecione Imagens de Frames; Escolha o local de armazenamento de dados.
21. No diálogo de configurações, defina uma faixa de graus de -50° a 50°. Defina o incremento base para 2,5°, o ângulo inicial para 0° e ative o esquema dose-simétrico.
    NOTA: As configurações para a dose por inclinação, faixa de ângulo de inclinação e passo de inclinação geralmente seguem os princípios descritos abaixo: A dose total é mantida em aproximadamente 100 e⁻/Ų. A faixa de inclinação é selecionada para garantir que, mesmo no ângulo de inclinação mais alto, a amostra permaneça em grande parte desobstruída e permita transmissão e imagem de elétrons suficientes. Se a faixa de inclinação for relativamente grande (por exemplo, além de ±60°), o passo de inclinação pode ser ajustado para 3°. Para uma faixa de inclinação menor (por exemplo, cerca de ±50°), o passo de inclinação pode ser reduzido para 2,5° ou 2° para garantir que a dose total permaneça em torno de 100 e⁻/Ų. Isso é particularmente importante para microscópios de 200 kV, onde o dano por radiação é mais pronunciado em comparação com os de 300 kV, tornando essencial evitar doses totais excessivas.
22. Na seção Intensidade do Feixe ou Controle de Exposição, verifique Manter a intensidade do feixe. Defina o alvo de desfoco para -3 μm e ajuste a frequência de autofoco para uma vez por inclinação.
23. Marque Pare se o Autoalinhamento deslocar mais de 60% do tamanho da imagem, defina Rastrear Antes e Depois.
24. Para iniciar a coleta de dados, no Navegador, clique em Adquirir em Itens. Na ação principal, verifique o alvo de desfocar ciclo no autofoco, espera por deriva e TS.
25. Ajuste a faixa de desfoco de -3,5 a -4,5 μm, em 4 passos. Em Geral, ative Fechar válvulas de coluna na extremidade. Na seção Tarefas antes ou depois do Primário, ative o Realinhamento para o item e o Fine Eucentricity antes do Primário.

4. Média subtomogramática da apoferritina

1. Realize correção de movimento e estimativa CTF usando Warp¹⁹. Realize o alinhamento tomográfico em série de inclinação usando AreTomo3²⁰.
2. Execute reconstrução tomográfica e deconvolução usando Warp. Realize a seleção de partículas baseada em template usando o PyTom²¹.
3. Realize o refinamento inicial usando RELION^{5 22}. Realize refinamento de alta resolução usando M²³.
4. Determine a estrutura final processando oito séries de inclinação, seguida pela seleção de 5.939 partículas e refinamento iterativo, alcançando uma resolução final de 2,8 Å (Figura 4).

Results

Após o alinhamento preciso do feixe paralelo, realizamos a coleta de dados tomográficos para apoferritina usando a função de interface gráfica do SerialEM. O processamento subsequente com Warp, AreTomo, PyTom, RELION e outros softwares relevantes resultou em uma estrutura final com resolução de 2,8 Å. Essa resolução demonstra suficientemente a alta qualidade dos nossos dados, atingindo um nível atualmente alcançável por meio de subtomogramas em resolução relativamente alta. Como mostrado na Figura 4, os resultados alinhados e reconstruídos (Figura 4A) demonstram claramente a arquitetura geral e a distribuição espacial da apoferritina. A média por subtomograma foi realizada em partículas extraídas de oito séries de inclinação alinhadas e reconstruídas, resultando em uma estrutura com resolução de 2,8 Å (Figura 4B). A correlação de casca de Fourier (FSC) correspondente é apresentada na Figura 4C.

Figura 1: Determinação da condição de iluminação paralela usando o segundo sistema de lentes condensadoras. (A) Padrão de difração no modo de difração sem abertura. (B) Padrão de difração após a inserção de uma abertura objetiva de 100 μm. (C) Deslocamento da abertura em relação ao centro de difração para visualizar melhor a nitidez das bordas. (D) Borda de abertura focada e anéis de difração otimizados ajustando as correntes da objetiva e da lente C2. (E) Ponto central de difração elíptico que requer correção via o painel Stigmator. (F) Ponto central de difração circular e minimizado, indicando iluminação paralela otimizada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Processo de alinhamento de ampliação alta para baixa da Busca (115×) até a Visualização (2600×). (A) Imagem do modo de busca com o marcador (seta vermelha) posicionado na borda do buraco. (B) Imagem do modo visualização com o marcador (seta vermelha) posicionado na mesma localização do objeto que em (A). A opção Shift para Marcador é clicada no navegador. (C) Na janela pop-up, os deslocamentos do feixe de ambas as ampliações são atribuídos a todos os marcadores no mapa de Busca, e os valores de deslocamento são salvos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Processo de alinhamento de ampliação alta para baixa do View (2600×) ao Record (120k×). (A) No modo Registro, o objeto alvo está posicionado no centro do campo de visão (círculo vermelho tracejado destaca o objeto-alvo). (B) Imagem capturada no modo Visualização, onde o objeto alvo não se alinha com a mira vermelha (círculo tracejado vermelho destaca o objeto alvo e a mira vermelha). (C) O objeto alvo é arrastado para o centro da mira vermelha clicando com o botão direito e movendo-a, seguida de pressionar o botão Set localizado ao lado do botão Shift (a caixa tracejada vermelha destaca o botão). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Determinação estrutural da apoferritina. (A) Imagem estrutural. Mapa de resolução local da média final do subtomograma. A textura parece uniforme, com características nanoscale organizadas e repetitivas em todo o campo de visão. (B) Mapeamento quantitativo espacialmente resolvido. Um mapa circular de cor falsa da mesma ou de uma região nanoestruturada relacionada. As cores variam de azul/verde a amarelo/vermelho, correspondendo aos valores numéricos mostrados na escala de cores abaixo (aproximadamente 2,5 a 3,5 em unidades arbitrárias). A distribuição heterogênea de cores indica variação espacial em uma propriedade medida (por exemplo, altura, espessura, índice de refração ou resposta mecânica/óptica) ao longo da amostra. (C) Caracterização espectral ou funcional global. Curva de correlação de conchas de Fourier (FSC) usada para estimativa de resolução. A resolução final de 2,8 Å é indicada pela linha tracejada em FSC = 0,143. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

Os procedimentos para preparação de amostras criogénicas e coleta de dados por tomografia eletrônica devem ser adaptados ao tipo específico de amostra. A estratégia experimental descrita aqui é bem adequada para macromoléculas biológicas, complexos proteicos e pequenos organelos. Esses espetáculos podem ser vitrificados diretamente em grades eletromagnéticas, e sua espessura relativamente pequena garante uma transmissão eficiente de elétrons e a aquisição de imagens de alto contraste. Idealmente, a espessura da amostra não deve exceder 200 nm.

Para amostras congeladas por mergulho, geralmente se prefere uma dimensão lateral inferior a 10 μm para minimizar a formação de gelo cristalino, que pode comprometer a integridade estrutural. Para amostras maiores, congelamento em alta pressão ou a inclusão de crioprotetores, como glicerol, no tampão podem atrasar a nucleação^{do gelo 23}. No entanto, para satisfazer os requisitos de espessura do TEM, frequentemente é necessário um afinamento adicional. Entre as abordagens de afinamento disponíveis, a fresagem por feixe de íons focados^{(FIB) 24}é a mais amplamente adotada devido à sua precisão e dano mínimo, produzindo lamelas adequadas para crio-ET de alta resolução.

Durante a coleta de dados das lamelas, é fundamental maximizar a utilização das lamelas. A implementação da aquisição por deslocamento de imagem de feixe pode reduzir a necessidade de etapas repetitivas de foco e acompanhamento, aumentando assim o débito de coleta de dados. Embora não seja descrita em detalhes aqui, essa técnica foi amplamente descrita na metodologia PACEtomo.

Atualmente, opções populares de software para coleta de dados tomográficos incluem Tomografia (Thermo Fisher Scientific) e SerialEM. Tomography é uma solução comercial com flexibilidade limitada para personalização, enquanto o SerialEM, desenvolvido por David Mastronarde na Universidade do Colorado em Boulder, é um software de código aberto que suporta automação baseada em scripts. No entanto, explorar plenamente as capacidades do SerialEM exige uma curva de aprendizado substancial. Neste estudo, apresentamos um fluxo de trabalho simplificado que aproveita a interface gráfica da SerialEM, eliminando a necessidade de scripts ou configurações baseadas em Python, ao mesmo tempo em que possibilita a aquisição de dados não supervisionada durante a noite.

Um desafio frequente encontrado durante a aquisição de dados tomográficos com esse método é o rastreamento impreciso, que pode levar a séries de inclinação incompletas com ângulos ausentes ou complicar o alinhamento subsequente. Para mitigar esses problemas, os parâmetros de rastreamento devem ser otimizados com base no contraste da amostra e na estabilidade do estágio de inclinação. Estratégias eficazes incluem ajustar o tempo de exposição nas posições de rastreamento para garantir a clareza da imagem, separar fisicamente as posições de rastreamento e foco para reduzir danos acumulados por radiação, e reduzir a ampliação de rastreamento quando a estabilidade do estágio é ruim, para facilitar a correspondência confiável de padrões. Coletivamente, esses ajustes são essenciais para alcançar um desempenho robusto de acompanhamento em diversas condições experimentais. Neste trabalho, usamos apoferritina como espécime modelo. Sob o pretexto de testar e corrigir a luz paralela, utilizamos as funções embutidas do SerialEM para coletar dados de alta qualidade para crio-ET e realizar cálculos subtomográficos nas amostras de ferritina, obtendo finalmente a estrutura final em 2,8 Å.

Esse método foi desenvolvido para ampliar a aplicabilidade dos microscópios eletrônicos de 200 kV para crio-ET de alta resolução. Alcançar tal resolução depende fundamentalmente da obtenção de dados de imagem de alta qualidade, o que, por sua vez, exige condições de iluminação precisas. Para isso, realizamos um alinhamento paralelo preciso da iluminação como um passo preparatório crítico. O procedimento de alinhamento descrito aqui é especificamente projetado para TEMs equipados com um sistema de lentes de dois condensadores, como o Thermo Fisher Scientific Talos Arctic e Glacios. Ao contrário dos instrumentos com uma terceira lente condensadora (C3), esses sistemas restringem a condição de iluminação paralela a um único valor específico de excitação da lente C2. Essa restrição inerente exige um alinhamento excepcionalmente preciso do feixe de elétrons para posicionar a imagem fonte no plano focal frontal da lente objetiva superior — um pré-requisito para o desempenho ótimo de imagem. Nossos resultados subsequentes de processamento de dados demonstram que, após esse alinhamento, a qualidade de aquisição de dados alcançada com este microscópio de 200 kV para as amostras testadas é quase comparável à esperada de um instrumento de 300 kV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grade niti ANTCryoTM	Najingdingxin	M04240922A	Usado para preparação de amostras criogénicas
apoferritina	Biortus	BP17854-00A	Usado para preparação de amostras criogénicas
Grade de grade transversal	Agar Scientific	AGS106	Usado para determinar as condições de luz paralela
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	Usado para coleta de dados tomo
Papel de filtro número 2, 55 mm	Whatman	10311807	Papel mascarante
PELCO eeasyGLOW	TED PELLA	91000-01020	Usado para descarga por brilho
Grade Quantifoil	quantifoil	N1-C14nCu30-01	Usado para preparação de amostras criogénicas
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher	230101164	Usado para preparação de amostras criogénicas